馬瑋超　杜茂林　谷亞楠

摘要：用深孔微培養(yǎng)-酶標(biāo)儀檢測(cè)替代搖瓶培養(yǎng)-紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，以期建立1種高通量選育果膠酶高產(chǎn)菌的方法。試驗(yàn)確立的最佳微培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速280 r/min，振幅45 mm，裝液量1.2 mL/孔。經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析表明：2種檢測(cè)方法的檢測(cè)值、酶產(chǎn)值間線性回歸關(guān)系均極顯著，且數(shù)值排序大致相同，表明用深孔微培養(yǎng)-酶標(biāo)儀檢測(cè)體系選育菌種是可行的。通過(guò)復(fù)合誘變（超聲波處理40 min，紫外照射60 s），經(jīng)過(guò)高通量篩選，得到4株高產(chǎn)菌。經(jīng)傳代培養(yǎng)后證明：C23-7、C23-9這2株菌遺傳穩(wěn)定，酶活效價(jià)均值分別可達(dá)705.7、695.0 U/mL，分別比出發(fā)菌株（477.3 U/mL）提高了47.85%、45.61%，適合應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：果膠酶；高通量；復(fù)合誘變；超聲波；紫外誘變

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0513-04

果膠酶被廣泛應(yīng)用于食品加工、紡織加工、造紙制漿、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域[1-2]，是世界四大酶制劑之一。目前果膠酶主要采用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。高效生產(chǎn)果膠酶具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義，而提高酶的產(chǎn)量，離不開高產(chǎn)菌種的選育。目前，菌種選育的技術(shù)手段十分豐富，如原生質(zhì)體雜交育種、不定向誘變、轉(zhuǎn)基因定向育種等，大大提升了育種效果，但是與其配套的高效篩選方法卻進(jìn)展不大。已報(bào)道的果膠酶高產(chǎn)菌種選育方法，多數(shù)仍為傳統(tǒng)的平板篩選法[3-5]。傳統(tǒng)方法在初篩時(shí)，對(duì)誘變后菌液的梯度稀釋過(guò)程中，很有可能遺漏高產(chǎn)正突變菌株，而且人工、設(shè)備消耗較大，效率低下。建立1種可有效減少篩選遺漏、工作強(qiáng)度、材料消耗，提高工作效率的果膠酶高產(chǎn)菌選育方法，就成為亟待解決的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 出發(fā)菌株 出發(fā)菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏的1株可產(chǎn)果膠酶的黑曲霉（Asperillus.spp）及其多個(gè)突變株。

1.1.2 主要儀器 SP-Max 2300A光吸收型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀；VIS-7220N紫外分光光度計(jì)；ZWY-200D搖床；Matrix EXP 6道移液器；TDZ5-WS孔板離心機(jī)；YLN-V紫外誘變箱；xrc-80AD超聲波清洗器；孔板固定架；48孔矩形深孔板（4.6 mL）。

1.1.3 主要試劑 果膠粉（Sigma公司，分析純）。DNS溶液為自行配制，儲(chǔ)存于棕色容器避光保存1周后備用。

1.1.4 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：40 g果膠，10 g （NH）2SO4，38 g K2HPO4·3H2O，2 g KH2PO4，加蒸餾水定容到 1 000 mL，將pH值調(diào)至6。

發(fā)酵培養(yǎng)基：30 g蔗糖，2 g果膠，20 g（NH4）2SO4，3 g NaNO3，3.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4·3H2O，0.25 g MgSO4，0.15 g Fe2（SO4）3，加蒸餾水定容到1 000 mL，將pH值調(diào)至6。

篩選平板培養(yǎng)基：28 g果膠，20 g （NH4）2SO4，3.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4·3H2O，0.18 g CaCl2，0.25 g MgSO4，0.15 g Fe2（SO4）3，20 g瓊脂條，0.2 g溴酚藍(lán)，加蒸餾水定容到1 000 mL，將pH值調(diào)至6。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

1.1.5 種子液制備 挑單菌落接在PDA斜面上，于30 ℃培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌生理鹽水沖洗斜面，裝入含有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度為2×107個(gè)/mL，作為種子液。

1.2 培養(yǎng)條件和酶活效價(jià)測(cè)定方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)及其酶活效價(jià)測(cè)定 搖瓶培養(yǎng)：250 mL三角瓶中裝液23 mL，接種2 mL種子液；轉(zhuǎn)速200 r/min，振幅25 mm；溫度30 ℃，培養(yǎng)58 h。以下如無(wú)專門說(shuō)明，均與此相同。

在其他條件一定的情況下，單位酶活力與反應(yīng)后顯色物濃度呈線性相關(guān)，顯色物濃度又與D值呈線性相關(guān)。因此可以直接用D值代表酶活力效價(jià)，用來(lái)反映單位酶活力。

搖瓶培養(yǎng)酶活力效價(jià)測(cè)定：培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液，用離心機(jī)離心，上清液即為粗酶液。

試管中加入0.9 mL含1%果膠的緩沖溶液，40 ℃水浴保溫3 min；加入0.1 mL適度稀釋的粗酶液，反應(yīng)10 min；加入 3 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液，混勻，沸水浴3 min；冷卻，定容到15 mL。以煮沸滅活酶液作為空白對(duì)照調(diào)零。適度稀釋反應(yīng)液（使D值保持在0.1～1.0之間），裝入1 cm石英皿中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定540 nm處D540 nm。以加煮沸滅活酶液的試管為空白對(duì)照。每次測(cè)定3個(gè)平行。相關(guān)計(jì)算公式：

搖瓶培養(yǎng)酶活力效價(jià)（U/mL）=D540 nm×反應(yīng)液稀釋倍數(shù)×酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.2 深孔培養(yǎng)及其酶活效價(jià)測(cè)定 深孔培養(yǎng)：在適當(dāng)單孔裝液量、振幅、轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為58 h。以下如無(wú)特別說(shuō)明，均與此相同。

深孔培養(yǎng)酶活力效價(jià)測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束后，在各孔取 0.1 mL 發(fā)酵液，轉(zhuǎn)入空白深孔板對(duì)應(yīng)孔中，用無(wú)菌水補(bǔ)足至1 mL，混勻，孔板離心機(jī)離心，孔中上清液即為粗酶液。

為方便比較起見，其他測(cè)定條件完全同本節(jié)。不同的是先在試管中進(jìn)行DNS反應(yīng)，適度稀釋反應(yīng)液后，再將反應(yīng)液移至48孔孔板對(duì)應(yīng)孔中，利用酶標(biāo)儀快速測(cè)定D540 nm。原因是直接利用孔板進(jìn)行顯色反應(yīng)，沸水浴容易使孔板受熱變形，且DNS反應(yīng)液呈堿性，具有一定的腐蝕性，且稀釋樣液不方便，都會(huì)影響到測(cè)定。以加煮沸滅活酶液并經(jīng)掃板檢測(cè)的深孔為空白對(duì)照。每次測(cè)定3個(gè)平行，相關(guān)公式：

孔板培養(yǎng)酶活力效價(jià)（U/mL）=D540 nm×反應(yīng)液稀釋倍數(shù)×酶液稀釋倍數(shù)。

1.3 復(fù)合誘變條件的確認(rèn)

超聲波可產(chǎn)生空化作用，使液體中小氣泡產(chǎn)生高溫高氣壓，沖擊細(xì)胞，破壞壁膜，促使胞內(nèi)外物質(zhì)交換，從而引發(fā)突變。在紫外線照射下，嘌呤、嘧啶會(huì)形成嘧啶二聚體，阻礙堿基配對(duì)，引發(fā)突變。2種誘變方式操作簡(jiǎn)便，安全無(wú)毒，設(shè)備易得，突變率高，適合作為誘變因子。而復(fù)合誘變具備有效克服疲勞效應(yīng)、提高突變率的優(yōu)勢(shì)。因此本研究決定采用紫外線-超聲波復(fù)合誘變的方式選育高產(chǎn)菌種。

在平皿中分別裝入10 mL種子液，超聲波功率480 W，頻率40 Hz，分別作用10、20、30、40、50、60、70 min（每個(gè)梯度3個(gè)平行），計(jì)算各梯度致死率。

平皿中分別裝入10 mL種子液。將紫外燈功率調(diào)至 15 W，距離30 cm，電磁攪拌。分別照射15、30、45、60、75、90、105 s（每梯度3個(gè)平行）。計(jì)算各梯度致死率。致死率用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算，3個(gè)平行，相關(guān)公式為：

致死率=（1-誘變處理后單位活菌數(shù)/未誘變處理時(shí)單位活菌數(shù)）×100%。

1.4 高通量法篩選和分離純化單菌株

按適當(dāng)方法進(jìn)行誘變，將誘變后菌液盡可能全部、分別接入裝有培養(yǎng)基的深孔板，每孔接50 μL，共得195孔。振蕩培養(yǎng)。

對(duì)照出發(fā)菌株深孔培養(yǎng)的酶活效價(jià)用酶標(biāo)儀測(cè)量，得到高產(chǎn)孔。高產(chǎn)孔中混有高產(chǎn)單菌株的概率明顯較高，起到富集高產(chǎn)株的作用；并且，誘變后的菌液幾乎全部轉(zhuǎn)接至各孔，用于篩選，大大減少了遺漏可能。

將高產(chǎn)孔中菌液接種于斜面，培養(yǎng)6 d，用無(wú)菌水沖洗制成孢子懸液，適當(dāng)稀釋后涂布于篩選平板。挑取菌落較大、水解圈/菌落直徑比值較高的單菌落，用滅菌牙簽分別挑入48孔板振蕩培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)酶活力效價(jià)，將高產(chǎn)株轉(zhuǎn)接至斜面并編號(hào)保藏；同時(shí)，將高活力菌株轉(zhuǎn)接入搖瓶中發(fā)酵驗(yàn)證酶活力效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 深孔板培養(yǎng)方法的優(yōu)化

2.1.1 轉(zhuǎn)速、振幅對(duì)酶產(chǎn)量的影響 設(shè)置轉(zhuǎn)速梯度 40 r/min，振幅梯度10 mm，深孔板裝液量1 mL/孔。在深孔中接入出發(fā)菌株種子液，按“1.2”節(jié)中的方法培養(yǎng)，研究轉(zhuǎn)速、振幅對(duì)酶產(chǎn)量的影響。由圖1可以看出：當(dāng)振幅小于 35 mm 時(shí)，產(chǎn)物積累量隨轉(zhuǎn)速的提高增長(zhǎng)十分有限，可能是深孔中、搖瓶中液體的力學(xué)狀況明顯不同，深孔中的液體相對(duì)搖瓶會(huì)產(chǎn)生明顯的表面張力，培養(yǎng)液所受離心力需要克服表面張力，振蕩效果較差，影響了溶氧效果[6]；當(dāng)振幅達(dá)到45 mm時(shí)，轉(zhuǎn)速?gòu)?40 r/min增長(zhǎng)到280 r/min時(shí)，產(chǎn)物積累量有了顯著提高，可能是在振幅、轉(zhuǎn)速明顯提高后，克服了表面張力，改善了供氧條件。而在45 mm振幅下，轉(zhuǎn)速超過(guò)280 r/min后，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)速，產(chǎn)物積累量沒(méi)有明顯提高，過(guò)高的轉(zhuǎn)速還容易使發(fā)酵液溢出，增加了交叉污染的可能。因此，選取深孔培養(yǎng)的振動(dòng)條件為轉(zhuǎn)速280 r/min，振幅45 mm。

2.1.2 單孔裝液量對(duì)酶產(chǎn)量的影響 采用0.2 mL/孔的裝液梯度（每個(gè)梯度3個(gè)平行），轉(zhuǎn)速、振幅同“2.1.1”節(jié)中的優(yōu)化結(jié)果，驗(yàn)證裝液量的影響。產(chǎn)酶是一個(gè)需氧過(guò)程，裝液量的多少對(duì)果膠酶積累量的影響很大[7]。由圖2可見：裝液量為1.0 mL/孔時(shí)，單位效價(jià)最高；裝液量為1.2、1.4 mL/孔時(shí)有所下降，但下降不多，且相互間差別不大；裝液量繼續(xù)加大后，效價(jià)有較為明顯的下降。

裝液量過(guò)多會(huì)使菌體生長(zhǎng)困難，單位產(chǎn)物積累下降，且容易造成交叉污染和空氣中的雜菌污染。而裝液量過(guò)少，會(huì)給取樣分析造成困難，且容易提高培養(yǎng)液揮發(fā)率，影響測(cè)定精度。深孔板振蕩培養(yǎng)結(jié)果表明，四周培養(yǎng)基澄清無(wú)生長(zhǎng)跡象，因此設(shè)置裝液量為1.2 mL/孔。

2.2 深孔板法用于菌種選育的可行性分析

2.2.1 酶標(biāo)儀替代紫外分光光度計(jì)的可行性 取14株產(chǎn)酶能力明顯不同的突變株，按“1.2.1”節(jié)中的方法搖瓶培養(yǎng)后，分別利用酶標(biāo)儀檢測(cè)深孔、紫外分光光度計(jì)檢測(cè)石英皿中液體吸光度，得到2組酶活效價(jià)。

由圖3可見，2組數(shù)據(jù)排序一致。用SPSS軟件分析得到2組數(shù)據(jù)的相關(guān)性，F(xiàn)值=596.122，P值=0.000<0.01。

2種測(cè)定方法所得酶活效價(jià)不同，但2組數(shù)據(jù)線性回歸關(guān)系極顯著，說(shuō)明用酶標(biāo)儀檢測(cè)法代替紫外分光光度計(jì)檢測(cè)法是可行的。

2.2.2 深孔板培養(yǎng)與搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)酶量相關(guān)性分析 由于搖瓶培養(yǎng)、深孔板中的菌體生存環(huán)境存在一定區(qū)別，會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝過(guò)程產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響產(chǎn)物積累。本研究旨在用深孔培養(yǎng)替代搖瓶培養(yǎng)以提高選育效率，考察同一菌株在2個(gè)不同培養(yǎng)環(huán)境下彼此之間產(chǎn)物積累量的相關(guān)性，有一定的必要性。

取14株產(chǎn)酶能力有明顯差異的突變株，分別接入孔板和搖瓶當(dāng)中培養(yǎng)（做3個(gè)平行），按“1.2”節(jié)中方法測(cè)出2組酶活效價(jià)。由圖4可見：產(chǎn)量排序大致相同，有2株不同，原因可能是同一菌株對(duì)不同生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力不同。用SPSS軟件分析2組數(shù)據(jù)關(guān)系可知：F值=61.533，P值=0.000<0.01。

2種培養(yǎng)方法之間酶活效價(jià)線性回歸關(guān)系極顯著，說(shuō)明用微孔板培養(yǎng)替代搖瓶發(fā)酵，用于快速挑選高產(chǎn)菌株是可行的。深孔產(chǎn)量偏低，可能是深孔供氧能力較差所致。

2.3 高通量選育

2.3.1 復(fù)合誘變條件的確認(rèn) 如圖5、圖6所示，隨著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率呈線性提高，30 min時(shí)達(dá)到62.3%，40 min 達(dá)到74.6%，50 min時(shí)即達(dá)到89.3%，70 min開始達(dá)到100%。隨著紫外照射時(shí)間延長(zhǎng)，致死率同樣迅速提高，45 s 后即達(dá)55.6%，60 s時(shí)達(dá)到71.8%，75 s時(shí)達(dá)到86.5%，105 s開始達(dá)到100%。

致死率過(guò)低，會(huì)使突變率不足，不利于得到突變菌株。致死率過(guò)高，同樣不利于得到突變株[8-9]。并且，考慮到要先后進(jìn)行2次誘變，2種誘變條件均不宜處理過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，使致死率過(guò)高。因此，選取2個(gè)誘變因子的致死率均為70%～80%的時(shí)間作為處理時(shí)間。以此確認(rèn)誘變條件：超聲波處理40 min，紫外照射時(shí)間60 s。

2.3.2 復(fù)合誘變和高通量篩選結(jié)果 按“2.3.1”節(jié)中確認(rèn)的誘變條件進(jìn)行復(fù)合誘變，再按“1.4”節(jié)中的方法篩選高產(chǎn)孔，分離純化單菌株。

誘變后分接培養(yǎng)的195孔菌中，158孔無(wú)生長(zhǎng)跡象，其余37孔經(jīng)酶活檢測(cè)，結(jié)果見圖7?？梢钥闯觯憾嗫渍冎昝富盍Φ靡蕴岣?，其中C23孔最高，酶活效價(jià)可達(dá)254.6 U/mL。對(duì)照組（出發(fā)菌株）酶活效價(jià)：孔板186.7 U/mL。可見高產(chǎn)孔C23比對(duì)照（出發(fā)菌株）高36.19%。

按“1.2.2”節(jié)中方法分離純化C23孔中菌株，共得到單菌落67株，挑選出17株水解圈/菌落直徑比較大、生長(zhǎng)比較迅速的單菌株，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)驗(yàn)證，共得到4株高產(chǎn)菌株，分別為：C23-4（687.5 U/mL）、C23-7（701.3 U/mL）、C23-9（692.3 U/mL）、C23-14（698.7 U/mL）（圖8）。

2.4 高產(chǎn)株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

將斜面轉(zhuǎn)接分離純化所得4株高產(chǎn)菌傳代培養(yǎng)，每轉(zhuǎn)接1次記為1代。取不同代數(shù)菌株進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定酶活效價(jià)。由表1可見，C23-7、C23-9這2株菌產(chǎn)酶性能遺傳性比較穩(wěn)定，酶活效價(jià)均值分別可達(dá)705.7、695.0 U/mL，與出發(fā)菌株的477.3 U/mL相比分別提高了47.85%、45.61%，適合作為生產(chǎn)用菌種；而C23-4、C23-14隨傳代培養(yǎng)而酶活效價(jià)下降，可能是因?yàn)閭鞔^(guò)程中相關(guān)性狀丟失或者發(fā)生了自然分化，不適合作為生產(chǎn)用菌種。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究嘗試建立的采用深孔板微量培育、酶標(biāo)儀快速檢測(cè)、高通量選育果膠酶高產(chǎn)菌的方法是可行的。與傳統(tǒng)選育方法相比，本方法幾乎覆蓋了誘變后等待初篩的菌，大大減少了高產(chǎn)株遺漏的可能性。最多可一次性利用酶標(biāo)儀精確測(cè)定48個(gè)待測(cè)樣本的酶活力效價(jià)，單批次檢測(cè)量大增，顯著提高了初次篩選的效率，大大降低了材耗和能耗，節(jié)省了人工，提高了效率。

本方法是一種具備一定應(yīng)用價(jià)值的果膠酶高產(chǎn)菌株選育方法，一些其他產(chǎn)酶菌株，如果所產(chǎn)酶可用紫外分光光度法原理測(cè)定（如產(chǎn)纖維素酶菌），亦可嘗試?yán)帽痉椒ㄟM(jìn)行菌種選育。

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