唐海淑，杜相品，甫爾哈提·吾守爾，范新春，關(guān)　靜 綜述,崔　惠 審校

(新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心免疫規(guī)劃科，烏魯木齊 830011)

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·綜述·

脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的應(yīng)用與發(fā)展

唐海淑，杜相品，甫爾哈提·吾守爾，范新春，關(guān)靜 綜述,崔惠 審校

(新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心免疫規(guī)劃科，烏魯木齊 830011)

脊髓灰質(zhì)炎病毒；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；應(yīng)用發(fā)展

1996年美國(guó)Applied Biosystems公司推出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[1-2]。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，可動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸產(chǎn)物的形成，無(wú)需后處理過(guò)程，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，而且具有直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、速度快、全封閉和易操作等優(yōu)點(diǎn)，因而目前已得到廣泛應(yīng)用[3-4]。

2011年8月新疆維吾爾自治區(qū)局部地區(qū)發(fā)生輸入性脊髓灰質(zhì)炎野病毒(WPV)的疫情后，為了縮短檢測(cè)時(shí)限，中國(guó)決定從2013年起在脊髓灰質(zhì)炎(下稱脊灰)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)啟用世界衛(wèi)生組織推薦的脊灰病毒(PV)分離新的檢測(cè)流程。新檢測(cè)流程要求省級(jí)脊灰實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)培訓(xùn)考核合格后，使用美國(guó)疾病預(yù)防和控制中心研制的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rRT-PCR)試劑和方法，對(duì)分離出的PV進(jìn)行型內(nèi)鑒定(ITD)。

1　實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法

1.1工作原理根據(jù)原理的不同，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法主要分為利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物增加的探針類和利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加非探針類2種[5]。熒光染料技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板DNA進(jìn)行分析的1種方法[6]。熒光染料法是利用熒光染料染色DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中，當(dāng)熒光染料處于游離狀態(tài)時(shí)，檢測(cè)不到熒光信號(hào)，當(dāng)它與dsDNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，即被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到，熒光信號(hào)強(qiáng)度的增加是與初始模板量相關(guān)的，由此可以進(jìn)行定量 DNA分析[7]。熒光染料目前主要有Pico Green和SYBR Green[8]。PV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR采用的是TaqMan熒光探針?lè)ā?/p>

1.2定量原理實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的量呈正相關(guān)，即每擴(kuò)增1條DNA鏈，就有1個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到1條熒光擴(kuò)增曲線圖[9]。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可分為3個(gè)階段：熒光本底信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)，在指數(shù)增長(zhǎng)階段，每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系組成成分的消耗，反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期[10]。熒光信號(hào)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)之間存在線性關(guān)系，可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并由此推斷模板最初值與起始模板量的含量[11]。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，PCR擴(kuò)增時(shí)利用Taq DNA聚合酶的5′～3′外切酶活性將探針?biāo)獬蓡魏塑账?，游離的熒光報(bào)告基團(tuán)導(dǎo)致熒光信號(hào)的增加，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，設(shè)定一定的熒光信號(hào)域值[12-13]。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值，就被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)Ct(C代表循環(huán)cycle,t代表域值threshold)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越大，Ct值越小[14]。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)[15]。

2012年3月，新疆脊灰實(shí)驗(yàn)室與部分中國(guó)脊灰網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的成員接受了由世界衛(wèi)生組織和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒所國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室共同主辦的rRT-PCR型內(nèi)鑒定方法的培訓(xùn)，9月順利完成考核，取得了型內(nèi)鑒定實(shí)驗(yàn)室的資質(zhì)，隨后，PV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法便在中國(guó)脊灰網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室中普遍應(yīng)用并逐步發(fā)展?；诿绹?guó)ABI公司的7500型熒光定量RT-PCR儀完成的PV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法包括型內(nèi)鑒定(ITD)rRT-PCR和疫苗衍生株(VDPV)篩查rRT-PCR。通過(guò)ITD rRT-PCR反應(yīng)可鑒別PV的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ血清型，VDPV rRT-PCR反應(yīng)可鑒別其疫苗類似株(SL)、疫苗衍生株(VDPV)和野毒株(WPV)。

2　實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的應(yīng)用和發(fā)展

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法在脊灰實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)中應(yīng)用后經(jīng)歷了3次發(fā)展，從擴(kuò)增條件的優(yōu)化到擴(kuò)增試劑的發(fā)展，都體現(xiàn)了該方法經(jīng)過(guò)不斷的優(yōu)化和發(fā)展提高了PV型內(nèi)鑒定的準(zhǔn)確性、敏感性和快速性，同時(shí)也減少了PV的漏檢。方法2相比方法1，增加了逆轉(zhuǎn)錄階段的循環(huán)，雖然該方法擴(kuò)增時(shí)間延長(zhǎng)了，但卻增加了敏感性，Ct值明顯減小，且擴(kuò)增曲線容易判斷；方法1和方法2的ITD rRT-PCR和VDPV rRT-PCR反應(yīng)條件各不相同。鑒于Ⅱ型WPV已在全球范圍內(nèi)消滅，因而方法3的試劑中去除了Ⅱ型WPV的引物和探針，同時(shí)增加了Ⅰ型WPV和Ⅲ型WPV的全球流行分支的鑒別引物和探針，使得PV的鑒別更加符合具體情況，同時(shí)，rRT-PCR反應(yīng)和VDPV rRT-PCR反應(yīng)在相同的條件下進(jìn)行，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了操作步驟。幾種方法的比較見(jiàn)表1。

表1　　PV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的發(fā)展

3　小　　結(jié)

中國(guó)脊灰實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)在應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法之前，對(duì)PV的血清型鑒定采用血清中和定型試驗(yàn)。通過(guò)中和試驗(yàn)，可鑒定出PV的血清型，并可將混合血清型的病毒中和成單一血清型，但此法要求在敏感細(xì)胞中進(jìn)行，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且無(wú)法判斷PV的基因型[16-18]。PV不斷發(fā)展的3種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法不需要提取核酸，只需直接將病毒分離物作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增反應(yīng)和分析在完全閉管的條件下進(jìn)行，有效防止了PCR產(chǎn)物的污染；分析過(guò)程由PCR儀完成，無(wú)需再進(jìn)行電泳和紫外燈觀察，減少了操作步驟，提高了效率，同時(shí)也提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性[19-21]。病毒分離培養(yǎng)方法是PV等腸道病毒分離鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，此法繁瑣復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)，所以不能用于臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)[22]。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR跟傳統(tǒng)病毒分離培養(yǎng)方法比較，具有快速、靈敏、特異的特點(diǎn)，但目前實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法仍無(wú)法取代病毒分離，只能作為病毒分離的輔助和補(bǔ)充手段。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)為了不漏檢任何1株VDPV，在增加檢測(cè)敏感性的同時(shí)，就導(dǎo)致了一定的假陽(yáng)性率，尤其是Ⅱ型VDPV。方法2與方法1相比，反應(yīng)試劑相同，只是增加了擴(kuò)增條件的逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)，這導(dǎo)致了檢測(cè)的敏感性有所增加，但假陽(yáng)性率也增高了，Ⅱ型VDPV假陽(yáng)性率增高得尤為明顯；方法3對(duì)反應(yīng)試劑和擴(kuò)增條件都進(jìn)行了改良，Ⅰ型和Ⅲ型VDPV檢測(cè)的精確性大大提高了，檢測(cè)的30株Ⅰ型PV，已經(jīng)沒(méi)有VDPV的假陽(yáng)性率，70株Ⅲ型PV其VDPV的假陽(yáng)性率已經(jīng)降低到2.8%，Ⅱ型PV的VDPV假陽(yáng)性率也明顯降低，但仍然高達(dá)42.4%，這可能與Ⅱ型PV的突變熱點(diǎn)較多，引物設(shè)計(jì)很難完全覆蓋所有的突變位點(diǎn)有關(guān)[23-24]。

目前實(shí)時(shí)熒光PCR定量分析技術(shù)，己成為公認(rèn)的最具應(yīng)用前景的靶模板拷貝數(shù)的定量分析技術(shù)，在基因表達(dá)、基因工程、藥物療效、病原體檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[25]。但PV的rRT-PCR方法需要繼續(xù)發(fā)展改良，以降低Ⅱ型VDPV的假陽(yáng)性率，以便更加全面地適用于中國(guó)脊灰實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)。

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