陳冠武　陳冬娥　蔡　穎　曾梅錦　蘇建暉　張崢嶸

（汕頭出入境檢驗檢疫局廣東汕頭515000）

水產(chǎn)品中沙門菌檢測實驗室間比對樣品制備的研究

陳冠武陳冬娥蔡穎曾梅錦蘇建暉張崢嶸

（汕頭出入境檢驗檢疫局廣東汕頭515000）

為了探索優(yōu)化水產(chǎn)品中沙門菌檢測實驗室間比對樣品制備方法，為科學(xué)實施實驗室比對提供依據(jù)。以凍蝦仁為樣品基質(zhì)，人工添加沙門菌和（或）某些生物性狀相近的干擾菌后作為實驗室間比對樣品，研究樣品基質(zhì)處理、染菌樣品中陽性菌株與干擾菌株的互相影響、陰陽性樣品染菌方案的比較、驗證3個關(guān)鍵步驟的技術(shù)要點。結(jié)果證明制作的凍蝦仁沙門菌比對樣品均勻性和穩(wěn)定性檢驗結(jié)果符合要求，應(yīng)用于實驗室間比對中能夠較好地反映參試實驗室的檢測水平。

沙門菌；實驗室間比對；樣品制備；水產(chǎn)品；干擾菌

1　前言

沙門菌廣泛分布于自然界，是人類和動物的重要致病菌［1］，在世界各地的食物中毒中，沙門菌食物中毒位居1、2位［2］，國內(nèi)外各類食品水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中均要求沙門菌不得檢出［3］。因此，沙門菌的檢測在食品安全檢測中具有重要的意義。實驗室間比對是指在預(yù)定條件下，對兩個或兩個以上實驗室就同一或相似的檢測對象進(jìn)行檢測或測量的組織、實施和評價［4］。實驗室間比對可用于多種目的，其中，最常見的目的為確定實驗室進(jìn)行某些特定檢測或者測量的能力，以及監(jiān)控實驗室的持續(xù)能力［5］。實驗室間比對的結(jié)果既可用于實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制評價，也可供監(jiān)管機(jī)構(gòu)了解和監(jiān)督實驗室的檢測水平和質(zhì)量控制情況［6］。

進(jìn)行水產(chǎn)品中沙門菌檢測實驗室間比對樣品制備時，應(yīng)盡量模擬實際樣品檢測中可能遇到的各種干擾因素，將檢測過程的重點、難點考慮進(jìn)去，同時應(yīng)保證樣品性狀、干擾因素的均勻性和穩(wěn)定性。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1實驗菌株

2.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株

甲型副傷寒沙門菌（salmonella paratyphi-A，簡稱甲沙，菌株編號CMCC50093）、鼠傷寒沙門菌（salmonella typhimurium，簡稱鼠沙，菌株編號CMCC50115）：購自中國微生物菌種保藏管理中心。

2.1.1.2干擾菌菌株

奇異變形桿菌（簡稱奇桿）、楊氏檸檬酸桿菌（簡稱楊桿）、遲鈍愛德華桿菌（簡稱愛桿）、粘質(zhì)沙雷菌（簡稱粘雷）、溫和氣單胞菌（簡稱溫單）、大腸桿菌（簡稱大桿）、產(chǎn)堿普羅威斯菌（簡稱普羅）：均來自本實驗室日常水產(chǎn)品檢驗分離并經(jīng)鑒定保留的菌種。

2.1.2主要儀器設(shè)備

SPX-250B-Z型等生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；HR40-II-B2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；CLASS II A/B3和NU-400-400E型生物安全柜：北京奧創(chuàng)興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MDF-382E超低溫冰箱：日本三洋株式會社；HV-85型自動高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；菌液濁度計：生物梅里埃中國有限公司。

2.1.3主要培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍（BS）、HE瓊脂（HE）、XLD瓊脂（XLD）、三糖鐵瓊脂（TSI）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、膽硫乳糖脂（DHL）、沙門菌生化檢測試劑盒：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；沙門菌顯色培養(yǎng)基（CAS）：法國科馬嘉；API20E生化試劑鑒定盒：法國梅里埃公司；沙門菌屬A-F多價O診斷血清（O血清）：寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

2.2方法

2.2.1比對樣品制備方法

樣品制備方法流程見圖1。

圖1　水產(chǎn)品中沙門菌檢測實驗室間比對樣品制備方法流程

2.2.2樣品基質(zhì)的選擇及處理

2.2.2.1樣品基質(zhì)的選擇

由于預(yù)報名的參試實驗室達(dá)30多家，按每個實驗室發(fā)送樣品2×30 g計，加上預(yù)試驗和均勻性、穩(wěn)定性實驗的消耗和其他損耗，初步估計至少約需5 kg樣品。同時，要求樣品基質(zhì)要在滅菌處理后能“吸入和包裹”所要加入的菌液，制備的樣品才可能均勻。根據(jù)以上兩點，結(jié)合本地和本實驗室實際情況，并經(jīng)過比較和選擇，最終選定單凍蝦仁作為本研究的制樣基質(zhì)。

2.2.2.2樣品基質(zhì)的處理

首先進(jìn)行無菌處理，將每份2000 g凍蝦仁樣品盛放于網(wǎng)格底容器室溫下解凍，經(jīng)121℃、30min高壓滅菌后，在無菌條件下60℃、30min烘干，結(jié)果制出干蝦仁約700 g。取經(jīng)無菌處理的干蝦仁按1：10加入BPW，經(jīng)37℃培養(yǎng)8 h，吸1.0mL涂布NA平板2塊，觀察菌落生長情況以評價滅菌效果。

2.2.2.3樣品吸水量測試

為了保證染菌過程菌液的完全吸收，需通過試驗確定干蝦仁的吸水能力。取70 g干蝦仁，加入適量無菌水，觀察其在室溫下30min內(nèi)能完全吸收的液體量。

2.2.3染菌樣品中陽性菌株與干擾菌株的互相影響

2.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株和干擾菌株篩選試驗

將9種實驗菌株經(jīng)復(fù)壯后，分別接到沙門菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)中使用到的HE、XLD、DHL、BSA、CAS平板上，經(jīng)過適當(dāng)時間培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)；同時將這些細(xì)菌進(jìn)行O血清凝集試驗，觀察凝集反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)符合相關(guān)檢驗標(biāo)準(zhǔn)《GB 4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門菌檢驗》《SN 0170-92出口食品沙門菌屬（包括亞利桑那菌）檢驗方法》中的描述，干擾菌應(yīng)為水產(chǎn)品或環(huán)境中的常見雜菌，且有某些性狀與沙門菌近似，在某些分離平板上能生長出易與沙門菌混淆的菌落或影響目標(biāo)菌菌落特征的表現(xiàn)，但可以根據(jù)生化特征和血清學(xué)鑒定明確區(qū)分其與沙門菌特征不符。

2.2.3.2染菌樣品中陽性菌株與干擾菌株的互相影響

為了使試驗結(jié)果更為清晰，方便分析，本研究將2種沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌液分別與7種干擾菌株的菌液以5∶1比例做一對一混合后，以約10-30CFU/g的濃度，按2.2.2.3樣品吸水量測試實驗結(jié)果將不高于樣品基質(zhì)最高吸水量的菌液加入干蝦仁樣品中，放置30min使菌液完全吸干。在4℃±2℃放置2 d、6 d、10 d、14 d、18 d后，分別進(jìn)行樣品的感觀檢查，觀察樣品的性狀、氣味等是否發(fā)生明顯變化；同時分別取樣，按照現(xiàn)行沙門菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗。要求染菌后至18 d，樣品性狀不能發(fā)生明顯變化；陽性樣品染菌用的干擾菌與沙門菌共存時，在增菌培養(yǎng)過程應(yīng)能保證兩者共存，不能出現(xiàn)任一種菌被完全抑制的情況，也不能影響沙門菌的菌落特征、生化特性和血清學(xué)性狀；陰性樣品染菌用的干擾菌既表現(xiàn)出與沙門菌相近的一些特性，但通過現(xiàn)有檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)的操作，能夠比較清楚、明確地互相區(qū)分出來。

2.2.4陰陽性樣品染菌方案的比較、驗證

根據(jù)2.2.3的試驗結(jié)果，經(jīng)分析后初步確定陰陽性樣品中不同菌株染菌樣品的組合和配比，并進(jìn)行實驗驗證。為了保證染菌樣品的穩(wěn)定性和均勻性，將按2.2.3實驗結(jié)果選出的陽性菌株和干擾菌株的菌液分別添加到不同的制樣基質(zhì)中，放置30min使菌液完全吸干。然后按事先確定的比例將不同菌株的染菌樣品充分混合一起，分別制成不同配方的陰陽性樣品。在4℃±2℃放置2 d、6 d、10 d、14 d、18 d后，分別進(jìn)行樣品的感觀檢查，觀察樣品的性狀、氣味等是否發(fā)生明顯變化；同時分別取樣，按照現(xiàn)行沙門菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗。

3　結(jié)果

3.1樣品基質(zhì)的選擇及處理

經(jīng)121℃、30min高壓滅菌后，制樣基質(zhì)無菌落生長。經(jīng)吸水量測試，70 g無菌干蝦仁樣品能吸干無菌水9-10mL。

3.2樣品染菌方法及對樣品性狀的影響

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株和干擾菌株篩選試驗結(jié)果

各菌株培養(yǎng)基生長試驗及血清凝集試驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)菌株符合現(xiàn)行檢驗標(biāo)準(zhǔn)的描述，干擾菌也都具有與沙門菌近似的某些性狀，但同時具有可以與沙門菌區(qū)分的明顯特征。9種菌株均可作為下一步混合和配比的候選菌。

表1　各菌株培養(yǎng)基生長試驗及血清凝集試驗結(jié)果

3.2.2陰/陽性樣品不同菌株染菌樣品組合和配比的比較、驗證結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，所有干擾菌中大腸桿菌與沙門菌的相似度雖不大，但共存時相互抑制作用不明顯，適合作為陽性樣品的干擾菌，為防止考核過程“串通”行為，作為陰性樣品中也需加入大腸桿菌作為干擾菌；愛桿、楊桿和溫單菌既表現(xiàn)出與沙門菌相近的一些特性而且在增菌過程不會相互抑制，組合后能使各種分離平板上都長有具近似沙門菌的菌落形態(tài)，需通過現(xiàn)有檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)的生化及血清學(xué)鑒定，才能夠比較清楚、明確地互相區(qū)分出來，適合作為陰性樣品干擾菌。粘雷和奇桿菌在幾天內(nèi)使蝦仁變質(zhì)（變紅色和發(fā)臭）；鼠沙在有粘雷菌的平板上產(chǎn)H2S出現(xiàn)變緩的無黑色中心的變化；普羅在TTB、SC增菌液中生長明顯劣于鼠沙，普羅在SC增菌液中生長明顯優(yōu)于甲沙并在HE、XLD平板上接近甲沙，甲沙在有普羅菌的平板上出現(xiàn)24 h產(chǎn)H2S黑色中心變化，這給挑可疑沙門菌增加很大難度，所以粘雷、奇桿和普羅菌均排除出組合。為此，初步確定陰、陽性樣品各2種染菌樣品組合方式（表2），組合樣品實驗驗證結(jié)果見表3。

表2　初步確定的4種染菌樣品組合和配比

表3　組合樣品實驗驗證結(jié)果

4　討論

（1）采用水產(chǎn)品實物制備，要求制備比對樣品的水產(chǎn)品基質(zhì)要在滅菌處理后能“吸入和包裹”所要加入的菌液，讓菌液滲入樣品內(nèi)部，而不是只附著于樣品表面，制備的樣品才可能均勻。本研究根據(jù)日常檢驗的經(jīng)驗和本實驗室的實際情況，選擇了單凍蝦仁作為制樣基質(zhì)?；|(zhì)處理方案是先經(jīng)121℃、30min高壓滅菌，然后經(jīng)60℃、30min烘干，使樣品達(dá)到半脫水狀態(tài)，才有利于在后面染菌步驟充分地吸收菌液。經(jīng)過組織實驗室間比對驗證，證明本研究選擇的樣品基質(zhì)和處理方式合適。

（2）標(biāo)準(zhǔn)菌株和干擾菌株篩選試驗結(jié)果表明，本研究選取的2株標(biāo)準(zhǔn)菌株（鼠沙、甲沙）符合相關(guān)檢驗標(biāo)準(zhǔn)中的描述，7株干擾菌（奇桿、粘雷、愛桿、楊桿、溫單、普羅、大桿）均有某些性狀與沙門菌近似，易造成混淆，但又具有可以與沙門菌區(qū)分的明顯特征。由于沙門菌屬包含的菌型數(shù)量多，因此現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定需要使用多種增菌液及多種分離平板，才能保證不會漏檢，而且保證能夠與非沙門菌區(qū)分開來。組織水產(chǎn)品中沙門菌檢測實驗室間比對的目的，就是要考察參試實驗室是否能夠掌握并熟練運(yùn)用檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。因此，樣品制備時，必須圍繞這個主要目的，首先至少要準(zhǔn)備兩種不同的沙門菌菌株，其次是使用的干擾菌有相當(dāng)?shù)拿曰笮裕荒艹鰴z驗校準(zhǔn)的檢測能力。本研究通過染菌樣品中陽性菌株與干擾菌株的互相影響的研究，制定了初步的染菌方案，并進(jìn)行了陰陽性樣品染菌方案的比較、驗證。結(jié)果表明，最后確定的陰性和陽性樣品各兩種染菌方案（楊氏檸檬酸桿菌+溫和氣單胞菌+大腸桿菌、遲鈍愛德華桿菌+溫和氣單胞菌+大腸桿菌的組合作為陰性樣品；1份鼠傷寒沙門菌染菌樣品+3份大腸桿菌染菌樣品、1份甲型副傷寒沙門菌染菌樣品+3份大腸桿菌染菌樣品組合作為陽性樣品），能夠較好地達(dá)到實驗室比對目的?？紤]到某些企業(yè)實驗室首次參加實驗室間比對檢測，所以考核難度不宜太高，每份樣品中要有一個陽性樣品，方便檢測過程中可做為陽性對照菌株。最終發(fā)給參試實驗室的測試樣品為：陽性樣品中隨機(jī)取1個，陰性樣品中取1個，共有4種可能的組合，每個樣品都是隨機(jī)編號。

（3）實驗室比對樣品檢測期限內(nèi)，本實驗室按一定間隔進(jìn)行了一系列穩(wěn)定性試驗，結(jié)果表明，樣品穩(wěn)定性符合實驗室間比對試驗要求。本次參試實驗室的樣品運(yùn)輸時間都在48 h內(nèi)，實驗室間比對自檢是從發(fā)樣后第2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d，由不同檢驗員進(jìn)行6次檢測，考核凍蝦仁共24份樣品。每次從留樣中按類隨機(jī)抽樣檢驗，檢驗結(jié)果：6次均從A類樣品中檢出楊桿、溫單、大桿；從B類樣品中檢出愛桿、溫單、大桿；從C類樣品中檢出鼠沙和大桿；從D類樣品檢出甲沙和大桿。與預(yù)期結(jié)果完全一致，說明制備的樣品符合實驗室間比對樣品要求。

（4）本次比對30家參試實驗室中有23家檢驗結(jié)果滿意，7家不滿意，滿意率為77%。經(jīng)核查7家不滿意實驗室的檢測原始記錄，發(fā)現(xiàn)其檢測質(zhì)量或技術(shù)存在較嚴(yán)重問題，歸納主要原因有：①生化結(jié)果正確，但未做血清學(xué)鑒定，憑菌落特征和生化結(jié)果做出錯誤判斷；②單個生化項目錯誤導(dǎo)致結(jié)果判斷錯誤，存在綜合分析能力不足和生化結(jié)果陰陽性判斷不熟悉；③沒有研讀標(biāo)準(zhǔn)，未按標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用多種增菌液和分離平板或僅挑一個可疑菌落進(jìn)行鑒定；④某些基礎(chǔ)操作技能不規(guī)范，如菌株沒有分純就進(jìn)行生化鑒定等。經(jīng)過向?qū)嶒炇野l(fā)出實驗室間比對結(jié)果分析報告，并進(jìn)行個別輔導(dǎo)，糾正了這些實驗室的錯誤做法，有效提高了其水產(chǎn)品中沙門菌檢測水平。結(jié)果說明，本次實驗室間比對由于樣品制備科學(xué)、穩(wěn)定，使比對試驗既有一定難度，又不至于造成無法檢測或結(jié)果不穩(wěn)定，可以考查出實驗室的真實水平。

5　結(jié)論

通過研究樣品基質(zhì)處理、染菌樣品中陽性菌株與干擾菌株的互相影響、陰陽性樣品染菌方案的比較、驗證3個關(guān)鍵步驟的技術(shù)要點，結(jié)果顯示，先于121℃、30min高壓滅菌，然后經(jīng)60℃、30min烘干的方法處理樣品基質(zhì)，并采用陰性和陽性樣品各兩種染菌方案（楊氏檸檬酸桿菌+溫和氣單胞菌+大腸桿菌、遲鈍愛德華桿菌+溫和氣單胞菌+大腸桿菌的組合作為陰性樣品；1份鼠傷寒沙門菌染菌樣品+3份大腸桿菌染菌樣品、1份甲型副傷寒沙門菌染菌樣品+3份大腸桿菌染菌樣品組合作為陽性樣品），分別隨機(jī)組合成含陰陽性樣品的考核樣品組，能夠較好地達(dá)到實驗室比對的目的。

［1］徐建國，闞飆，張建中，等.現(xiàn)場細(xì)菌學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2011：115-130.

［2］蘇世彥.食品微生物檢驗手冊［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1998：107.

［3］呂志平.國內(nèi)外技術(shù)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物限量［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002：1-371.

［4］GB/T 28043-2011利用實驗室間比對進(jìn)行能力驗證的統(tǒng)計方法［S］.

［5］GB/T 15483.1-1999利用實驗室間比對的能力驗證第1部分：能力驗證計劃的建立和運(yùn)作［S］.

［6］陳文勝，譚慧嘉，羅建波，等.公共衛(wèi)生實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)探討與實例分析［J］.中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2011，38（增刊）：40-42.

［7］GB4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門菌檢驗［S］.

Study on the Detection of Preparation for Salmonella Samples in Aquatic Products between Laboratories

CHEN Guanwu，CHEN Donge，CAI Ying，ZENG MeiJin，SU Jianhui，ZHANG Zhengrong
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong，515000）

This study aims to explore optim ization methods of Salmonella samples in aquatic products between Laboratories and provides scientific basis for the implementation of laboratory comparison. Frozen shrimp as the basic sample，adding the artificial Salmonella and（or）some sim ilar interference bacteria as the final inter laboratory comparison specimen，studying and testing the sample processing procedures，the interaction between positive strains and interfering strains in the bacterial samples，the comparison of bacterial contam ination in the positive strains and interfering strains in the bacterial samples，verifying three key steps of the technical essentials.Results proved the homogeneity and stability of frozen shrimp Salmonella samples’test results meets the requirements.The application between different laboratories can better reflect the test level of the laboratory.

Salmonella；Inter Laboratory Comparison；Sample Preparation；Aquatic Products；Interfering Bacteria

TS207.4

E-mail：13682884777@139.com

2016-03-07