劉偉　宋志強(qiáng)　侯溫甫

摘要：為探究氣相色譜法（GC）檢測鮮切草魚中氯霉素（CAP）含量的最佳前處理?xiàng)l件，對加標(biāo)溶劑、凈化方法、C18柱活化過程、C18柱洗脫劑選擇、衍生環(huán)境、衍生溫度、衍生時(shí)間7個(gè)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，水為加標(biāo)溶劑，選用C18柱為凈化萃取柱，萃取柱活化方法為甲醇、氯仿、甲醇、水依次加入5 mL，甲醇為洗脫劑，用量為2 mL×2 mL，在70 ℃恒溫條件下衍生25 min，回收率可達(dá)到118.8%～120.0%，RSD為0.12%～0.96%。

關(guān)鍵詞：鮮切草魚；氯霉素；氣相色譜；前處理?xiàng)l件

中圖分類號：TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.044

Abstract：To explore the best pretreatment conditions through gas chromatography method to detect the content of chloramphenicol in fresh cut grass carp. Optimized 7 experimental conditions： spik standard solvent， extraction method， the method of activating the C18 column， the eluting agent of the C18 column， derivative environment， derivative temperature and derivative time. The experimental conditions of gas chromatography method was optimized that the spiked standard solvent was water；extraction column was C18 column；the method of activating the extraction was adding 5 mL methanol，5 mL chloroform，5 mL methanol，5 mL water in order；the eluting agent was methanol with the amount of 2 mL×2 mL；the derivative condition was 70 ℃ for 25 min. The recovery was reached between 118.8%～120.0%， and the value of RSD was between 0.12%～0.96%.

Key words： fresh cut grass carp； chloramphenicol；gas chromatography；pretreatment condition

氯霉素屬廣譜抗生素，曾在畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)中廣泛使用[1]。氯霉素有較強(qiáng)的毒副作用，如果氯霉素在食用動(dòng)物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，長期微量攝入氯霉素，不僅使人體腸道正常菌群失調(diào)，而且還會(huì)引起多種疾病，對人類的健康造成危害。世界上許多國家禁止氯霉素用于生產(chǎn)食品動(dòng)物，并規(guī)定了在畜產(chǎn)品中氯霉素不得檢出。美國[2]和芬蘭[3]規(guī)定氯霉素不得檢出，歐共體規(guī)定氯霉素殘留量不得超過10 ng/g，中國則規(guī)定氯霉素含量≤2 ng/g[4]。中國農(nóng)業(yè)部明文禁止在所有食品動(dòng)物中使用氯霉素藥物[5]。一方面，氯霉素的代謝需要一定的周期，其影響可能持續(xù)1～2年；另一方面，個(gè)別養(yǎng)殖戶不顧國家禁令繼續(xù)使用該抗生素也將使得氯霉素對水產(chǎn)品的食用安全構(gòu)成嚴(yán)重危害[6]。

目前，氯霉素檢測方法雖有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、微生物法等多種，但氣相色譜法為檢測氯霉素含量的常規(guī)方法。然而，氣相色譜法檢測過程中樣品前處理較復(fù)雜，操作技術(shù)要求高，易出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象[7-11]。同時(shí)，不同樣品由于基質(zhì)不同，前處理?xiàng)l件存在較大差異。鮮切草魚產(chǎn)品是繼冷鮮肉、鮮切蔬菜等后逐步發(fā)展起來的新型魚肉銷售產(chǎn)品，為保證食用安全，氯霉素殘留的檢測必不可少。目前，針對鮮切草魚產(chǎn)品中氯霉素含量的檢測研究較少，利用氣相色譜法檢測鮮切草魚肉中氯霉素含量的文章鮮有報(bào)道，本研究通過對氣相色譜法檢測草魚產(chǎn)品中氯霉素含量的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，確定鮮切草魚中氯霉素含量的最佳前處理?xiàng)l件，以期為采用GC法檢測鮮切草魚中氯霉素含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚購自于武漢市常青花園武商量販超市，去內(nèi)臟后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，清洗預(yù)冷后進(jìn)行分割，加工成鮮切草魚魚腩產(chǎn)品。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、阿拉丁試劑，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；BSTFA+TCMS（99：1），美國Regis公司；乙酸乙酯（色譜純）、甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純）、三氯甲烷（分析純）、無水硫酸鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16A型醫(yī)用離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；Milli-Q Integral型超純水機(jī)，美國Millipore公司；SB-5200DTN型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；MIR-154型低溫恒溫培養(yǎng)箱，三洋電機(jī)株式會(huì)社；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；XH-C型旋渦混合器、FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機(jī)、HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；ASE-16型固相萃取儀、MTN-2800D型氮吹濃縮裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；移液器（100 μL、1 mL、5 mL），德國Eppendorf公司；HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、Agilent 7890A型氣相色譜系統(tǒng)（配有7693自動(dòng)進(jìn)樣器），美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 加標(biāo)溶劑優(yōu)化 分別稱取0.01 g氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品3份，2份分別用甲醇和乙腈將其溶解后定容到100 mL，另1份用少量甲醇將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解，用水定容到100 mL，然后分別配成0.1、0.5、1.0 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1 mL加入到鮮切草魚肉制品中，按標(biāo)準(zhǔn)SC/T3018-2004進(jìn)行前處理，氣相色譜檢測，優(yōu)化加標(biāo)溶劑。

1.3.2 凈化方法優(yōu)化 稱取魚肉樣品5 g，添加濃度為0.1、0.5、1.0 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，相當(dāng)于添加量為0.05、0.10、0.20 μg/g。按照標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3018-2004進(jìn)行提取，分別采用無水硫酸鈉柱、C18柱、無水硫酸鈉柱+C18柱3種凈化方法對提取液進(jìn)行凈化處理，每組做3個(gè)平行，凈化處理后按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行衍生化處理，最后采用氣相色譜法對氯霉素進(jìn)行GC檢測。

1.3.3 C18柱活化 稱取魚肉樣品5 g，分別加入1 mL濃度為0.1、0.5、1.0 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取。采用2種方法對C18柱進(jìn)行活化，4步法：按甲醇、氯仿、甲醇、水各5 mL的順序分別過柱活化；2步法：10 mL甲醇、10 mL水過柱活化。

1.3.4 洗脫劑的選擇 稱取魚肉樣品5 g，加入0.1、0.5、1.0 μg/mL濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行提取。按甲醇、氯仿、甲醇、水各5 mL的順序分別過柱活化，提取液過柱凈化后，分別選用2 mL×2 mL的甲醇和乙腈進(jìn)行洗脫。

1.3.5 衍生環(huán)境優(yōu)化 取濃度為0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL試管內(nèi)，氮?dú)獯蹈?，避免吸潮。加?00 μL BSTFA+TCMS（99∶1）后分別于烘箱、水浴、超聲波3種衍生環(huán)境下進(jìn)行衍生，每組3個(gè)平行，衍生溫度均為70 ℃，衍生時(shí)間為30 min。衍生后氮?dú)獯蹈桑M(jìn)行GC檢測。

1.3.6 衍生溫度優(yōu)化 分別將1 mL 濃度為0.1、0.5、1.0 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到10 mL的玻璃試管內(nèi)，氮?dú)獯蹈桑苊馕?。加?00 μL BSTFA+TCMS（99∶1）于“1.3.5”中最優(yōu)衍生環(huán)境進(jìn)行衍生，分別在50、60、70、80 ℃溫度下衍生，30 min后氮?dú)獯蹈桑M(jìn)行GC檢測。

1.3.7 衍生時(shí)間優(yōu)化 分別取濃度為0.1、0.5、1.0 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL試管內(nèi)，氮?dú)獯蹈桑苊馕?。加?00 μL BSTFA+TCMS（99∶1）硅烷化試劑進(jìn)行衍生，在其最適溫度下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min后進(jìn)行GC檢測，每組3個(gè)平行，對衍生的最適反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 加標(biāo)溶劑對加標(biāo)回收率的影響

分別用甲醇、乙腈和水3種溶劑溶解氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋為0.1、0.5、1.0 μg/mL加入到鮮切草魚魚肉產(chǎn)品中。通過GC檢測，比較3種溶劑對加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見表1。由表1可以看出，水作為加標(biāo)溶劑時(shí)回收率及RSD分別為96.18%～107.00%和2.99%～4.18%；而乙腈作為加標(biāo)溶劑時(shí)回收率和RSD分別為86.93%～90.31%和2.06%～15.88%；甲醇作為加標(biāo)溶劑時(shí)，當(dāng)加標(biāo)濃度增大時(shí)，回收率下降為87.98%，而且RSD較大。水作為加標(biāo)溶劑時(shí)，回收率相對較高，乙腈則相對較差，僅為86.93%～90.31%，且平行性較差。當(dāng)加標(biāo)濃度較高時(shí)，甲醇與乙酸乙酯、水兩者互溶會(huì)造成少量損失。氯霉素易溶于乙酸乙酯，但水與乙酸乙酯兩者不互溶，因此氯霉素全部被萃取到乙酸乙酯相中，回收效果較好，選取水為最優(yōu)加標(biāo)溶劑。

2.2 凈化方法對回收率的影響

分別將0.1、0.5、1.0 μg/mL 3種濃度氯霉素樣品加入到不含氯霉素的草魚魚肉樣品中，用乙酸乙酯進(jìn)行提取，提取液分別經(jīng)3種凈化處理，通過比較回收效果和出峰效果，選取出最優(yōu)凈化方法。由表2可以看出，無水硫酸鈉柱、C18柱、無水硫酸鈉柱+C18柱3種凈化方法在0.02、0.10、0.20 μg/g不同加標(biāo)濃度下回收率分別為82.56%～93.73%、74.49%～92.44%、86.12%～107.97%。因此，無水硫酸鈉柱+C18柱組合凈化方法的回收效果最好，其次為C18柱，無水硫酸鈉柱的凈化效果最差，但總體差別不顯著。

由圖1可以看出，無水硫酸鈉柱凈化后出現(xiàn)較多雜峰，C18柱、無水硫酸鈉+C18柱凈化效果較好。但無水硫酸鈉柱+C18柱組合凈化方法中無水硫酸鈉凈化操作復(fù)雜，需要二次旋蒸濃縮，耗費(fèi)檢測時(shí)間。C18柱無論在凈化效果還是回收率都已滿足要求，而且操作簡單，一次可進(jìn)行多個(gè)樣品同時(shí)凈化，節(jié)省檢測時(shí)間，選定C18柱為最佳凈化方法。

2.3 C18柱活化方法對回收率的影響

向鮮切草魚魚肉產(chǎn)品中分別加入0.1、0.5、1.0 μg/mL濃度的氯霉素溶液，通過C18柱凈化方法進(jìn)行處理，過柱前對C18固相萃取柱進(jìn)行活化處理。活化選用2種方法，回收效果見表3。圖2為1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液在2種活化方法下的色譜圖。由圖2可以看出，2步法和4步法的回收率在低濃度時(shí)，4步法活化效果較好，回收率為92.83%，而2步法僅為88.39%。在3個(gè)濃度下4步法的平行性相對較好，RSD為0.55%～1.28%，而2步法RSD為0.98%～9.07%，因此選擇4步法。

2.4 C18柱洗脫劑對回收率的影響

C18柱凈化后，分別選用2 mL×2 mL的乙腈、甲醇洗脫目標(biāo)物再進(jìn)行GC檢測，檢測結(jié)果見表4。由表4可以看出，甲醇洗脫目標(biāo)物時(shí)，回收率為86.00%～103.82%，RSD為0.68%～3.18%，而乙腈洗脫時(shí)回收率為78.30%～97.67%，RSD為0.62%～6.84%。甲醇作為洗脫劑，回收率高、穩(wěn)定性好，因此甲醇作為C18柱的凈化洗脫劑效果較好。

2.5 衍生環(huán)境對衍生結(jié)果的影響

將1 mL的0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在氮?dú)庀麓蹈珊?，置?種環(huán)境中70 ℃衍生30 min，衍生結(jié)果見表5。從表5中可以看出，在烘箱環(huán)境中，衍生效果最好，回收率為99.24%，衍生完全，但RSD為15.09%，穩(wěn)定性較差。而超聲環(huán)境和水浴環(huán)境下的回收率僅為73.97%和64.03%，這是因?yàn)楣柰榛噭┮孜?，遇水?huì)分解、失效。雖然水浴、超聲處理時(shí)已做密封處理，但在70 ℃條件下，水蒸氣較多，容易進(jìn)入衍生環(huán)境，因此選擇烘箱為最佳衍生環(huán)境。

2.6 衍生溫度對衍生結(jié)果的影響

將1 mL 的0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在氮?dú)庀麓蹈珊?，置?0、60、70、80 ℃ 4個(gè)溫度下烘箱環(huán)境反應(yīng)30 min，結(jié)果見表6。由表6可以看出，溫度為50 ℃時(shí)回收率低于60%，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)回收率上升，到70 ℃時(shí)回收率最高，回收率達(dá)到113.40%。在50～60 ℃條件下，未達(dá)到BSTFA+TCMS（99∶1）硅烷化試劑與氯霉素的反應(yīng)溫度，部分硅烷化試劑沒有充分反應(yīng)，造成回收率較低。當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)由于溫度過高，部分衍生物揮發(fā)損失，造成回收率的降低。因此70 ℃左右為氯霉素最佳衍生溫度，硅烷化試劑衍生完全，回收效果最佳，選取70 ℃為最適衍生溫度。

2.7 衍生時(shí)間對衍生結(jié)果的影響

將1 mL的0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在氮?dú)庀麓蹈珊?，?0 ℃烘箱環(huán)境下反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min 6個(gè)時(shí)間段，衍生結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在10 min時(shí)回收率已經(jīng)達(dá)到99.6%，20～30 min時(shí)回收率最高，而30 min后回收率降低。BSTFA+TCMS（99∶1）硅烷化試劑在70 ℃下可以快速與氯霉素反應(yīng)，最佳反應(yīng)時(shí)間為20～30 min，回收率達(dá)到118.8%～120.0%，RSD為0.12%～0.96%，因此，衍生時(shí)間可設(shè)定為25 min。反應(yīng)時(shí)間過長，回收率降低，可能因?yàn)闀r(shí)間過長引起衍生物的氣化損失，但這與沈美芳等[7]研究的結(jié)果不同。

3 小結(jié)

本研究優(yōu)化了鮮切草魚中氯霉素含量的氣相色譜檢測方法的前處理?xiàng)l件。結(jié)果表明，①選用超純水做為加標(biāo)溶劑，回收效果和穩(wěn)定性均較甲醇和乙腈作為加標(biāo)溶劑的好；②選用C18柱進(jìn)行凈化，該方法不僅操作簡單，凈化速度快，而且可以同時(shí)凈化多個(gè)樣品，回收效果和穩(wěn)定性也相對較好；③C18柱的活化則選用甲醇、氯仿、甲醇、水各5 mL的順序進(jìn)行活化，活化效果完全，凈化效果較好；④選擇2 mL×2 mL甲醇作為目標(biāo)物的C18柱凈化后洗脫劑，洗脫效果較好，回收率高；⑤衍生環(huán)境為烘箱，烘箱簡單易得，并能保證反應(yīng)時(shí)處于完全干燥的環(huán)境下，避免硅烷化試劑吸潮失效；⑥最適衍生溫度為70 ℃，回收率最高；⑦衍生最適反應(yīng)時(shí)間為25 min。通過對上述條件的優(yōu)化，獲得了適用于鮮切草魚產(chǎn)品氯霉素含量檢測的氣相色譜檢測法的最優(yōu)前處理?xiàng)l件，優(yōu)化后的前處理方法操作簡便、耗時(shí)少、回收效果好、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性高，為鮮切草魚氯霉素的檢測提供了有效的參考。

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