周洪經(jīng)，郭明日，馮　爽，張麗霞△

(1.天津市海河醫(yī)院檢驗科　300350；2.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)防治傳染病重點研究室，天津 300350)

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·論著·

Xpert MTB/RIF在快速診斷肺結(jié)核及利福平耐藥中的臨床應(yīng)用

周洪經(jīng)1,2，郭明日1，馮爽1，張麗霞1△

(1.天津市海河醫(yī)院檢驗科300350；2.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)防治傳染病重點研究室，天津 300350)

目的探討利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(Xpert MTB/RIF)在肺結(jié)核診斷及其耐藥性檢測中的臨床應(yīng)用價值。方法收集408例結(jié)核患者標(biāo)本，同時采用抗酸染色法、固體培養(yǎng)法及Xpert MTB/RIF檢測，并對其結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果408例標(biāo)本抗酸染色法、固體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測出結(jié)核分枝桿菌的陽性率分別為25.00%(102/408)、42.16%(172/408)和58.09%(237/408)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，Xpert MTB/RIF陽性率高于抗酸染色法和固體培養(yǎng)法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，固體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測均為陽性的標(biāo)本共168例，經(jīng)比例法藥物敏感試驗與Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥率分別為26.19%(44/168)和27.38%(46/168)，2種方法耐藥率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，以比例法藥敏試驗作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的敏感度為97.73%(43/44)，特異性為97.58%(121/124)。結(jié)論Xpert MTB/RIF可快速、準(zhǔn)確檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

結(jié)核分枝桿菌;Xpert MTB/RIF;耐藥

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染性疾病，據(jù)2010年全國第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，全國活動性肺結(jié)核患者高達(dá)499萬例，每年新發(fā)結(jié)核患者約100萬例[1]。實驗室檢查為結(jié)核病的確診提供病原學(xué)證據(jù)，也是確診傳染性結(jié)核尤其是耐多藥結(jié)核病的重要依據(jù)。目前，我國對結(jié)核病的診斷主要依賴于傳統(tǒng)的抗酸染色法和培養(yǎng)法，這些診斷方法的敏感度及特異度較低，且耗時耗力，無法滿足臨床需要，因而，迫切需要1種早期、快速、準(zhǔn)確診斷結(jié)核病及其耐藥性的方法。新型的實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(Xpert MTB/RIF)全自動檢測系統(tǒng)以全自動半巢式實時聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因為靶基因，可在2 h內(nèi)同時檢測MTB和利福平耐藥，該方法于2010年12月世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)用于MTB及多重耐藥MTB(MDR-TB)的快速診斷。本文采用Xpert MTB/RIF系統(tǒng)對肺結(jié)核患者M(jìn)TB及其對利福平耐藥性進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)的檢測方法進(jìn)行對比分析，評價Xpert MTB/RIF技術(shù)在結(jié)核病快速診斷中的應(yīng)用價值。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2015年1月至2016年1月期間在海河醫(yī)院治療的結(jié)核病患者408例，其中，痰標(biāo)本276例，灌洗液132例。

1.2儀器與試劑Xpert MTB/RIF反應(yīng)盒及SR標(biāo)本處理液(美國Cepheid公司)； 分枝桿菌涂片鏡檢萋尼染色液、酸性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法所有標(biāo)本均同時進(jìn)行萋尼抗酸染色、固體培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測。

1.3.1抗酸染色法采用離心濃縮法，參照《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[2]。鏡檢結(jié)果根據(jù)抗酸菌量多少判讀為4+、3+、2+、1+、1～8條、陰性。

1.3.2固體培養(yǎng)法采用中和離心法。痰標(biāo)本置于50 mL離心管中，加入2倍體積4% NaOH渦旋振蕩1 min，室溫靜置20 min，加入磷酸鹽緩沖液(pH6.8)至50 mL，3 000 r/min離心20 min，棄上清；灌洗液直接3 000 r/min離心20 min，棄上清。沉淀加入1～2 mL磷酸鹽緩沖液，混懸接種于羅氏固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種后第3、7天觀察培養(yǎng)情況，以后每周觀察1次，并記錄生長情況。

1.3.3藥物敏感性試驗制備1 mg/mL菌懸液，梯度稀釋為10-2和10-4mg/mL，接種到含RIF(40 μg/mL)的羅氏固體培養(yǎng)基和空白對照管培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4周，觀察結(jié)果。每批藥物敏感性試驗用H37Rv作為敏感對照，以評價含藥培養(yǎng)基質(zhì)量。

1.3.4Xpert MTB/RIF核酸擴(kuò)增檢測取1 mL痰標(biāo)本加入前處理管中，視樣本性狀加入2倍樣本體積的SR處理液,灌洗液經(jīng)離心后加入2 mL SR處理液，渦旋振蕩15～30 s,靜置15 min。吸取2 mL處理后樣本緩慢加入反應(yīng)盒,放入檢測模塊開始進(jìn)行自動化檢測。對MTB結(jié)果判讀根據(jù)DNA拷貝的高低分為高、中、低、極低和未檢測出5個等級；RIF藥敏結(jié)果分為：RIF Resistance檢出，RIF耐藥和RIF Resistance未檢出，RIF敏感。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,率之間比較采用χ2檢驗和確切概率法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.13種檢測方法陽性結(jié)果比較408例標(biāo)本均同時采用抗酸染色法、固體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測，其陽性率分別為25.00%(102/408)、42.16%(172/408)和58.09%(237/408)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，Xpert MTB/RIF與抗酸染色法陽性率比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與固體培養(yǎng)法陽性率比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Xpert MTB/RIF檢測MTB的陽性率高于抗酸染色法和固體培養(yǎng)法，結(jié)果見表1。

276例痰標(biāo)本經(jīng)抗酸染色法、固體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測的陽性率分別為27.53%(76/276)、43.84%(121/276)、57.61%(159/276)；132例灌洗液經(jīng)3種方法檢測的陽性率分別為19.70%(26/132)、38.63%(51/132)、59.09%(78/132)。Xpert MTB/RIF檢測痰標(biāo)本與灌洗液標(biāo)本陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1　　3種檢測方法陽性結(jié)果比較(n)

2.2Xpert MTB/RIF與抗酸染色法檢出菌量比較276例痰標(biāo)本中，Xpert MTB/RIF檢測高、中、低、極低、未檢測出5個量級的例數(shù)和抗酸染色檢測為4+、3+、2+、1+、1～8條、陰性的例數(shù)詳見表2。Xpert MTB/RIF檢測“高”量級25例中涂片染色有2例為陰性，“中”量級69例中涂片染色有21例為陰性，“低”量級42例中涂片染色有37例為陰性，“極低”量級23例中涂片染色檢測全部為陰性。

表2　　痰標(biāo)本中Xpert MTB/RIF與抗酸

132例灌洗液標(biāo)本中Xpert MTB/RIF檢測高、中、低、極低、未檢測出5個量級的例數(shù)以及抗酸染色法檢測為4+、3+、2+、1+、1～8條、陰性的例數(shù)見表3。Xpert MTB/RIF檢測“高”量級5例中涂片染色全部為陽性，“中”量級16例中涂片染色有4例為陰性，“低”量級24例中涂片染色有16例為陰性，“極低”量級33例中涂片染色檢測全部為陰性。

表3　　灌洗液標(biāo)本中Xpert MTB/RIF法與

表4　　Xpert MTB/RIF與比例法檢測利福平耐藥性比較(n)

2.3Xpert MTB/RIF與比例法檢測利福平耐藥性比較固體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測均為陽性的標(biāo)本共168例，比例法藥物敏感試驗與Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥菌分別為44例和46例，耐藥率分別為26.19%(44/168)和27.38%(46/168)，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥率與比例法相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2種方法檢測利福平都耐藥的菌株有43例，均為敏感的菌株121例，以比例法藥物敏感試驗作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的敏感度為97.73%(43/44)，特異性為97.58%(121/124)，檢測結(jié)果見表4。

3　討　　論

傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法的敏感度和特異度較低且耗時耗力，無法滿足臨床需要，近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,越來越多的分子診斷技術(shù)不斷涌現(xiàn),Xpert MTB/RIF技術(shù)便是其中之一。該技術(shù)是將PCR所需的3個步驟即樣本準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測集于一體的實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù),操作簡便，試驗中基本不產(chǎn)生氣溶膠，極大程度地減少了操作中污染的可能性。該方法自動運(yùn)行并檢測是否為MTB及是否對RIF耐藥，快速、簡便完成整個試驗約2 h。

本文對408例結(jié)核患者標(biāo)本同時采用抗酸染色法、固體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測，Xpert MTB/RIF法具有更高的敏感度及特異度[3-4]。Xpert MTB/RIF檢測痰標(biāo)本與灌洗液標(biāo)本陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這與相關(guān)的報道基本一致[5-6]。表2、3顯示，Xpert MTB/RIF檢測為“低”和“極低”2個量級的標(biāo)本，抗酸染色法的陽性率極低，這與國外報道類似[7-8]。表1中有1例抗酸染色法和培養(yǎng)陽性而Xpert MTB/RIF檢測為陰性的標(biāo)本，后經(jīng)菌種鑒定為胞內(nèi)分枝桿菌。

傳統(tǒng)的MTB藥敏試驗需要進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)，耗時長達(dá)2個月，而Xpert MTB/RIF可快速測定對利福平的耐藥情況，并且具有較高的符合率，為臨床選擇藥物治療提供重要依據(jù)。對于Xpert MTB/RIF與比例法檢測RIF耐藥結(jié)果不一致的4株菌，可能與藥物敏感性試驗的控制條件不良有關(guān)，也可能與某些基因位點突變的低水平耐藥相關(guān)[9]。

綜上所述，Xpert MTB/RIF具有敏感度及特異度高、檢出時間短的優(yōu)勢，適用于抗酸染色陰性的可疑結(jié)核病患者的快速診斷，并且與參考方法的藥敏試驗結(jié)果有較高的符合率。

[1]全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志,2012,34(8):485-508.

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Application of Xpert MTB/RIF assay on rapid detection of MTB and rifampin-resistant

ZHOUHongjing1,2，GUOMingri1，F(xiàn)ENGShuang1，ZHANGLixia1△

(1.LaboratoryMedicalofHaiheHospital,Tianjin300350;2.StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineKeyLaboratoryofInfectionsDiseasePreventionandControl,Tianjin300350)

ObjectiveTo investigate clinical value of Xpert MTB/RIF assay on rapid detection of MTB and rifampin-resistant.Methods408 cases of tuberculosis were detected by acid-fast stain,Solid culture and Xpert MTB/RIF,the results were compared.ResultsAll the samples were detected by acid-fast stain,culture and Xpert MTB/RIF assay,the positive rates were 25.00%(102/408),42.16%(172/408) and 58.09%(237/408)，respectively.The positive rates of Xpert MTB/RIF assay were higher than acid-fast stain and culture method,and the difference is statistically significant(P<0.05).There are 168 cases of specimen which were tested positively by both culture and Xpert MTB/RIF,the RIF resistance rates from standard drug susceptibility testing and Xpert MTB/RIF assay respectively were 26.19%(44/168) and 27.38%(46/168),and had no statistical significance(P>0.05).According to the result of drug susceptibility with proportion method,the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF in detecting RIF resistance were 97.73%(43/44) and 97.58%(121/124).ConclusionXpert MTB /RIF can quickly and accurately detect MTB and RIF resistance,it has important clinical significance.

Mycobacterium tuberculosis；Xpert MTB/RIF；drug-resistance

周洪經(jīng)，女，技師，主要從事病原微生物學(xué)方面的研究。△

，E-mail：zhouhj85@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.024

A

1673-4130(2016)18-2568-03

2016-04-27

2016-07-05)