陳　磊　俞雪鋒　姚曉敏▲

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，浙江寧波315100

垂盆草不同極性部位體外抗氧化活性的研究

陳磊1,2俞雪鋒2姚曉敏2▲

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，浙江寧波315100

目的研究垂盆草80%乙醇提取物不同極性部位的體外抗氧化活性。方法采用5種不同極性溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水）萃取得到5種萃取物，通過總還原能力、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和ABTS自由基清除能力4種方法對各萃取物的抗氧化能力進(jìn)行研究。結(jié)果垂盆草不同極性部位提取物均具有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取部位的抗氧化能力最強，在總還原能力和清除DPPH自由基上，乙酸乙酯萃取部位作用明顯強于其他四個極性部位，其清除ABTS自由基的半數(shù)濃度IC50為0.0131 mg/mL，清除羥基自由基的半數(shù)濃度IC50為1.0730 mg/mL。結(jié)論垂盆草醇提物的乙酸乙酯萃取部位具有較強的抗氧化活性，本研究為擴展垂盆草的應(yīng)用范圍和進(jìn)一步研究其抗氧化活性成分提供了理論依據(jù)。

垂盆草；萃取物；抗氧化；自由基

［Abstract］Objective To study the in vivo antioxidant activity of parts with different polarity of the sedum sarmentosum 80%ethanol extract.Methods 5 extracts were obtained by 5 solvent with different polarity（petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n-butyl alcohol and water）and the antioxidant activity of each extract were studied by total reducing capacity，clearance capacity of DPPH free radicals，clearance capacity of hydroxyl radical and the clearance capacity of ABTS free radicals.Results Certain antioxidant activity was presented in the extracts of sedum sarmentosum parts with different polarity，and the activity of extract obtained by ethyl acetate was the strongest and was significantly stronger than the other four extracts in the respect of total reducing capacity and clearance capacity of DPPH free radicals.The IC50of clearing ABTS free radicals was 0.0131mg/mL and the IC50of clearing hydroxyl radicals was 1.0730 mg/mL. Conclusion Sedum sarmentosum extract obtained by ethyl acetate presents the strongest antioxidant activity and the study provide theoretical evidence for the extension of application range of sedum sarmentosum and further study of the antioxidant activity components.

［Key words］Sedum sarmentosum；Extract；Antioxidant；Free radical

人體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，正常情況下，自由基的生成與消除維持著一種動態(tài)平衡，但是當(dāng)這種平衡被破壞時就會引起體內(nèi)自由基的過量積累，從而對人體造成傷害，如腫瘤、心血管疾病等的發(fā)生均與自由基的過量積累及其誘導(dǎo)的系列氧化反應(yīng)有著密切的聯(lián)系［1，2］。目前，有研究表明中藥的功效與其抗氧化作用有著緊密的聯(lián)系，中藥的黃酮、酚類、皂苷、多糖等物質(zhì)均具有良好的抗氧化活性［3，4］，因此，研究中草藥的抗氧化活性具有十分重要的意義。

垂盆草為景天科（Crassulaceae）植物垂盆草（Sedum sarmentosum Bunge）的新鮮或干燥全草，收載于2010版《中國藥典》，其性涼，味甘、淡，具有利濕退黃、清熱解毒的功效［5］。臨床上多用于治療黃疸、急慢性肝炎和蛇傷燙傷等［6］。國內(nèi)外研究表明垂盆草主要含有黃酮、三萜、甾醇、生物堿、氰苷、糖類等成分［7，8］，其具有保護肝臟、抗腫瘤、免疫抑制和抑菌等藥理作用［9-11］。目前，關(guān)于垂盆草提取物及其不同極性部位的抗氧化活性研究尚未見報道。因此，本文通過總還原能力、清除DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基比較垂盆草醇提物及其不同極性部位之間的抗氧化活性能力，旨在為系統(tǒng)開發(fā)垂盆草植物資源在食品、藥品和保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供一些理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗原料垂盆草購自寧波鄞州醫(yī)藥藥材有限公司，并由中藥專業(yè)王和平教授鑒定為景天科植物垂盆草（Sedum sarmentosum Bunge）。

1.1.2主要試劑1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，日本東京化成工業(yè)株式會社，批號：08110127）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，Sigma公司，批號：A9941）；抗壞血酸（Vc，上海國藥集團，批號：20120902）；無水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20151103）；石油醚（天津博迪化工股份有限公司，批號：20150701）；三氯甲烷（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20150703）；乙酸乙酯（天津博迪化工股份有限公司，批號：20160110）；正丁醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20160113）；鐵氰化鉀（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20150311）；磷酸氫二鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20141119）；磷酸二氫鈉（天津市北辰方正試劑廠，批號：20150503）；氯化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20140312）；三氯化鐵（天津市化學(xué)試劑廠，20151114）；硫酸亞鐵（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20140729）；水楊酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20141103）；三氯乙酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：F20050624）；過硫酸鉀（Sigma公司，批號：216224）；30%過氧化氫（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20160104）。

1.1.3實驗儀器JFSD-100粉碎機（北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DHG-9070A烘干箱（寧波江南儀器廠）；UV-1240紫外可見分光光度計（日本島津公司）；DK-S26數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市維誠實驗器材廠）；JA26038電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；80-2B離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2實驗方法

1.2.1樣品制備垂盆草干燥全草粉碎后過60目篩，得到垂盆草粉末。取500 g垂盆草粉末，按料液比1∶20，加入80%乙醇浸泡24 h，在室溫條件下超聲波輔助提取1 h，過濾，濾渣按上述條件重復(fù)提取2次，將3次得到的濾液在50℃條件下減壓濃縮成浸膏。取部分浸膏進(jìn)行冷凍干燥，得到粗提物的干樣。將剩余浸膏用水打散，按極性由小到大順序依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每個極性部位萃取3次，減壓濃縮后冷凍干燥得到石油醚層、三氯甲烷層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層5個干樣，干樣稱重后密封保存于4℃冰箱內(nèi)待用。

1.2.2總還原能力測定［12］量取不同濃度的各樣品溶液1.0 mL于各試管中，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6） 2.5 mL和鐵氰化鉀溶液（濃度1%）2.5 mL，在50℃條件下保溫20 min，再加入三氯乙酸溶液（濃度10%）2.5 mL，隨后在3000 rpm條件下離心10 min，量取上清液2.5 mL，加入三氯化鐵溶液（濃度0.1%）0.5 mL和蒸餾水2.5 mL，于700 nm處測定吸光度值，以其吸光度值的大小反映還原能力的大小。以Vc溶液作為對照組，以上實驗平行測定3次。

1.2.3清除DPPH自由基能力測定［13］取不同濃度的各樣品溶液2.0 mL加入DPPH溶液（0.08 mg/mL）2 mL，搖勻，于室溫避光條件下靜置20 min，于517 nm波長處測定吸光度值。以Vc作為陽性對照，以上實驗平行測定3次，求其平均值。DPPH自由基的清除率計算公式為：

DPPH自由基的清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%

式中：A0為乙醇+DPPH溶液；A1為樣品溶液+ DPPH溶液；A2為樣品溶液+乙醇。

1.2.4清除羥基自由基能力的測定［14］水楊酸作為Fenton試劑反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的捕劑，對垂盆草不同極性部位的抗氧化活性進(jìn)行篩選。向試管中加入不同濃度的各樣品溶液2.0 mL，再加入0.01 mol/L硫酸亞鐵溶液2.0 mL和0.01 mol/L水楊酸-乙醇2.0 mL，最后再加0.1 mL 0.03%的H2O2啟動反應(yīng)，搖勻，37℃條件下保溫30 min，于510 nm波長處測定吸光度值。用Vc作為陽性對照，以上實驗平行測定3次，求其平均值。羥基自由基清除率計算公式為：

羥基自由基清除率（%）=［1-（A4-A5）/A3］×100%

式中：A3為蒸餾水代替樣品溶液時的吸光度值；A4為加入樣品后的吸光度值；A5為蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液的吸光度。

1.2.5清除ABTS自由基能力測定［14，15］配制7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，取等體積的兩種溶液混合，在室溫條件下避光反應(yīng)12～16 h，配制成ABTS·+的儲備液。臨用前用95%乙醇稀釋，使其在734 nm波長處的吸光度值為（0.70±0.02），此時得到ABTS自由基工作液。在試管中加入100 μL不同濃度的各樣品溶液，再加入3.9 mL的ABTS自由基工作液，搖勻，室溫下反應(yīng)10 min，于734 nm波長處測定吸光度值。用Vc作為陽性對照，以上實驗平行測定3次，求其平均值。ABTS自由基清除率計算公式為：

ABTS自由基的清除率（%）=［1-（A7-A8）/A6］×100%

式中：A6為乙醇代替樣品溶液測得吸光度值；A7為加入樣品后的吸光度值；A8為乙醇溶液代替ABTS溶液測得吸光度值。

2　結(jié)果

2.1垂盆草不同極性部位得率比較

垂盆草正丁醇萃取部位得率最高，可達(dá)29.76%，剩余水層得率次之為26.80%，乙酸乙酯萃取部位的得率最低為9.83%。石油醚和三氯甲烷萃取部位的得率相對較低，分別是18.34%、15.27%。見表1。

2.2垂盆草不同極性部位總還原能力比較

抗氧化物質(zhì)的活性與其還原能力有著緊密的聯(lián)系，還原能力越強，其抗氧化能力就越強，還原能力的強弱與其濃度呈正相關(guān)，因此，樣品濃度越大，吸光度值越大，則還原能力越強［16］。如圖1和表1所示，垂盆草醇提物及其不同極性部位均表現(xiàn)出不同程度的還原能力，且還原能力在實驗濃度范圍內(nèi)隨著溶液濃度增加而增強，呈正相關(guān)性，但均小于Vc。當(dāng)溶液濃度為0.5 mg/mL時，乙酸乙酯部分的還原能力明顯高于其他極性部位，正丁醇部分次之，還原能力順序為：Vc＞乙酸乙酯部分＞正丁醇部分＞三氯甲烷部分＞粗提物＞石油醚部分＞水提部分。

圖1　垂盆草不同極性部位還原能力比較

2.3垂盆草不同極性部位對DPPH自由基清除作用比較

在體外抗氧化活性研究中，最常見的是DPPH自由基的清除，其原理是DPPH在溶液中生成一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，且溶液呈紫色，在517 nm波長處有特征吸收峰，當(dāng)DPPH溶液中加入抗氧化物質(zhì)時，抗氧化物質(zhì)將電子和質(zhì)子傳遞給DPPH自由基，生成穩(wěn)定的分子態(tài)DPPH2，從而使DPPH溶液紫色消退，吸光譜強度隨加入的抗氧化物質(zhì)的量的增加而減小。因此，加入被測樣品后，被測樣品清除DPPH自由基而引起吸光度值的減少，通過計算自由基清除率，可評價其抗氧化能力的強弱［17］。由圖2和表1可知，垂盆草醇提物及其不同極性部位對DPPH自由基均有較強的清除作用。當(dāng)溶液濃度為0.5 mg/mL時，垂盆草各提取部分及Vc清除DPPH自由基能力的順序依次為：乙酸乙酯部分＞Vc＞正丁醇部分＞石油醚部分＞三氯甲烷部分＞粗提物＞水提部分。乙酸乙酯部分和正丁醇部分均具有較強的體外抗氧化活性，且乙酸乙酯部分對DPPH自由基的清除作用強于Vc，而正丁醇部分的作用與Vc接近。

2.4垂盆草不同極性部位對羥基自由基（·OH）的清除作用比較

羥基自由基是目前已知對人體毒性最強、危害最大的一種自由基，幾乎能與所有的生物大分子發(fā)生反應(yīng)［18］。本實驗以水楊酸作為Fenton試劑反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的捕劑，對垂盆草各極性部位的抗氧化活性進(jìn)行篩選。由圖3和表1可知，隨著垂盆草不同提取部分質(zhì)量濃度的增加，清除OH能力逐步提高，但均弱于同質(zhì)量濃度的Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，水提部分對OH清除率達(dá)到43.10%，乙酸乙酯的清除率也達(dá)39.90%，其他極性部位則表現(xiàn)出較低的清除OH的能力，水提部分和乙酸乙酯部分的IC50值為0.7647、1.0730 mg/mL，垂盆草不同提取物清除OH的能力由強到弱依次為水提物＞乙酸乙酯部分＞粗提物＞石油醚部分＞正丁醇部分＞三氯甲烷部分。

圖2　垂盆草不同極性部位對DPPH自由基的清除率比較

圖3　垂盆草不同極性部位對羥基自由基的清除率比較

2.5垂盆草不同極性部位對ABTS自由基（ABTS·+）的清除作用比較

ABTS是一種自由基引發(fā)劑，經(jīng)活性氧反應(yīng)后生成一種穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS·+，當(dāng)加入的物質(zhì)中含有抗氧化物時，就會與ABTS·+發(fā)生反應(yīng)使體系顏色褪去，其在734 nm波長處有最大吸收，吸光度值可反映物質(zhì)的抗氧化活性［19］。由圖4和表1可知，垂盆草醇提物及其不同極性部位對ABTS自由基均表現(xiàn)出良好的清除能力，且具有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)溶液濃度為25 μg/mL時，垂盆草各部分與Vc清除ABTS·+的能力順序為：Vc＞乙酸乙酯部分＞正丁醇部分＞三氯甲烷部分＞粗提物＞水提部分＞石油醚部分，其中乙酸乙酯部分對ABTS·+的清除率為78.10%，稍低于相同濃度下Vc對ABTS·+的清除率，表明乙酸乙酯部分體外抗氧化能力較強。

圖4　垂盆草不同極性部位對ABTS自由基的清除率比較

表1　垂盆草不同溶劑提取物對自由基清除能力以及總還原能力的曲線方程、R2及IC50值

3　討論

在正常生理情況下，人體維持新陳代謝只需要少量自由基，但是當(dāng)自由基過量積累時就會對機體造成損害。自由基能與生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞生物膜結(jié)構(gòu)；能直接作用于DNA，并造成DNA的永久損傷；能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與構(gòu)象，使肽鏈斷裂，產(chǎn)生聚合和交聯(lián)，人體中DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，會造成細(xì)胞功能紊亂，從而引發(fā)多種疾病，加速機體衰老［20］。當(dāng)下與我們生活息息相關(guān)的食品和醫(yī)療領(lǐng)域中被廣泛使用的是人工合成的抗氧化劑，雖然這些抗氧化劑具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價格優(yōu)惠且效果好等特點，但其安全性受到懷疑，研究發(fā)現(xiàn)人工合成抗氧化劑（如BHA、BHT等）有潛在的肝損傷、致癌性等毒副作用［21，22］。

中藥是中醫(yī)預(yù)防和治療疾病的獨特藥物，中藥多方面的藥理作用與其多種化學(xué)成分和能清除人體內(nèi)活性氧自由基的作用密不可分?，F(xiàn)代研究表明中藥提取物或中藥單體化合物可以通過調(diào)節(jié)免疫功能，抑制自由基的產(chǎn)生，或直接對抗自由基對細(xì)胞及組織的損傷作用。

因此，研究中藥抗氧化具有重要意義，從中藥中尋找清除體內(nèi)自由基的抗氧化劑也將成為現(xiàn)代醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)發(fā)展的潮流和趨勢。垂盆草為現(xiàn)代研究較熱門的一種中藥，具有保肝降酶、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、增強肌力等作用［23，24］，垂盆草所含的黃酮、三萜、生物堿、糖類等成分多數(shù)為中藥中的抗氧化成分。本研究通過測定垂盆草總還原能力、DPPH自由基的清除率、羥基自由基的清除率以及ABTS自由基的清除率，綜合評價了垂盆草醇提物不同極性萃取部位的抗氧化活性能力，并與抗氧化劑抗壞血酸進(jìn)行比較，篩選了垂盆草醇提物有效抗氧化活性部位。體外抗氧化實驗結(jié)果表明，垂盆草不同極性萃取物均具有抗氧化活性，其中乙酸乙酯部分的抗氧化能力最強，正丁醇部分次之，在一定范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，清除自由基的能力也隨之增強。乙酸乙酯部分和正丁醇部分相對于其他極性部位表現(xiàn)出較強的還原能力和清除自由基的能力，表明垂盆草的乙酸乙酯部分和正丁醇部分很可能含有大量的黃酮、酚類、皂苷、多糖等抗氧化物質(zhì)。另外，臨床研究發(fā)現(xiàn)，垂盆草具有抑制炎性滲出、減少細(xì)胞損傷的作用［25］，同時垂盆草提取液中的三萜和黃酮類等成分具有較強抗氧化和抗損傷的作用［26］。金京麗［27］腹腔注射垂盆草治療D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素造成的小鼠急性肝損傷，證實垂盆草對小鼠肝細(xì)胞中核因子NF-κB的激活和DNA損傷有明顯的抑制作用。垂盆草的這些藥理作用，其機制主要是通過提高機體的抗氧化能力、降低組織細(xì)胞中的自由基、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等途徑。因此，研究垂盆草的抗氧化作用具有重要的意義，研究垂盆草不同極性部位的抗氧化活性，能為擴展垂盆草的應(yīng)用范圍，進(jìn)一步研究其抗氧化活性成分和深入研究垂盆草藥理作用機制提供了理論依據(jù)。

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Study of antioxidant activity in vitro of parts with different polarity of sedum sarmentosum

CHEN Lei1,2YU Xuefeng2YAO Xiaomin2
1.Department of Pharmacology，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2.Department of Pharmacology，Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China

R284

B

1673-9701（2016）24-0120-05

2016-04-28）

浙江省寧波市科技惠民計劃項目（2015C50020）