王雪梅，魏琴，段明軍，張春，姜濤，楊毅寧

(新疆醫(yī)學(xué)動物模型研究重點實驗室，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊 830011)

1 引 言

基因治療是針對一些常規(guī)治療效果不佳，靶向性不強的疾病，利用物理的基因載體，將外源的脫氧核糖核酸上的遺傳密碼(基因)轉(zhuǎn)移到患者的特定細胞中，使外源基因進入受體細胞中，表達對應(yīng)的產(chǎn)物，治療疾病[1]。目前，能夠傳遞外源基因的載體有兩類，一類是病毒載體，另一類是非病毒載體。病毒載體是利用病毒能夠傳遞基因組進到細胞，傳遞遺傳物質(zhì)、感染細胞的分子機制。病毒載體根據(jù)在宿主細胞中的表達時間不同，又可以分為瞬時表達病毒載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒)和穩(wěn)定表達病毒載體(慢病毒和腺相關(guān)病毒)。非病毒載體是利用載體物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，比如自由進入細胞膜，傳遞基因進入細胞。非病毒載體的常用材料有脂質(zhì)體、脂類復(fù)合物、陽離子多聚物、殼聚糖載體聚合物、無機納米粒子載體[2]。目前用作基因傳遞的病毒載體中，腺病毒是應(yīng)用最廣泛的病毒載體，被廣泛用于基因治療和疫苗的研發(fā)，占所有基因治療科學(xué)研究的28%。5型腺病毒(Adenovirus type 5, Ad5)是一種應(yīng)用廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體，被用于艾滋病、流感等疫苗研究。特點是感染目標(biāo)細胞種類多、轉(zhuǎn)染高效、不整合到宿主基因組中、理化性質(zhì)較穩(wěn)定和轉(zhuǎn)載基因片段長度大[3]。腺病毒體內(nèi)生物分布和蛋白表達模式對于各類腺病毒疫苗的安全性評價和免疫策略的優(yōu)化選擇非常重要[4]。目前，主要采用侵入性檢測手段對被腺病毒感染的動物，在特定時間點檢測器官、組織中病毒載體的分布，檢測方法包括PCR、免疫組化等[5]。將重組腺病毒在應(yīng)用于ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化預(yù)防和治療中，可能引發(fā)的毒副作用尚未有明確報道[6]。

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因缺陷小鼠是目前研究動脈粥樣硬化應(yīng)用最多的小鼠動物模型。ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域的細胞類型有巨噬細胞、T細胞和平滑肌細胞，與人類近似[7-8]。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是從美國西北海岸中的一種常見水母中分離得到的。GFP能夠有效地發(fā)射熒光，成為公認的完整細胞和生物體中的基因和蛋白表達的標(biāo)志物。增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)是GFP突變系，eGFP發(fā)射的熒光強度比GFP大6倍以上，更適合用于研究基因表達變化、細胞增殖和分化、蛋白質(zhì)在機體內(nèi)翻譯表達。腺病毒轉(zhuǎn)染細胞，24～48 h后就能觀察到eGFP的蛋白表達，通過鑒定eGFP在體內(nèi)特定組織的表達，間接了解目的基因蛋白在特定組織的表達情況[9]。

本研究選擇ApoE-/-小鼠，通過尾靜脈注射的方式轉(zhuǎn)染重組腺病毒，使目的基因在體內(nèi)過表達，在0 d、1周、2周、4周，利用生化方法檢測血液指標(biāo)，研究腺病毒介導(dǎo)的基因治療對ApoE-/-小鼠血常規(guī)指標(biāo)、肝功能、腎功能和心肌酶的影響，應(yīng)用ELISA和WB的方法，研究目的基因在體內(nèi)血管組織的分布表達，以及目的蛋白在血液中的表達變化，為腺病毒基因治療血管性疾病的安全性和免疫策略提供實驗依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗動物的選擇

實驗選擇SPF級ApoE-/-小鼠，12周齡，雄性，體重20～22 g，由上海南方模式生物研究中心贈與，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物部保種繁殖[SYXK(新)2010-0003]，在無特定病原體SPF級的飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。所有涉及動物實驗操作程序均經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號為IACUC-20130709010)。12 h∶12 h晝夜循環(huán)飼養(yǎng)。

2.2 腺病毒載體的選擇

pDC316-mCMV-EGFP-mAdipoq和pDC316-mCMV-EGFP是重組5型腺病毒載體，查對小鼠脂聯(lián)素基因序列后，委托深圳百恩維生物科技有限公司構(gòu)建。

構(gòu)建信息：重組腺病毒包裝小鼠的脂聯(lián)素全基因序列。

基因名稱：Adiponectin (744 bp)

構(gòu)建載體：pDC316-mCMV-EGFP

構(gòu)建策略：Not I+Hind III

引物

pDC316-Adipoq-NotI-F：5‘-ATTTGCGGCCGCCACCATGCTACTGTTGCAAGCTCTCCTGTTCCT-3’pDC316-Adipoq-HindIII-R：5‘-CCCAAGCTTTCAGTTGGTATCATGGTAGAGAAGAAA-3’

圖1 載體構(gòu)建圖譜

2.3 主要儀器設(shè)備和試劑

PCR儀(美國BIO-RAD公司)；電泳儀(中國六一牌DYY-6D)；高速冷凍離心機(美國HC-3018R)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad Benchmark Plus)；水平搖床(北京六一牌WD-9405B)；手術(shù)顯微鏡(德國ZEISS)；純水系統(tǒng)(美國Elix系統(tǒng))；生化分析儀(中國深圳BS-200)；超凈工作臺(中國上海精密儀器儀表有限公司)；液氮罐(中國新疆貝斯明生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；pH計(美國HACH公司)；全自動熒光倒置顯微鏡(德國ZEISS)；超低溫冰箱(美國THERMO公司)；組織勻漿機(美國PRO Scientific公司PRO 200)；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica TCS SP8)；pDC316-mCMV-EGFP-mAdipoq和pDC316-mCMV-EGFP腺病毒載體(中國深圳百恩維生物科技有限公司)；血常規(guī)生化指標(biāo)測定試劑(中國深圳邁瑞診斷產(chǎn)品有限公司)；APN酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒(美國Biomerica公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量分析試劑盒(中國北京BIOTEKE公司)；脫脂奶粉封閉液(美國Sigma公司)；WB膠預(yù)制、PVDF印跡膜(美國Invitrogen公司)；WB試劑盒(美國Invitrogen公司)；GFP和GAPDH單抗(美國CST公司)。

2.4 實驗動物分組

實驗使用12周齡，雄性，體重20～22 g的ApoE-/-小鼠。實驗分為2組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機將其分為正常對照組和脂聯(lián)素干預(yù)組，每組各24只小鼠，普通飲食飼養(yǎng)。兩組ApoE-/-小鼠分別在喂養(yǎng)0，1，2，4周后，檢測各個時間點血常規(guī)和生化指標(biāo)變化。正常對照組ApoE-/-小鼠，通過尾靜脈注射的方法，注射同等劑量的生理鹽水，給予正常飲食飼養(yǎng)。脂聯(lián)素干預(yù)組，通過尾靜脈注射的方法，轉(zhuǎn)導(dǎo)3×108p.f.u的重組腺病毒，正常飲食飼養(yǎng),見圖2。

圖2 實驗分組示意圖

2.5 小鼠血液生化指標(biāo)的測定

分別于尾靜脈注射后12 h內(nèi)、7、14、28 d采血和收集血管組織標(biāo)本。眼球采血，用肝素化烘干的毛細管采取0.8～1.0 ml全血。其中需要保留100 μl全血，用于血常規(guī)指標(biāo)的檢測：包括血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細胞計數(shù)(red blood cell count，RBC)、白細胞計數(shù)(white blood cell count, WBC)、血小板(platelet，PLT)；全血放置半小時后，4 000 r/min離心10 min，取血清約300～400 μl，放在-80℃超低溫冰箱保存。將兩只小鼠的血清合并可以得到500～600 μl血清，取300 μl，全自動生化儀檢測肝功能指標(biāo)：谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)；取約200 μl血清，用于檢測腎功能指標(biāo)和心肌酶指標(biāo)：包括尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN)、肌酐 (creatinine，CR)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CKMB)。

2.6 血清脂聯(lián)素水平測定

采用酶聯(lián)免疫法，檢測每個時間點血清脂聯(lián)素濃度。按照試劑盒說明書進行操作。

2.7 WB法檢測GFP蛋白在血管組織中的表達

組織取材，在ZEISS手術(shù)顯微鏡下小心分離小鼠主動脈，從主動脈弓根部開始向下分離直至髂動脈分叉處，全部離段取出。本研究中病毒轉(zhuǎn)染后，應(yīng)用WB蛋白免疫印跡檢測法檢測血管組織中GFP的表達。內(nèi)參蛋白選用GAPDH，以內(nèi)參蛋白的表達量實現(xiàn)均一化，校正上樣差別可能帶來的誤差。用Quantity One分析目標(biāo)條帶灰度值。相關(guān)蛋白分子量的大?。篏FP為28kDa，GAPDH為36kDa。

2.8 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 病毒轉(zhuǎn)染的安全性檢測

對照組(24只)和腺病毒干預(yù)組(24只)實驗期間，密切觀察動物飲食排便、行為、生理狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)小鼠死亡，也無尾靜脈發(fā)炎、破潰情況發(fā)生。飲食、排便及活動情況正常。全自動生化儀檢測WBC、RBC、HGB、PLT、AST、ALT、BUN、CR、CK、CKMB。以時間和分組做兩因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺病毒干預(yù)組和對照組的血常規(guī)指標(biāo)差異沒有顯著性表達，見表1。肝功能指標(biāo)AST差異沒有顯著性表達，ALT差異無顯著性表達 (P<0.05)；腎功能指標(biāo)BUN差異有顯著性表達(P<0.05)，Cr差異無顯著性表達，見表2。提示腺病毒注射后1～2周內(nèi)小鼠的肝腎功能有一定損傷，有輕微肝腎毒性，但對動物的生理狀態(tài)沒有顯著影響。心肌酶指標(biāo)CK和CKMB差異均無顯著性表達(P>0.05)，說明腺病毒注射對于心肌未造成明顯的損傷，見表3。

表1 各組小鼠血常規(guī)比較

表2 各組小鼠肝功、腎功血清學(xué)指標(biāo)比較

注：與對照組的相同時間點相比，#P<0.05；*P<0.001

表3 各組小鼠血清心肌酶指標(biāo)比較

3.2 不同時間點血清APN的血清濃度

腺病毒干預(yù)組的ApoE-/-小鼠在尾靜脈注射腺病毒后，血清脂聯(lián)素水平顯著要高于正常對照組，組間差異和時間差異都極顯著(P<0.001)。說明病毒轉(zhuǎn)染后1周，血液中的脂聯(lián)素達到了最高水平，約是正常情況下的4倍，兩周后逐漸降低，4周后降至接近正常水平(見表4，圖3)。

表4 各組小鼠血清脂聯(lián)素濃度的比較

注：與對照組的相同時間點相比，**P<0.001

與對照組的相同時間點相比，**P<0.001

3.3 不同時間點GFP蛋白在血管組織中的表達

轉(zhuǎn)染1周時脂聯(lián)素干預(yù)組血管中的GFP蛋白表達的量達到最高，轉(zhuǎn)染率是83.63%±1.50%，隨后逐漸降低，說明隨著時間的增加，腺病毒由于自身的免疫原性被逐漸降解，使得細胞組織被轉(zhuǎn)染的比率下降，最終趨于消失，見表5，圖4。

表5 腺病毒轉(zhuǎn)染后小鼠血管組織的GFP蛋白表達隨時間的變化

注：與0天時GFP蛋白表達相比，**P<0.001

4 討論

動脈粥樣硬化是一種全身血管系統(tǒng)性的慢性病變，也是發(fā)生心血管事件，例如中風(fēng)、血栓、腦梗和急性冠脈綜合癥的病理基礎(chǔ)[10]。傳統(tǒng)藥物治療的方法療效有限，基因治療作為全新的治療手段完全有可能成為防治心血管疾病的一種重要手段和途徑，從基因治療角度探索治療心臟疾病的新方法有潛在的臨床價值[11]。本研究結(jié)果顯示，重組腺病毒介導(dǎo)脂聯(lián)素基因，對小鼠的肝功能、腎功能有一過性的刺激，尤其是在體內(nèi)轉(zhuǎn)染1周時，ALT、BUN的值會顯著增加，但是很快在兩周后，就會下降接近正常水平。重組腺病毒在體內(nèi)血管組織的轉(zhuǎn)染效率也較穩(wěn)定，前兩周能夠有效表達，目的蛋白在血清中的含量也顯著提高，且穩(wěn)定表達，說明重組腺病毒介導(dǎo)基因過表達的方法安全可行。在長期的動物實驗中選擇每兩周注射一次重組腺病毒，以維持目的基因的穩(wěn)定過表達。

重組腺病毒轉(zhuǎn)染后在體內(nèi)的生物分布和蛋白表達模式對于各類重組腺病毒疫苗的安全性評價和免疫策略的優(yōu)化選擇非常重要。目前，主要采用侵入性檢測手段對感染動物后特定時間點解剖的器官、組織中病毒載體的分布進行檢測，檢測方法包括PCR、免疫組化等[12]。但是，侵入性檢測技術(shù)對于重組腺病毒安全性、接種劑量和間隔時間的優(yōu)化判斷能力非常有限[13]。小動物活體生物發(fā)光成像作為一種非侵入性檢測技術(shù)，因其具有靈敏度高、活體全身成像等優(yōu)點，近幾年被應(yīng)用到生物體內(nèi)蛋白分布研究領(lǐng)域[14]。之前有研究報道，利用IVIS Lumina成像系統(tǒng)對Ad5病毒在BALB/c小鼠和裸鼠體內(nèi)代謝和組織分布特點進行分析，分別采用肌肉、皮下和腹腔注射3種轉(zhuǎn)染途徑，以1×1010vp/只劑量的Ad5-Fluc病毒感染BALB/c小鼠，在5×105-5×106p.s-1.cm-2.sr-1檢測范圍內(nèi)，肌肉感染途徑的可檢測發(fā)光時間最長(>60 d)，皮下和腹腔途徑可檢測時間均為10 d，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。蛋白表達趨勢分析發(fā)現(xiàn)，腹腔途徑感染表現(xiàn)出表達早、強度高且衰減快的特點，而肌肉注射途徑表達水平衰減的相對緩慢。統(tǒng)計分析表明，肌肉途徑表達水平顯著性高于皮下途徑。肌肉和皮下途徑感染后，病毒主要分布于注射部位的肌肉和皮下組織。腹腔感染后，病毒快速擴散分布于胸腺、肝、脾、腎、卵巢和腹壁肌肉等器官和組織中，其中肝脾器官的衰減最緩慢。3種途徑接種后，腹股溝淋巴結(jié)和腦組織中均未檢測到發(fā)光蛋白的表達。攜帶綠色熒光蛋白的5型腺病毒通過肌肉途徑，分別感染BALB/c小鼠和裸鼠，生物體內(nèi)分布比較分析發(fā)現(xiàn)，在120 d的觀察期內(nèi)，病毒在BALB/c小鼠和裸鼠的體內(nèi)分布情況一致，在相同的臟器有表達分布，均表現(xiàn)出腹腔轉(zhuǎn)移的特點。Ad5-Fluc病毒在裸鼠體內(nèi)感染7 h后進入表達平臺期，隨后的觀察期內(nèi)未發(fā)生衰減。和BALB/c小鼠比較，病毒在裸鼠腹腔部位的轉(zhuǎn)移分布時間更長(60d vs 4d)[15]。相反，Ad5-Fluc病毒在體內(nèi)早期(21d內(nèi))表達水平更高，但衰減更快。說明T細胞在Ad5病毒感染早期和晚期發(fā)揮的作用機制可能不同[16]。

有研究報道，通過尾靜脈注射的方式，轉(zhuǎn)導(dǎo)重組腺病毒Ad-EGFP-hVEGF到小鼠體內(nèi)，研究重組腺病毒在移植骨髓的小鼠體內(nèi)的分布情況和熒光蛋白的表達效率。在不同的時間點，應(yīng)用熒光倒置顯微鏡觀察不同組織的冰凍切片，測量組織切片的熒光蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠心、肺、肝、脾、腎、小腸組織中均有綠色熒光蛋白的表達，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，相應(yīng)的臟器內(nèi)都有顯著的VEGF表達。制作各臟器的HE染色病理切片，顯示各臟器未見明顯毒性反應(yīng)[17]。這項研究發(fā)現(xiàn)Ad5病毒肌肉途徑感染小鼠后，出現(xiàn)肝臟和脾臟的轉(zhuǎn)移分布的問題，說明肝毒性是Ad5病毒載體疫苗應(yīng)用中主要的副反應(yīng)問題[18]。這與本部分的研究結(jié)果是一致的，應(yīng)用尾靜脈注射腺病毒的方式對ApoE-/-小鼠的肝功能和腎功能有一過性的毒性作用，但是各臟器未見明顯的毒性反應(yīng)。并且本研究也發(fā)現(xiàn)，由于腺病毒自身免疫原性，病毒本身和目的蛋白在體內(nèi)的表達時間窗大概是2周。