王維茜，鄧潔紅，*，劉永紅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127）

半制備型高效液相色譜法分離刺葡萄花色苷單體

王維茜1，鄧潔紅1，*，劉永紅2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127）

經(jīng)大孔吸附樹脂HP-20純化刺葡萄花色苷的粗提物后，以半制備型高效液相色譜法分離得到高純度的刺葡萄花色苷單體。以XCharge C18柱（20 mm×250 mm，10 μm）制備柱，考察梯度洗脫條件、流動相流速、進樣量對刺葡萄花色苷分離的影響，確定了最佳制備條件為甲醇-3%甲酸溶液流動相梯度洗脫、流速15 mL/min、進樣量1.2 mL，實現(xiàn)了2 種主要花色苷單體的分離及制備。經(jīng)超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜鑒定，2 種花色苷單體分別是錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷和錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷-香豆酰，產(chǎn)品純度分別達到了99.54%和98.28%。方法具有簡單易行、經(jīng)濟快速、易于放大等特點，適用于刺葡萄花色苷標準品的大規(guī)模制備。

刺葡萄；錦葵素；半制備液相色譜；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜

花色苷是一類重要的植物色素，色澤鮮艷、來源廣泛且具有獨特的生理活性功能［1-3］，雷用東等［4］研究表明紫甘薯花色苷提取物對豬傳染性胃腸炎病毒有很好的抗病毒功效，殷麗琴等［5］通過對紫色馬鈴薯的花色苷含量與抗氧化活性的測定發(fā)現(xiàn)整薯總花色苷含量與總抗氧化活性的正相關(guān)性極顯著。但由于花色苷穩(wěn)定性較差，對pH值、熱、光、金屬等因素極其敏感［6-8］，使其開發(fā)應(yīng)用受到限制，所以研究其穩(wěn)定化理論和技術(shù)具有重要意義。因花色苷單體分離精制過程復(fù)雜且成本較高，研究報道多采用色素混合粗提物作為研究對象，無法說明花色苷降解規(guī)律。因此，采用簡單易行的方法得到大量花色苷單體對花色苷的進一步研究具有重要意義。刺葡萄（Vitis davidii Foex）產(chǎn)量高，價格低，生產(chǎn)廢料果皮中富含花色苷，是一種具有巨大潛力的色素資源，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，刺葡萄皮中的主要花色苷為錦葵素［9］，但相關(guān)標準品種類匱乏且價格昂貴，故有必要建立規(guī)模化生產(chǎn)錦葵素對照品的工藝，完善其圖譜數(shù)據(jù)，克服制備性分離瓶頸。

目前，制備花色苷單體的主要方法有薄層色譜法［10］、凝膠色譜法［11-12］、半制備型高效液相色譜法［13-15］、高速逆流色譜法［16-18］。課題組前期嘗試采用大孔吸附樹脂層析和葡聚糖凝膠分離相結(jié)合，但操作復(fù)雜、耗時長、成本高。半制備型高效液相色譜法具有簡單易行、經(jīng)濟快速、易于放大等特點，是制備天然產(chǎn)物的重要手段，已廣泛應(yīng)用于多種物質(zhì)單體標準品的制備［19-20］。目前應(yīng)用半制備型高效液相色譜技術(shù)制備刺葡萄中錦葵素的研究鮮見報道，本實驗利用半制備型高效液相色譜法分離純化刺葡萄花色苷，對半制備液相色譜條件進行了優(yōu)化，主要考察了梯度洗脫條件、流動相流速、進樣量對刺葡萄花色苷分離的影響，并最終確定了半制備型高效液相色譜法分離純化刺葡萄花色苷的制備條件，可滿足刺葡萄花色苷標準品的大規(guī)模制備。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

刺葡萄果皮購于湖南省芷江縣，品種為紫秋。實驗之前將果皮洗凈，晾干，手工剝皮，-40 ℃凍藏備用。

HP-20大孔吸附樹脂 日本三菱公司；乙醇、鹽酸、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、鹽酸、氯化鉀、冰醋酸、醋酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙酸（均為色譜純） 美國Tedia公司；三氟乙酸、甲酸 美國Aladdin公司。

1.2儀器與設(shè)備

AEY-220型電子天平、UV-2450紫外-可見分光光度計日本島津集團；THZ-92A氣浴恒溫振蕩器 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；TDZ5臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；e2695自動進樣高效液相色譜儀 美國Waters公司；218半制備型高效液相色譜、440-LC部分收集器、1290超高效液相色譜-G6500四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometer，UPLC-QTOF MSE）聯(lián)用儀 美國Agilent公司；真空冷凍干燥機 丹麥Heto公司。

1.3方法

1.3.1刺葡萄花色苷的提取和純化

刺葡萄皮以1∶6（g/mL）的料液比加入70%酸化乙醇（含0.03%鹽酸），避光浸提24 h，真空濃縮后離心，上清液加入4 倍體積丙酮振蕩2 h后真空濃縮，然后分別用無水乙醚和乙酸乙酯萃取2 次，合并水相。用已處理好的HP-20大孔吸附樹脂進行初步分離，收集洗脫液濃縮，真空凍干后用甲醇溶解，采用示差法［21］測得花色苷含量為29.78 mg/mL（上述過程均在溫度小于40 ℃條件下進行）。

1.3.2半制備型高效液相色譜條件的優(yōu)化

采用XCharge C18柱（20 mm×250 mm，10 μm）；柱溫30 ℃；流動相A：3%甲酸溶液，流動相B：甲醇；檢測波長520 nm；10 mL定量環(huán)。

1.3.2.1洗脫程序的選擇

控制洗脫流速為20 mL/min，進樣量為0.8 mL，考察洗脫程序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（表1）對刺葡萄花色苷分離的影響。

表1　梯度洗脫程序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和ⅣTable1　Mobile phase gradient elution conditions Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ

1.3.2.2流速的選擇

控制進樣量為0.8 mL，洗脫程序為程序Ⅰ，考察流速10、15、20 mL/min對刺葡萄花色苷分離的影響。

1.3.2.3進樣量的選擇

控制洗脫流速為15 mL/min，洗脫程序為程序Ⅰ，考察進樣量0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL對刺葡萄花色苷分離的影響。

1.3.3分析色譜條件

采用hypersil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃，流速1.2 mL/min；流動相A：V（甲酸）∶V（水）=1∶9，流動相B：V（甲酸）∶V（水）∶V（甲醇）= 1∶4∶5；線性洗脫條件見表2；Prostar320 PDA檢測器，檢測波長520 nm；20 μL定量環(huán)［9］。

表2　分析色譜的梯度洗脫條件Table2　Mobile phase gradient elution conditions of analytical HPLC

1.3.4UPLC-QTOF MSE分析

液相色譜條件：色譜柱Xaqua C18（2.1 mm×150 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min；進樣體積2 μL；流動相A：0.1%甲酸溶液溶液，流動相B：0.1%甲酸-乙腈；梯度洗脫條件見表3；二極管陣列檢測器掃描波長為190～530 nm，色素檢測波長為520 nm。

表3　UPLC-QTOF的梯度洗脫條件Table3　Mobile phase gradient elution conditions of UPLC-QTOF

MS條件為：電噴霧電離離子源；噴射電壓4 000 V，噴射壓力45 psi；輔助氣流速10 L/min，溫度345 ℃；鞘氣流速11 L/min，溫度350 ℃；掃描質(zhì)量范圍100～1 000 m/z，正離子模式。

2　結(jié)果與分析

2.1半制備型高效液相色譜條件的建立

制備型高效液相色譜的效能取決于分離度、分離速度和上樣量，提高效能則要求在分離度R不小于1.5條件下具有較快的分離速度和較大的上樣量［22-23］。分離速度主要取決于流動相，上樣量取決于進樣體積。本實驗采用甲醇-甲酸體系，檢測波長測定為520 nm，對半制備型高效液相色譜條件的梯度洗脫程序、流速、進樣量進行優(yōu)化。

2.1.1洗脫程序的選擇

圖1　不同梯度洗脫條件下刺葡萄花色苷的制備色譜圖Fig.1　Preparative HPLC chromatogram of anthocyanins from Vitis davidii Foex with different mobile phase gradient elution conditions

流動相梯度洗脫條件的優(yōu)化包括改變各梯度變化的時間和每個梯度的流動相組成。分別考察了洗脫程序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對刺葡萄花色苷分離的影響。不同梯度洗脫程序下刺葡萄花色苷的制備圖譜如圖1所示。

表4　洗脫程序?qū)Υ唐咸鸦ㄉ辗蛛x的影響Table4　Effect of mobile phase gradient elution conditions on isolation of anthocyanins from Vitis davidii Foex

由圖1、表4可知，當(dāng)實驗采用梯度洗脫程序Ⅱ進行分離時，雖出峰時間提前但峰形發(fā)生較大改變，花色苷A、B比例出現(xiàn)異常，經(jīng)分析液相色譜檢測純度均小于60%，采用梯度洗脫程序Ⅳ時，出現(xiàn)了過載現(xiàn)象，采用梯度洗脫程序Ⅲ時，雖然峰形較好，單次制備流動相消耗較低，但是花色苷B后的雜峰提前出峰對花色苷B的純度造成了一定影響；而采用梯度洗脫程序Ⅰ時，峰形對稱，更有利于收集，且花色苷A、B純度均高于98%，綜合考慮，選擇梯度洗脫程序Ⅰ進行后續(xù)研究。

2.1.2流速的選擇

流動相的流速主要影響的是溶質(zhì)與固定相和流動相間的相互作用，從而引起待分離組分保留時間的變化。流動相流速的選擇在保證分離度的情況下，流速越大越好。流速的選擇受3 個因素影響：一是分離度；二是填料本身；三是色譜系統(tǒng)泵的工作能力［24］。本實驗分別考察了10、15、20 mL/min流速下刺葡萄花色苷的分離情況，不同流速時刺葡萄花色苷的制備圖譜如圖2所示。

圖2　不同流速時刺葡萄花色苷的制備色譜圖Fig.2　Preparative HPLC chromatograms of anthocyanins from Vitis davidiiFoex with different flow rates

表5　流速對刺葡萄花色苷分離的影響Table5　Effect of flow rate on isolation of anthocyanins from Vitis davidiiFoex

由圖2、表5可知，在10、15、20 mL/min流速條件下花色苷A、B的分離度R均遠大于1.5，峰形對稱無明顯差別。隨著流速的增加，雖然花色苷A、B的保留時間提前，但柱壓升高，柱子的使用壽命縮短，同時流動相消耗增大，收集液被過度稀釋，后續(xù)處理的耗能增多，總的制備成本增加。但是，當(dāng)流速小于15 mL/min時，出峰時間明顯延后，延長了總的制備時間，并增加了流動相消耗量。因此選擇最佳流速為15 mL/min。

2.1.3進樣量的選擇

在確定了流動相梯度洗脫條件和流速后，進樣量成為影響制備效能的重要因素，其不僅影響分離度，同時也決定了制備效率和產(chǎn)物純度。在進樣質(zhì)量濃度一定的條件下，通過增大進樣體積來增大進樣量。實驗分別考察了進樣體積為0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL時的分離效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同進樣量時刺葡萄花色苷的制備色譜圖Fig.3　Preparative HPLC chromatograms of anthocyanins from Vitis davidii Foex with different injection volumes

表6　進樣量對刺葡萄花色苷分離的影響Table6　Effect of injection volume on isolation of anthocyanins from Vitis davidiiFoex

由圖3、表6可知，在不影響分離度的情況下，單次進樣量越大越好，既節(jié)約了實驗時間，又減少了流動相消耗量，提高了實驗效率。但是，當(dāng)進樣量為1.5 mL時，出峰提前，但花色苷A峰形變差，純度小于80%，而且進樣量過大，柱壓增加，物質(zhì)的分離度下降，當(dāng)進樣量增加到2.0 mL時，出現(xiàn)了明顯的過載現(xiàn)象。綜合考慮，選擇最佳進樣量為1.2 mL。

2.2分析型高效液相色譜檢測純度

圖4　花色苷A（a）和花色苷B（b）單體的HPLC圖譜Fig.4　HPLC chromatograms of anthocyanins A and B

分析型高效液相色譜檢測半制備型液相色譜分離所得花色苷A、B的結(jié)果如圖4所示。花色苷A的保留時間為16.029 min，以歸一法計算峰面積，純度達到99.54%；花色苷B的保留時間為18.815 min，純度為98.28%。

2.3UPLC-QTOF MSE檢測結(jié)果

圖5　花色苷A（a）和花色苷B（b）的二級質(zhì)譜圖Fig.5　MS2spectra of anthocyanin A and anthocyanin B

由圖5a可知，花色苷A的保留時間為4.002 min，MS2信息表明，其分子離子峰為m/z 655，兩碎片離子峰分別為m/z 331、493。參考文獻［25］并結(jié)合前期研究，確定花色苷A為錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷。

由圖5b可知，花色苷B的保留時間為6.610 min，MS2信息表明，其分子離子峰為m/z 801，三碎片離子峰分別為m/z 331、493、639。參考文獻［25］并結(jié)合前期研究，確定花色苷B為錦葵素-3，5-雙葡萄糖苷-香豆酰。

UPLC-QTOF MSE檢測結(jié)果顯示，錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷和錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷-香豆酰產(chǎn)品純度分別達到了99.54%和98.28%。

3　結(jié) 論

花色苷在酸性條件下較穩(wěn)定，且甲酸可改善峰形，減少拖尾現(xiàn)象，因此選用甲醇-3%甲酸溶液作為流動相。粗提取物先經(jīng)大孔樹脂HP-20除去大部分雜質(zhì)后，降低了半制備高效液相色譜的分離難度，簡化了分離條件和提高了分離效能。

半制備高效液相色譜操作類似于普通分析型高效液相色譜，分離條件簡單，分離效果良好，目標產(chǎn)物純度與收率較高，且無需其他特殊設(shè)備。在保證2 個化合物分離度的條件下，本實驗對半制備高效液相色譜條件進行了優(yōu)化，考察了梯度洗脫條件、流動相流速、進樣量對刺葡萄花色苷分離的影響，并最終確定了半制備型高效液相色譜法分離制備刺葡萄花色苷的條件為甲醇-3%甲酸溶液流動相梯度洗脫、流速15 mL/min、進樣量1.2 mL，實現(xiàn)了2 種主要花色苷單體的分離及制備，經(jīng)UPLCQTOF MSE鑒定為錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷和錦葵素-3，5-雙葡萄糖苷-香豆酰，且純度均達到了對照品的要求，可滿足刺葡萄花色苷標準品的大規(guī)模制備。

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Preparation of Monomeric Anthocyanins from Vitis davidii Foex by Semi-Preparative HPLC

WANG Weiqian1， DENG Jiehong1，*， LIU Yonghong2
（1. College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；2. Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic， Changsha 410127， China）

A semi-preparative high performance liquid chromatographic （HPLC） method using an XCharge C18preparative column （20 mm × 250 mm， 10 μm） was established for the preparation of anthocyanins monomers with high purity from crude extracts of Vitis davidii Foex after purification with macroporous resin HP-20. The effects of experimental conditions including mobile phase gradient elution conditions， flow rate and injection volume were investigated on the separation efficiency of anthocyanins. The optimal chromatographic conditions were determined as follows: mobile phase， a mixture of methanol and 3% formic acid water for gradient elution； flow rate， 15 mL/min； and injection volume， 1.2 mL， which allowed the isolation and preparation of two major anthocyanins monomers in 18 min. The two anthocyanins were identified by MSEmethod using ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLC-QTOF MSE）as malvidin-3，5-O- diglucoside and malvidin-3，5-O-diglucoside-coumary with purities of 99.54% and 98.28%， respectively. The developed procedure was simple， effective， scalable and economic. It could be a promising alternative procedure for large-scale preparation of standard materials of anthocyanins from Vitis davidii Foex.

Vitis davidii Foex； malvidin； semi-preparative HPLC； UPLC-QTOF MSE

10.7506/spkx1002-6630-201618012

TS261.4

A

1002-6630（2016）18-0071-06

王維茜， 鄧潔紅， 劉永紅.半制備型高效液相色譜法分離刺葡萄花色苷單體［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（18）: 71-76. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618012. http://www.spkx.net.cn

WANG Weiqian， DENG Jiehong， LIU Yonghong. Preparation of monomeric anthocyanins from Vitis davidii Foex by semipreparative HPLC［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 71-76. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618012. http://www.spkx.net.cn

2015-10-30

國家自然科學(xué)基金面上項目（31271836）；湖南省教育廳研究生科研創(chuàng)新課題（CX2015B264）

王維茜（1990—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：1731686696@qq.com

鄧潔紅（1967—），女，教授，博士，研究方向為園藝產(chǎn)品深加工理論與技術(shù)。E-mail：hongjiedeng@163.com