魏　麗　劉萌萌　屈彩霞

鄭州市第三人民院病理科，河南鄭州450000

TGF-β1與α-SMA在小鼠肺纖維化模型中的表達及其相互關系

魏麗劉萌萌屈彩霞

鄭州市第三人民院病理科，河南鄭州450000

目的探討轉化生長因子β1（TGF-β1）與α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）在小鼠肺纖維化模型中的表達，及其之間的相互關系。方法氣管內灌注博萊霉素（7 mg/kg）制備肺纖維化模型，進行HE、Masson染色并采用免疫組織化學檢測小鼠肺纖維化組織中TGF-β1和α-SMA的表達。結果對照組中α-SMA表達于支氣管和大血管周圍的平滑肌細胞，模型組中α-SMA表達于支氣管、大血管周圍的平滑肌細胞及成纖維細胞灶，TGF-β1表達于支氣管、大血管周圍的成纖維細胞、炎細胞以及成纖維細胞灶，與α-SMA表達相似。TGF-β1和α-SMA均與小鼠肺纖維化程度均呈正相關（r=0.628、0.766，P＜0.01）。TGF-β1與α-SMA呈正相關（rs=0.728，P＜0.01）。結論TGF-β1和α-SMA在肺間質纖維形成過程起到重要作用，并可能協(xié)同參與。

博萊霉素；肺纖維化；TGF-β1；α-SMA；小鼠

［Abstract］Objective To discuss the expression of and relation between TGF-β1 and α-SMA in mice pulmonary fibrosis model.Methods The pulmonary fibrosis model was prepared by intratracheal instillation of bleomycin（7 mg/kg）. The expression of TGF-β1and α-SMA in mice pulmonary fibrosis tissues was detected by HE and Masson staining and immunohistochemistry.Results In the control group，α-SMA was expressed in smooth muscle cells of bronchi and around great vessels，while in the model group，α-SMA was expressed in smooth muscle cells，fibroblasts，and fibroblast foci of bronchi and around great vessels，and the expression of TGF-β1was similar to that of α-SMA in fibroblasts and fibroblast foci of bronchioli and around great vessels.Both TGF-β1and α-SMA had positive correlation with degree of pulmonary fibrosis in mice（r=0.766，and 0.628，respectively，P＜0.01）.There was also a positive relation between TGF-β1and α-SMA（rs=0.728，P＜0.01）.Conclusion TGF-β1and A-SMA play important roles and may cooperate in formation of pulmonary interstitial fibrosis.

［Key words］Bleomycin；Pulmonary fibrosis；TGF-β1；α-SMA；Mice

肺纖維化是多種病因引起急、慢性肺泡損傷導致細胞外基質過度合成、沉積的間質性肺疾病的共同結局［1］。但其確切發(fā)病機制仍不十分清楚，且缺乏特異而有效的治療手段［2，3］。肺纖維化中細胞外基質合成和沉積［4，5］，主要來源于肌成纖維細胞，是致纖維化的主要效應細胞，其是一個活化的成纖維細胞的亞型，表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和波形蛋白（vimentin），因此本文檢測α-SMA及轉化生長因子-β1（TGF-β1）在小鼠肺纖維化中的表達及其相互關系，探討兩者在肺纖維化過程中所起的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑

博萊霉素（BLM-A5），兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體，鼠抗鼠α-SMA單克隆抗體，即用型SP試劑盒。

1.2動物模型制備

健康清潔級雄性ICR小鼠56只，4～6周齡、體重23～27 g，在普通級實驗室條件下飼養(yǎng)小鼠，合適室溫、良好通風，自由取食、飲水。隨機分組：模型組和對照組各28只。模型組小鼠按照7 mg/kg氣管內灌注博萊霉素生理鹽水溶液，對照組氣管灌注等體積的生理鹽水。模型組和對照組在1、2、3和4周各隨機斷頸處死7只小鼠，剖開胸取出肺組織，放入10%中性福爾馬林進行常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。

1.3免疫組織化學染色

測定α-SMA和TGF-β1在纖維化的小鼠肺組織中的表達：按照免疫組化試劑盒的說明書進行實驗操作。主要步驟為切片逐步脫蠟至水，在室溫下，3%H2O2封閉切片組織的內源性過氧化物酶30 min；在室溫條件下，α-SMA和兔抗TGF-β1按照濃度1∶100孵育60 min；室溫下二抗即用型SP試劑盒（北京中杉公司）孵育20 min，經DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片，用PBS緩沖液代替一抗作為空白對照。

1.4免疫組織化學結果判定

按文獻［1］判定免疫反應性：在高倍鏡下觀察，無陽性細胞為陰性；0%＜陽性細胞占所有細胞的百分比≤10%為+；10%＜陽性細胞百分比≤50%為++；50%＜陽性細胞百分比≤100%為+++。結合染色強度綜合判定。

1.5肺纖維化程度的判定

依據(jù)Szapiel等方法、HE染色和Masson染色判定：①肺纖維化1級：病變范圍＜全肺20%，支氣管壁均增厚，肺泡間隔明顯增寬，少量成纖維細胞灶，病灶區(qū)膠原纖維沉積明顯；②纖維化2級：病變范圍占全肺20%～50%，與正常肺組織相比差別明顯，肺組織廣泛纖維化，肺泡腔變形、閉塞，成纖維細胞灶增多更明顯，肺間質膠原纖維大量沉積；③纖維化3級：病變范圍＞全肺50%，肺組織纖維化更重，肺泡壁明顯增厚、結構破壞，間質形成纖維化瘢痕、呈條狀、團狀分布的膠原纖維沉積廣泛，

1.6統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件進行Spearman秩相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1小鼠的肺組織病理特征

對照組小鼠肺組織均未見明顯改變。模型組支氣管灌注博萊霉素生理鹽水溶液后1周：肺泡間隔增寬，少量纖維細胞增生，支氣管周圍及肺泡間隔以淋巴細胞浸潤為主，部分小鼠肺間隔間質內有少量膠原沉積；灌注后2周：肺泡間隔增寬更加明顯，支氣管壁增厚，間質內可見多的成纖維細胞灶，肺胸膜增厚，胸膜下可見局灶性增生的成纖維細胞，膠原纖維沉積進一步明顯；灌注后3周：肺組織內廣泛纖維化，見變形、閉塞得肺泡腔，間質內成纖維細胞灶增多更明顯、大量沉積的膠原纖維（封三圖4、5）；灌注后4周：肺纖維化更加明顯，肺泡結構破壞，間質內纖維化瘢痕形成及大量呈條狀、團狀的膠原纖維分布。

2.2 TGF-β1與α-SMA在肺纖維化中的表達及相關性

對照組中，TGF-β1表達于正常支氣管周圍的纖維細胞。而模型組中，除支氣管和大血管周圍成纖維細胞、炎細胞外，還表達于成纖維細胞灶，且隨纖維化加重而陽性表達增強（表1）。大部分成纖維細胞灶既表達TGF-β1又表達α-SMA，并且在成纖維細胞灶中（封三圖4），TGF-β1的染色指數(shù)與肺纖維化程度呈正相關（rs=0.628，P＜0.01）。TGF-β1的染色指數(shù)也與α-SMA呈正相關（rs=0.728，P＜0.01）。

對照組中，α-SMA小鼠肺組織表達于支氣管和大血管周圍的平滑肌細胞，在支氣管黏膜上皮和肺泡上皮細胞無表達；模型組中，除表達于支氣管和大血管周圍的平滑肌細胞外，還表達于成纖維細胞灶，并隨肺纖維化加重而表達增強（表1，封三圖5），且α-SMA的染色指數(shù)與肺纖維化程度呈正相關（rs=0.766，P＜0.01）。

表1　TGF-β1和α-SMA染色指數(shù)在28只小鼠中的分布

3　討論

許多肺慢性疾病后期的共同結局是肺纖維化，其病理特征是早期肺炎、成纖維細胞的增生及活化、膠原進行性沉積和ECM的重塑［2］。并且其中成纖維細胞灶在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中起到至關重要作用。于是有效抑制成纖維細胞募集、成纖維細胞的持續(xù)性增殖分化及促使其凋亡可能為肺間質纖維化的治療提供新的治療途徑，也可成為肺間質纖維化的有效治療手段［6-8］。

博萊霉素所致的小鼠肺纖維化模型的病理學改變大致分為：炎癥反應、間質細胞增生及彌漫性纖維化。在模型組中，α-SMA除表達于支氣管和大血管周圍的平滑肌細胞外，還表達于成纖維細胞灶，并隨肺纖維化加重而表達增強，其染色指數(shù)與肺纖維化程度呈正相關，與文獻報道一致［9］。而在模型組中，TGF-β1除表達于支氣管和大血管周圍成纖維細胞外，還表達于成纖維細胞灶且隨纖維化加重而陽性表達增強。大部分成纖維細胞灶既表達TGF-β1又表達α-SMA，其染色指數(shù)與肺纖維化程度呈正相關，TGF-β1的染色指數(shù)也與α-SMA呈正相關，這也與文獻一致［8］。本研究進一步證實在肺間質纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1和α-SMA是關鍵致纖維化因子［10，11］，在成纖維細胞持續(xù)性分化增殖的過程中也起到了至關重要的作用，并可能二者協(xié)同參與肺纖維化的形成［3］。抑制TGF-β1和α-SMA的表達或阻斷其傳導通路將會為肺纖維化的治療提供新的治療方法和手段。

肺纖維化是多種細胞和細胞因子作用的復雜網絡，其中成纖維細胞/肌成纖維細胞的持續(xù)性活化、膠原纖維的代謝紊亂和細胞外基質的重塑是其病理特征。近來有研究證實在肺纖維化中成纖維細胞灶起到了至關重要作用，與肺功能異常患者的存活時間縮短有關。大量研究已經證實［7］α-SMA是活化的成纖維細胞的標記，胞漿中的α-SMA表達使其具有收縮性，其收縮特性與組織纖維化密切相關，在器官纖維化過程中起到至關重要的作用，在肺纖維化過程中也是關鍵的致纖維化因子，本研究也證實了這一點。

大量的研究證明TGF-β在肺纖維化的形成過程中起關鍵性的作用。其有三種類型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，以TGF-β1與肺纖維化的關系最密切。TGF-β也有三種受體：TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、TGF-βⅢ。研究證實外界刺激使TGF-β1與Ⅱ型膜受體親和力最高，其先與Ⅱ型膜受體結合，后與Ⅰ型膜受體結合，經胞內磷酸化作用，激活Ⅰ型、Ⅱ型受體的胞內功能區(qū)域的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，將信息傳遞給轉錄調控子-Smads，調控細胞轉錄，促進成纖維細胞分化增殖并抑制其凋亡、EMT和生長因子等釋放，從而抑制ECM的降解，導致肺纖維化。正常情況下，TGF-β1通過二硫鍵形成二聚體儲存在細胞內，且該二聚體以共價鍵結合到潛在相關肽（latency-associated protein，LAP），使TGF-β1以無活性形式存在。組織蛋白酶、纖維蛋白溶解酶、鈣蛋白酶、血小板反應素、整合蛋白αvβ6和基質金屬蛋白酶可以裂解LAP使TGF-β1變成活性狀態(tài)，從而使TGF-β1信號通路激活。有研究證實TGF-β1在成纖維細胞向肌成纖維細胞分化和增殖過程中其重要作用［12，13］。其他一些細胞因子，如結締組織生長因子（CTGF）、IL-4、IL-13、整合蛋白αvβ6、蛋白水解受體（PAR）、血小板生長因子（PDGF）及內皮素等雖具有各自的信號轉導途徑促進纖維化形成，但還可協(xié)同TGF-β1促進肌成纖維細胞分化增殖和ECM沉積，從而導致肺纖維化形成［4.5，14，15］。因此，抑制TGF-β1的信號傳導通路將成為抗纖維藥物治療的靶點。

總之，α-SMA和TGF-β1是肺纖維化過程的關鍵細胞因子，并可能協(xié)同參與肺纖維化的形成［3］，因此抑制TGF-β1和α-SMA的表達或阻斷其傳導通路將會為肺纖維化的治療提供新的治療方法和手段。

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Expression of and relation between TGF-β1and α-SMA in mice pulmonary fibrosis model

WEI LiLIU MengmengQU Caixia
Department of Pathology，Zhengzhou Third People's Hospital，Zhengzhou450000，China

R563.9

A

1673-9701（2016）22-0031-03

2016-06-15）