張慧君　葛宇　楊先鋒

摘要：以巴西橡膠樹花藥為外植體，對(duì)巴西橡膠樹再生過程中不同類型愈傷組織的內(nèi)源激素含量及比值進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：過高或過低的內(nèi)源激素含量和不同內(nèi)源激素含量比，大多會(huì)導(dǎo)致橡膠樹外植體在分化過程中出現(xiàn)非胚性愈傷和畸形胚，因此橡膠樹花藥體細(xì)胞胚再生過程與其內(nèi)源激素密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；花藥；再生；體細(xì)胞胚；內(nèi)源激素

中圖分類號(hào)： S794.105 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0239-03

高等植物體細(xì)胞胚發(fā)生是離體生長(zhǎng)發(fā)育中一個(gè)復(fù)雜的科學(xué)問題，受內(nèi)外多種因素的影響，目前人們尚未掌握其離體發(fā)育規(guī)律。植物離體培養(yǎng)過程中植物激素起著重要的調(diào)控作用，它們的調(diào)控是引起各細(xì)胞組織和器官分化的基礎(chǔ)，從而維持植物正常的離體發(fā)育過程，植物激素對(duì)形態(tài)發(fā)生起著重要的作用，外植體離體培養(yǎng)形態(tài)建成往往需要很多外源激素的誘導(dǎo)[1-2]。對(duì)于植物離體培養(yǎng)中體細(xì)胞胚發(fā)育過程，只有胚性愈傷才能形成正常胚，畸形胚難以形成正常的組培苗，這種情況嚴(yán)重制約了組培苗工廠化的生產(chǎn)和育種的應(yīng)用。因此，本試驗(yàn)對(duì)橡膠樹花藥組織培養(yǎng)過程中非胚性愈傷和胚性愈傷、畸形胚和正常胚不同內(nèi)源激素含量進(jìn)行研究，對(duì)建立高效巴西橡膠樹體細(xì)胞胚再生體系以及種質(zhì)資源保存具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料以巴西橡膠樹優(yōu)良無性系熱研7-33-97花藥為外植體，花藥培養(yǎng)參照Hua 等的方法[3]，然后分別取培養(yǎng)60 d的胚性愈傷組織（簡(jiǎn)稱a）、非胚性愈傷組織（簡(jiǎn)稱b）、子葉胚時(shí)期的正常胚（簡(jiǎn)稱c）和畸形胚（簡(jiǎn)稱d）用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.2 方法

內(nèi)源激素的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法，采集4種類型材料，重復(fù)3次，1次10個(gè)樣品材料，于液氮中速凍；用80%甲醇溶液勻漿，4 ℃提取8 h，4 000 r/min離心15 min；沉淀用80%甲醇提取，重復(fù)3次；合并上清液，然后用氮?dú)獯蹈?，由中?guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供測(cè)試服務(wù)，每個(gè)指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3次。

應(yīng)用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源激素含量的變化

如圖1所示，在花藥愈傷再生過程中，ZT在非胚性愈傷組織（b）和畸形胚（d）中含量相對(duì)較高，在胚性愈傷組織（a）和正常胚（c）中含量相對(duì)較低；IAA在畸形胚中含量最高，在非胚性愈傷組織中含量最低；ABA在非胚性愈傷組織中含量最高，在畸形胚中含量最低；GA3含量在各組織中變化趨勢(shì)與ZT相似，在非胚性愈傷組織和畸形胚中含量相對(duì)較高，在胚性愈傷組織和正常胚中含量較低。

2.2 內(nèi)源激素比值的變化

在花藥愈傷再生過程中，不同內(nèi)源激素含量比值在4種愈傷組織中是不同的（圖2）。IAA/ZT、IAA/GA3和IAA/ABA的含量比在非胚性愈傷組織（b）中最低，ZT/ABA和GA3/ABA的含量比在畸形胚（d）中最低；IAA/ZT、IAA/ABA和GA3/ABA的含量比在胚性愈傷組織（a）中最高，IAA/GA3和ZT/ABA的含量比分別在畸形胚（d）和非胚性愈傷組織中最高。

3 討論與結(jié)論

許多學(xué)者研究表明，在植物離體細(xì)胞發(fā)育過程中，生長(zhǎng)素類物質(zhì)起重要作用，比如啟動(dòng)細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)胚性潛力，從而促進(jìn)外植體早期發(fā)育，所以說植物體的各種生理效應(yīng)是內(nèi)源激素相互作用的結(jié)果[4-5]。研究表明，細(xì)胞分裂素6-BA可以誘導(dǎo)水稻花藥等愈傷組織以不定芽的形態(tài)分化，由愈傷組織形成的出苗率與內(nèi)源生長(zhǎng)素存在負(fù)效應(yīng)，出苗率與內(nèi)源細(xì)胞分裂素存在正效應(yīng)。這說明一些植物愈傷組織在植物激素作用下所分化的不定芽是受外界誘導(dǎo)從而自身產(chǎn)生的內(nèi)源激素所影響的，已經(jīng)可以滿足外植體不定芽生長(zhǎng)發(fā)育的需要[5-6]，再添加其他植物激素反而適得其反。邢登輝等研究表明，體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，黃冠草體胚IAA含量分別在培養(yǎng)10、25 d后達(dá)到峰值[7]，這與朱麗華等在大白菜和桑下胚軸愈傷組織不定芽發(fā)生過程中的結(jié)果[8-9]類似。前人的研究說明愈傷組織的形成與內(nèi)源IAA關(guān)系密切。賴鐘雄等發(fā)現(xiàn)，龍眼的胚性愈傷組織內(nèi)源IAA含量比非胚性愈傷組織高，從早期的胚性愈傷組織發(fā)育到早期子葉胚的過程，其內(nèi)源IAA含量都維持在較高水平，并且在胚性愈傷組織和球形胚2個(gè)時(shí)期出現(xiàn)高峰，而球形胚時(shí)期后IAA含量降低[10]。本研究中，從花藥體胚的不同愈傷組織的IAA含量來看，胚性愈傷組織和正常胚相對(duì)于非胚性愈傷組織較高，與前人的結(jié)果一致，這可能與愈傷組織形成有關(guān)。前人研究表明，胡蘿卜再生過程中GA3含量高可能會(huì)抑制其體胚發(fā)生。2，4-D抑制體胚發(fā)育是通過維持高含量GA3來進(jìn)行的，當(dāng)減少2，4-D含量時(shí)，GA3迅速降到適合體胚發(fā)育的含量。同樣本研究發(fā)現(xiàn)，GA3在非胚性愈傷和畸形胚中含量相對(duì)較高，在胚性愈傷和正常胚中含量較低?？梢娫谙鹉z樹花組織培養(yǎng)過程中，形成正常胚時(shí)GA3的含量較低，而在非愈傷組織、畸形胚中相對(duì)較高。ZT含量與GA3的變化趨勢(shì)相同，但變化幅度較大，都是在胚性愈傷和正常胚中含量較低。可見，要想獲得更多的橡膠樹花藥組培苗須降低內(nèi)源ZT的含量。

通常細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素含量比越小越有利于不定根分化，反之有利于不定芽分化。此外，IAA/ABA比是影響植物再生的關(guān)鍵因素。Berry等的研究表明，不定芽產(chǎn)生的愈傷組織內(nèi)IAA與ABA含量比小于1[11-12]。本研究結(jié)果表明，在正常胚中IAA/ABA的比最高，說明橡膠樹花藥離體培養(yǎng)時(shí)，較高的IAA/ABA含量比有利于正常胚的形成。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在植物體內(nèi)的調(diào)控作用并不決定于某單一激素，往往都是一種或者幾種以上的激素通過聯(lián)合或拮抗作用共同調(diào)節(jié)的結(jié)果[13-15]?？傊?，植物內(nèi)源激素在橡膠樹體細(xì)胞胚發(fā)生和發(fā)育過程中起到重要的作用，過高或過低的4種內(nèi)源激素含量和不同內(nèi)源激素含量比，大多會(huì)導(dǎo)致橡膠樹外植體在分化過程中出現(xiàn)非胚性愈傷和畸形胚。但至今仍不知道這些激素通過何種途徑來調(diào)控巴西橡膠樹的作用機(jī)制，關(guān)于畸形胚及其形成原因以及降低畸形胚發(fā)生率的措施等有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Noma M，Huber J，Ernst D，et al. Quantitation of gibberellins and the metabolism of [3H]gibberellin A1 during somatic embryogenesis in carrot and anise cell cultures[J]. Planta，1982，155（5）：369-376.

[2]何鐘佩. 作物激素生理及化學(xué)控制[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997.

[3]Hua Y W，Huang T D，Huang H S. Micropropagation of self-rooting juvenile clones by secondary somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis[J]. Plant Breeding，2010，129（2）：202-207.

[4]崔凱榮，戴若蘭. 植物體細(xì)胞胚發(fā)生的分子生物學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2000：48-64

[5]肖關(guān)麗，楊清輝，李富生，等. 內(nèi)源激素變化與甘蔗愈傷組織分化綠苗關(guān)系研究[J]. 種子，2003（1）：10-11.

[6]Centeno M L，Rodriguez A，F(xiàn)eito I，et al. Relationship between endogenous auxin and cytokinin levels and morphogenic responses in Actinidia deliciosa tissue cultures[J]. Plant Cell Reports，1996，16（1/2）：58-62.

[7]邢登輝，趙云云，黃承芬. 皇冠草體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其體胚發(fā)生過程中內(nèi)源激素的變化[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，1999，15（1）：100-105.

[8]朱麗華，張彩琴，盛小光，等. 大白菜下胚軸不定芽再生過程中內(nèi)源激素和多胺含量的變化[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，21（2）：143-146.

[9]張和禹，趙正龍. 桑下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及分化過程中內(nèi)源激素的變化[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2000，26（1）：1-4.

[10]賴鐘雄，陳春玲. 龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的內(nèi)源激素變化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2002，23（2）：41-47.

[11]Berry T，Bewley J D. A role for the surrounding fruit tissues in preventing the germination of tomato （Lycopersicon esculentum） seeds：a consideration of the osmotic environment and abscisic acid[J]. Plant Physiology，1992，100（2）：951-957.

[12]裴 東，鄭均寶，凌艷榮，等. 紅富士蘋果試管培養(yǎng)中器官分化及其部分生理指標(biāo)的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1997，24（3）：24-29.

[13]Beemster G S，Baskin T I. Stunted plant 1 mediates effects of cytokinin，but not of auxin，on cell division and expansion in the root of Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2000，124（4）：1718-1727.

[14]張慧君，陳勁楓. 植物組織培養(yǎng)生理機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（3）：33-35.

[15]郭 瑾，薛永來，杜道林. 植物激素調(diào)控?cái)M南芥根系發(fā)育的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（5）：7-10.