郭休玉，何蘭，位曉娟，王南平

上海市水產(chǎn)研究所 水產(chǎn)品加工研究室(上海， 200433)

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魷魚軟骨II型膠原蛋白提取方法及結(jié)構(gòu)分析

郭休玉，何蘭，位曉娟，王南平

上海市水產(chǎn)研究所 水產(chǎn)品加工研究室(上海， 200433)

目的從魷魚軟骨中分離純化非變性II型膠原蛋白， 并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。方法將魷魚軟骨凍干后粉碎成200目軟骨粉， 用4%(w/w)NaOH溶液去除多糖、 0.5 M EDTA溶液脫灰對(duì)軟骨進(jìn)行前處理， 采用胃蛋白酶水解提取， NaCl鹽析用純水透析后冷凍干燥得到II型膠原蛋白樣品。通過氨基酸組成分析、 SDS-PAGE電泳、 紫外吸收光譜、 電鏡掃描等對(duì)制備的樣品鑒定。結(jié)果制備的II型膠原蛋白具有3條α1鏈， 分子量112 kDa， 在224.5 nm波長處有最大紫外吸收， 具有三螺旋結(jié)構(gòu)特征。

魷魚； 軟骨； II型膠原蛋白； 結(jié)構(gòu)

0　引言

II型膠原是纖維形成膠原， 與一些蛋白聚糖結(jié)合， 是軟骨與玻璃液中的主要膠原[1]。國內(nèi)外關(guān)于II型膠原的研究主要來源于雞胸軟骨， 1993年Trentham DE等[2]報(bào)導(dǎo)了采用雞II型膠原蛋白治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究。

II型膠原蛋白由3條相同的α1鏈組成三維螺旋結(jié)構(gòu)， 并通過共價(jià)鍵交聯(lián)， 形成特殊的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。軟骨中II型膠原與蛋白多糖緊密結(jié)合(如圖1)， 共同構(gòu)成了軟骨獨(dú)特的功能性， 對(duì)保持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性有著重要作用。

在海洋魚類中同樣具有豐富的軟骨資源， 鯊魚、 鱘魚都是軟骨魚類， 魷魚的頸部也有軟骨存在， 這些軟骨通常在加工中廢棄或者提取軟骨中的多糖制備硫酸軟骨素等[3]， 而II型膠原未被重視和利用。近幾年II型膠原在生物醫(yī)學(xué)工程中的研究主要集中在由T細(xì)胞參與自身免疫系統(tǒng)引起的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抑制[4]， 以及制備關(guān)節(jié)膜和凝膠促進(jìn)軟骨修復(fù)[5]。由于魚膠原具有低抗原的特性， 所以魚來源II型膠原蛋白的提取及結(jié)構(gòu)分析是值得關(guān)注的領(lǐng)域。

圖1　軟骨基質(zhì)組成示意圖Fig.1　The composition of cartilage matrix

1　材料與方法

1.1原料和試劑

原料： 魷魚軟骨取自浙江某公司捕撈的秘魯魷魚， 剝離出軟骨， 去除附著的筋肉， 將軟骨切成2 cm大小， -40 ℃冷凍備用。

試劑： 胃蛋白酶， Sigma公司； 氫氧化鈉、 氯化鈉、 鹽酸胍、 乙二胺四乙酸(EDTA)、 純鹽酸、 冰乙酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器和設(shè)備

FD-3冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)， FDV型氣引式粉碎機(jī)(臺(tái)灣佑崎有限公司)， BZS-200型標(biāo)準(zhǔn)振動(dòng)篩機(jī)(新鄉(xiāng)市恒信有限公司)， CR20B2型高速冷凍離心機(jī)(日本日立工機(jī)株式會(huì)社)， C-MAG HS7磁力攪拌器(德國IKA)， TF-CX-2型數(shù)控層析冷柜(上海田楓實(shí)業(yè)有限公司)， 島津UV-1700紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU)， Millipore Simplicity System純水機(jī)(Millipore Corporation)。

1.3II型膠原蛋白的提取

1.3.1魷魚軟骨基本成分

將魷魚軟骨凍干， 向粉碎機(jī)中充入液氮， 在低溫條件下粉碎， 篩分出200 目軟骨粉， 測(cè)定魷魚軟骨的基本成分， 如表1所示。

從表1可知， 魷魚軟骨中蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%以上， 比雞軟骨蛋白質(zhì)含量較高[6]， 灰分和脂肪含量顯著低于鯊魚軟骨[7]。魷魚軟骨中的多糖主要是硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate， CS)， 灰分主要是含有Ca2+的羥基磷灰石。軟骨中II型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能為羥基磷灰石沉積提供框架， 蛋白多糖對(duì)羥基磷灰石有高度親和力[8]， 使得II型膠原難以溶出， 在提取II型膠原時(shí)需對(duì)軟骨進(jìn)行除多糖和脫灰前處理。

表1　魷魚軟骨基本組成成分(干基)Tab.1　Main components of squid cartilage

1.3.2魷魚軟骨II型膠原蛋白提取流程

為保持II型膠原的結(jié)構(gòu)完整， 獲得非變性II型膠原蛋白， 所有操作及步驟均在4 ℃低溫下進(jìn)行。

本文采用酶法制備II型膠原， 流程如下： 魷魚軟骨→凍干粉碎→200 目軟骨粉→去除多糖→去離子水清洗→脫灰→去離子水清洗→胃蛋白酶水解→鹽析沉淀→透析→冷凍干燥→II型膠原蛋白。

1.3.3去除軟骨中的多糖

在4 ℃條件下， 分別加入軟骨粉重量20倍體積的4‰(w/w)NaOH溶液、 4%(w/w)NaOH溶液和4 mol/L鹽酸胍溶液， 緩慢攪拌24 h， 每隔6 h更換一次溶液并取出少量軟骨粉樣品， 去離子水完全清洗， 干燥后測(cè)定軟骨粉樣品中硫酸軟骨素的含量。參照GB/T 20365-2006《硫酸軟骨素含量的測(cè)定 液相色譜法》， 以HPLC法測(cè)定硫酸軟骨素的含量。

1.3.4軟骨脫灰處理

將去除多糖的魷魚軟骨粉用去離子水完全清洗去除殘留NaOH等， 4 ℃下分別加入20倍體積的HCl(pH 2.0)溶液和0.5 M EDTA(pH 8.0)溶液， 緩慢攪拌24 h， 每隔6 h更換一次溶液并取出少量軟骨粉樣品， 去離子水完全清洗干燥后測(cè)定軟骨灰分?；曳譁y(cè)定參照GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》。

1.3.5II型膠原蛋白的提取純化

將脫灰后的魷魚軟骨粉用去離子水完全清洗干凈EDTA等， 料液比(w/v)1： 30加入0.5 M乙酸溶液， 再加入0.2%(w/w)胃蛋白酶， 4 ℃條件下緩慢攪拌， 水解48 h， 4 ℃、 10 000 rpm離心30 min， 取上清液。

向上清液中加入飽和NaCl溶液至NaCl終端濃度達(dá)到4%[9]， 鹽析沉淀II型膠原蛋白， 靜置12 h， 4 ℃、 10 000 rpm離心。將II型膠原蛋白沉淀用0.5 M乙酸溶液溶解， 裝入截留分子量100 kDa的透析袋中， 以純水作為透析外液， 4 ℃透析3 d， 每12 h更換一次透析外液， 將透析好的膠液在真空下冷凍干燥得到II型膠原蛋白。

1.4II型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)分析

1.4.1氨基酸測(cè)定

參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》中樣品處理方法， 取II型膠原蛋白樣品溶于6 mol/L鹽酸中， 110 ℃水解24 h， 采用Agilent1100高效液相色譜儀測(cè)定水解液中氨基酸含量。

1.4.2SDS-PAGE電泳測(cè)定

將II型膠原蛋白樣品溶于Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L， pH 7.4， 25 ℃)， 取400 μg/mL II型膠原蛋白制品10 μL， 加入10 μL 2×SDS樣品緩沖液。配制5%濃縮膠、 8%分離膠， 上樣量10 μL， 電流15 mA。考馬斯亮藍(lán)染色， 醋酸溶液脫色后掃描。

1.4.3紫外吸收光譜測(cè)定

取少量II型膠原蛋白樣品溶于0.2 M乙酸溶液中， 配制成濃度為0.5 mg/mL的II型膠原蛋白溶液， 以0.2 M乙酸溶液作為空白對(duì)照， 在190 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.4.4電鏡掃描

將制備的II型膠原蛋白樣品送至華東理工大學(xué)分析測(cè)試中心， 采用日立S-3400掃描電子顯微鏡觀測(cè)II型膠原蛋白表面成像。

2　結(jié)果與討論

2.1魷魚軟骨前處理工藝

2.1.1魷魚軟骨去除多糖

圖2表明， 經(jīng)過4次處理后， 4 mol/L鹽酸胍去除多糖效果最佳。蛋白多糖具有可溶于4 mol/L鹽酸胍的性質(zhì)， 但用鹽酸胍處理后的魷魚軟骨粉顏色顯著加深， 且處理過程中鹽酸胍消耗量巨大， 故不選用鹽酸胍去除魷魚軟骨中的多糖。

圖2　不同試劑對(duì)魷魚軟骨中硫酸軟骨素的去除效果Fig.2　Effect of different reagents on removing chondroitin sulfate of squid cartilage

采用堿法去除多糖， 濃堿(4% NaOH)較稀堿(4‰ NaOH)效果更好， 原因在于硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)結(jié)合的O-糖苷鍵可在強(qiáng)堿作用下發(fā)生β-消去反應(yīng)， 使糖-肽鍵斷裂， 硫酸軟骨素從蛋白多糖中釋放出來， 濃堿法的堿性更強(qiáng)， 有利于硫酸軟骨素的降解[10]。魷魚軟骨經(jīng)濃堿處理24 h后， 硫酸軟骨素含量低于1%。

本文選用4%(w/w)NaOH溶液去除軟骨中的多糖， 料液比(w/v)1:20， 處理時(shí)間24 h， 每隔6 h更換一次NaOH溶液液。

2.1.2魷魚軟骨脫灰處理

圖3表明， 0.5M EDTA(pH 8.0)溶液脫灰效果顯著好于HCl(pH 2.0)溶液。EDTA是一種螯合劑， 可與軟骨中的Ca2+、 Mg2+離子結(jié)合， 形成水溶性絡(luò)合物。經(jīng)過EDTA溶液4次脫灰處理后， 魷魚軟骨中灰分含量只有0.38%。

故選取0.5M EDTA(pH 8.0)溶液作為脫灰劑， 料液比(w/v)1:20， 脫灰時(shí)間24 h， 每隔6 h更換一次EDTA溶液。

軟骨粉經(jīng)4%(w/w)NaOH溶液和0.5 M EDTA(pH 8.0)溶液處理后， 加入0.5 M乙酸溶液和0.2%胃蛋白酶4 ℃水解48 h， NaCl鹽析， 純水透析， 凍干， 制得II型膠原蛋白。

圖3　不同試劑對(duì)魷魚軟骨的脫灰效果Fig.3　Effect of different reagents on deliming of squid cartilage

2.2II型膠原蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.2.1魷魚軟骨II型膠原蛋白氨基酸組成

魷魚軟骨II型膠原蛋白氨基酸組成如表2所示， 含量以每1 000個(gè)總氨基酸殘基中的殘基數(shù)表示。

表2　魷魚軟骨II型膠原蛋白的氨基酸組成Tab.2　Amino acid composition of type II collagen from squid cartilage

表2表明， II型膠原蛋白中不含色氨酸， 芳香族氨基酸含量較少； 甘氨酸含量為34.1%， 約占總氨基酸的1/3； 羥脯氨酸和脯氨酸含量較高， 具有膠原蛋白的典型特征。

2.2.2紫外吸收光譜分析

魷魚軟骨II型膠原蛋白的紫外吸收光譜如圖4所示。

圖4　魷魚軟骨II型膠原蛋白紫外吸收光譜Fig.4　The UV spectrum of type II collagen from squid cartilage

由圖4可見， 魷魚軟骨II型膠原蛋白在224.5 nm處出現(xiàn)最大吸收峰， 此吸收峰與多肽鏈的氨基酸組成和螺旋程度相關(guān)[11]， 是膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的特征UV圖譜譜型[12]。曹慧、 陸雪芹等制備的雞軟骨II型膠原紫外吸收在220 nm[6， 13]， 與魷魚軟骨II型膠原相近。由于II型膠原中色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸等芳香族氨基酸含量很少， 在250 nm～280 nm區(qū)間未出現(xiàn)明顯紫外吸收峰， 與氨基酸組成相一致。

2.2.3SDS-PAGE 電泳分析

魷魚軟骨II型膠原蛋白電泳圖譜如圖5所示。樣品條帶分子量分別為條帶1： 301 kDa， 條帶2： 196 kDa， 條帶3： 112 kDa。

圖5　魷魚軟骨II型膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5　SDS-PAGE spectrum of type II collagen from squid cartilage

如圖5， SDS-PAGE圖譜中有3個(gè)條帶， 未見其它明顯雜帶， 表明制備的II型膠原蛋白樣品純度較高， 有三條相同α1鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)。其中， 樣品條帶1為未解螺旋的II型膠原， 即(α1)3； 樣品條帶2為兩條α1鏈組成的β二聚體； 樣品條帶3為單條II型膠原α1鏈。魷魚軟骨II型膠原蛋白的分子量為112 kDa， 與雞、 豬、 羊等來源II型膠原分子量相接近[14]。

2.2.4電鏡掃描(SEM)分析

魷魚軟骨II型膠原蛋白電鏡掃描圖， 如圖6所示。

圖6　魷魚軟骨II型膠原蛋白電鏡掃描圖Fig.6　Scanning Electron Microscope of type II collagen from squid cartilage

電鏡掃描圖A顯示， 魷魚軟骨II型膠原蛋白由膠原纖維組成， 圖B可看出膠原蛋白分子平行排列集聚形成纖維束， 是具有三螺旋結(jié)構(gòu)的成纖膠原蛋白的特征之一[15]。

3　結(jié)論

魷魚軟骨II型膠原含量豐富， 是一種理想的制備II型膠原蛋白的材料， 軟骨中的多糖等非膠原成分則不利于II型膠原的提取， 須進(jìn)行除糖脫灰等前處理。將魷魚軟骨凍干后粉碎成200目軟骨粉， 用4%(w/w)NaOH溶液去除蛋白多糖， 0.5 M EDTA溶液進(jìn)行脫灰， 效果顯著。將軟骨凍干后在低溫下粉碎， 不會(huì)使II型膠原因高溫變性， 經(jīng)過前處理的魷魚軟骨粉， 能快速提取出II型膠原蛋白。酶解提取時(shí)間過長導(dǎo)致溶出的II型膠原降解成小分子蛋白， II型膠原得率降低， 本文膠原提取時(shí)間48 h。

本方法可有效提取魷魚軟骨II型膠原蛋白， 凍干的II型膠原蛋白為白色海綿狀， 疏松多孔， 有光澤， 不溶于水， 可溶于稀醋酸。經(jīng)真空冷凍干燥的II型膠原蛋白可保持膠原原有的理化性質(zhì)和生物活性[16]， 水分含量少， 有利于長時(shí)間存放。II型膠原蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE、 紫外光譜、 電鏡掃描檢測(cè)， 具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)， 由3條相同的α1鏈構(gòu)成， 分子量為112 kDa。

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Extracting Technology and Structure Characterization of Type II Collagen from Squid Cartilage

GUO Xiuyu，HE Lan，WEI Xiaojuan，WANG Nanping

Aquatic Products Processing Lab，Shanghai Fisheries Research Institute(Shanghai, 200433)

ObjectiveExtract and purify native type II collagen from squid cartilage, and characterize its structure.MethodsFreeze-dry squid cartilage and pulverize them to 200 mesh powder, pretreat the powder with 4% (w/w) NaOH solution and 0.5 M EDTA solution to remove polysaccharides and deliming, and then pepsin hydrolys, NaCl dialyzed with purified water and freeze-dried are used to obtain the type II collagen. The collagen was characterized by amino acid composition analysis, SDS-PAGE electrophoresis, UV absorption spectra, and scanning electron microscopy.ResultsThe type II collagen prepared from squid cartilage possesses three α1 chain, and the molecular weight of it is 112 kDa. In addition, it shows maximum UV absorption at 224.5 nm, and performs triple helix characteristic.

squid, cartilage, type II collagen, structure

10.3969/j.issn.1674-1242.2016.01.001

郭休玉，工程師，主要從事水產(chǎn)品精深加工，

E-mail: 10042724@163.com

TS254.4

A

1674-1242(2016)01-0001-05

2015-11-23)