黃 菲，張瑞芬，董麗紅，肖 娟，唐小俊，張名位

（廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所/農業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）

荔枝果肉多糖級分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

黃 菲，張瑞芬，董麗紅，肖 娟，唐小俊，張名位*

（廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所/農業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）

為了探究不同荔枝果肉多糖級分的理化性質、抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性差異，采用DEAE-52離子交換樹脂分離純化得到2種荔枝果肉多糖級分LPI和LPII，比較兩者的中性糖、糖醛酸和蛋白質含量，并采用氧自由基清除能力（ORAC）和細胞抗氧化（CAA）評價其抗氧化活性，采用對-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）法探究其α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究結果表明LPII含有較多的中性糖和蛋白質，較少的糖醛酸，表現(xiàn)出更強的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中LPI和LPII的ORAC和CAA值分別是24.51，30.08 μmol/g和5.36，8.72 μmol/g，其抑制α-葡萄糖苷的IC50值分別是0.33，0.26 mg/mL。荔枝果肉多糖的生物活性與其中性糖和蛋白質含量密切相關。

荔枝；多糖；抗氧化；α-葡萄糖苷酶

HUANG Fei，ZHANG Ruifen，DONG Lihong，et al.Antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory effect of litchi pulp polysaccharide fractions［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（4）:26-30.

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是熱帶亞熱帶地區(qū)的特色水果，其果肉營養(yǎng)豐富，滋味甜美，深受消費者喜愛。中醫(yī)認為“常食荔枝能補腦健身，治療瘰疬，開胃益脾；干制能補元氣，可作為產婦及老弱者的補品”?，F(xiàn)代藥理學證實多糖是荔枝中的主要活性成分，具有抗氧化［1］、免疫調節(jié)［2-4］和降血糖［5］的作用。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)荔枝果肉粗多糖具有清除DPPH·、OH·和O2-·等作用［6］；能提高肝臟和血清中總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物歧化酶活力［7］。但是對于純化后的荔枝果肉多糖級分具有怎樣的抗氧化活性尚不清楚。由于傳統(tǒng)的抗氧化方法主要是利用DPPH·和ABTS+·等自由基，而這些自由基不是生理上直接相關的自由基，導致檢測結果對抗氧化物質真實的生理活性的參照性較小。以偶氮化合物ABAP作為過氧自由基來源的氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）檢測法因其自由基、檢測環(huán)境更接近生理狀態(tài)，檢測結果更能反映抗氧化物質真實的生理活性而受到廣泛關注。此外，細胞抗氧化（cellular antioxidant activity，CAA）因其采用人體肝癌細胞株HepG2為實驗模型，能反應抗氧化物質在細胞內的吸收和代謝情況，檢測結果比傳統(tǒng)的化學檢測方法更有意義，從而被認為是抗氧化劑研究方法中的革命。因此，本研究對荔枝果肉粗多糖進一步分離純化，采用ORAC和CAA兩種方法來評價其抗氧化活性。

此外，張鐘等［8］研究發(fā)現(xiàn)荔枝果肉粗多糖具有顯著的體外抑制α-葡萄糖苷酶活性，且可以體內降低糖尿病小鼠血糖和糖化血紅蛋白含量、提高肝糖原合成能力，表現(xiàn)出降血糖作用［5］。以上研究均以粗多糖為原料，對于純化后的荔枝多糖是否還具有降血糖活性尚不清楚。因此，本研究采用對-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）法分析純化后的荔枝果肉多糖級分對α-葡萄糖苷酶抑制作用來探究其降血糖活性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

荔枝品種為“黑葉”，由廣東省農業(yè)科學院果樹研究所提供，于2015年6月采自其實驗果園。人肝癌細胞株HepG2細胞購自中山大學實驗動物中心，本實驗室繼代培養(yǎng)。

葡萄糖醛酸、Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）、熒光素鈉鹽、ABAP（2，2'-azobis（2-methylpropionamidine）-dihydrochloride）、DEAE-52纖維素離子交換樹脂、α-糖苷酶、DCFH-DA、槲皮素、對-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）、拜唐蘋，美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、HBSS緩沖溶液，美國Gibco公司；間羥基聯(lián)苯，日本TCI公司；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，南京建成科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津有限公司；1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Infinite Pro 200型酶標儀，瑞士Tecan公司；冷凍干燥儀，北京德天佑科技發(fā)展公司；Eyelan-1100型旋轉蒸發(fā)器，東京理化器械株式會社；SBS-Z100型數(shù)控計滴自動部分收集器，上海青浦瀘西儀器廠；HL-2型恒流泵，上海青浦瀘西儀器廠。

1.3方法

1.3.1荔枝果肉多糖的提取

將熱風干燥的荔枝干去殼和核，加無水乙醇后用打漿機粉碎，再用無水乙醇在4℃浸泡12 h后，離心（4 500 r/min，10 min）收集沉淀。將沉淀按料液比1∶20加入蒸餾水后采用95℃熱水浸提4 h，趁熱過濾，分別收集濾液和濾渣，將濾渣重復浸提一次，過濾后合并2次的濾液。將濾液濃縮為原來體積的1/4后用Sevag法脫去游離蛋白，再向溶液中按照體積比1∶4加入無水乙醇，將溶液于4℃靜置12 h后抽濾收集多糖沉淀。將沉淀用無水乙醇洗滌3次，再冷凍干燥得到荔枝粗多糖。

1.3.2多糖級分的制備

將100 mg粗多糖溶于5 mL去離子水中，4 500 r/min離心10 min后，將上清液加入DEAE-52離子交換層析柱（2.6 cm×50 cm）中。采用0.3 mol/L NaCl和0.3 mol/L NaOH以1 mL/min的流速依次洗脫10 h，5 mL/管收集洗脫液。苯酚-硫酸法檢測每管吸光度后，按吸光度強度收集組分，將收集的洗脫液用透析袋透析3 d脫去鹽離子，再進一步冷凍干燥得到2個荔枝多糖組分，分別是LPI和LPII。

1.3.3基本成分分析

中性糖含量測定采用苯酚-硫酸法［9］；糖醛酸含量測定采用Blumenkrantz和Asboe-Hanaen的方法［10］；蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍蛋白試劑盒測定。測定重復3次。

1.3.4紫外光譜分析

配置1 mg/mL的多糖溶液5 mL，離心（4 500 r/min，10 min）后取2 mL上清液，采用紫外-可見分光光度計在200～400 nm波長范圍內掃描。

1.3.5抗氧化活性

1.3.5.1氧自由基吸收能力測定

參考續(xù)潔琨等［11］的方法并稍作修改。先將緩沖液（空白）、不同濃度的Trolox標準品溶液、不同濃度的多糖級分溶液及0.96 μmol/L熒光素工作液加入到96孔板各孔后，37℃孵育10 min。再向未加熒光素的每孔中加入0.96 μmol/L的熒光工作液，37℃孵育20 min后，迅速向各孔加入119 mmol/L ABAP溶液后檢測各孔的熒光衰退情況。檢測條件:37℃，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm，每4.5 min測一次，測定35次。結果以每克干基中所含相當于Trolox物質的量（μmol/g）表示。每個樣品重復3次。

1.3.5.2細胞抗氧化活性測定

參考Wolfe［12］的方法并稍作修改。向96孔板中加入6×105cell/mL的HepG2細胞懸液100 μL/孔，孵育24 h后棄去培養(yǎng)基，向各孔中分別加入100 μL含有25 μmol/L DCFH-DA的不同濃度槲皮素標準溶液和不同質量濃度的多糖級分溶液液，孵育1 h后，每孔加入100 μL含600 μmol/L ABAP的PBS配制的溶液，后續(xù)測定各孔的熒光強度。檢測條件:37℃，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm，每5 min測一次，測定12次。結果以每克干基中所含相當于槲皮素的量（μmol/g）表示。每個樣品重復3次。

1.3.6對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考張鐘等［8］的方法稍作修改。將1 mL 0.1 mol/L的pH為6.8的磷酸緩沖液和5 U的α-糖苷酶混勻，制成反應酶液；將多糖級分分別用磷酸緩沖液制成0.05～1 mg/mL的多糖溶液。磷酸緩沖液為空白對照。向96孔板各孔分別加入40 μL多糖溶液后，再向每孔加入20 μL酶液，并在37℃孵育10 min。然后用多道移液器迅速在各孔加入60 μL的20 mmol/L的PNPG溶液，37℃孵育10 min后，每孔加入0.2 mol/L Na2CO3（160 μL）終止反應，在405 nm下檢測吸光值。同時設定樣品背景對照組、空白對照組和以拜唐蘋為抑制劑的陽性對照組，計算酶活抑制率。α-糖苷酶活性抑制率計算見式（1）。

1.4統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并以S-N-K檢驗比較各組間差異，顯著性水平為p＜0.05，以不同小寫字母表示。結果以均數(shù)±標準差表示。

2　結果與分析

2.1荔枝果肉多糖級分的基本成分分析

荔枝果肉多糖級分LPI和LPII的基本化學成分見表1。LPI和LPII的中性糖、蛋白質和糖醛酸含量均存在顯著性差異（p＜0.05）。LPI的中性糖和蛋白質含量低于LPII（p＜0.05），但其糖醛酸含量顯著高于LPII（p＜0.01）。

表1　荔枝果肉多糖級分的化學組成Table 1 Chemical compositions of LPI and LPII

2.2荔枝果肉多糖級分的紫外光譜特征

LPI和LPII的紫外掃描圖譜見圖1。由圖1可知，LPI在260 nm和280 nm處沒有吸收峰出現(xiàn)，說明LPI中不含有或者含有很少量的核酸和蛋白質類物質；LPII在280 nm處有顯著凸起的吸收峰，說明LPII含有蛋白質，此結果與考馬斯亮蘭法檢測結果一致。

2.3荔枝果肉多糖級分的抗氧化活性

2.3.1ORAC抗氧化能力

ORAC法通過以偶氮類化合物ABAP作為自由基來源，熒光素鈉鹽作為熒光指示劑，通過記錄ABAP和熒光素鈉反應使其逐漸轉化為非熒光物質時熒光強度的變化過程，來判斷抗氧化物質抑制自由基的能力，見圖2。由圖2可知，LPI和LPII的ORAC值分別是24.51和30.08 μmol/g，LPII的氧自由基吸收能力顯著強于LPI（p＜0.05）。

圖1　荔枝果肉多糖級分LPI和LPII的紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectra of LPI and LPII

2.3.2CAA抗氧化能力

本身無熒光的DCFH-DA可被細胞酯酶分解形成還原型DCFH，進一步在氧自由基的作用下形成氧化型的熒光物質DCH。CAA法通過測定抗氧化劑結合在細胞膜或進入細胞后，阻止ABAP產生的氧自由基形成DCH。通過與對照物相比，細胞熒光物質的減少量反映化合物的抗氧化能力，見圖3。由圖3可知，LPI和LPII的CAA值分別是5.36和8.72 μmol/g，LPII的細胞抗氧化能力顯著強于LPI（p＜0.05），此結果與ORAC檢測方法一致。

圖2　荔枝多糖級分LPI和LPII的ORAC值Fig.2 ORAC values of LPI and LPII

圖3　荔枝多糖級分LPI和LPII的CAA值Fig.3 CAA values of LPI and LPII

采用兩種不同檢測方法均發(fā)現(xiàn)LPII比LPI具有更好的抗氧化活性，其活性差異與其中性糖、蛋白質和糖醛酸有關。鄧媛元等［13］研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的苦瓜多糖的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)中性糖含量最高的3個品種的苦瓜多糖的ORAC指數(shù)也是最大的；Guo等［14］研究發(fā)現(xiàn)Oidiodendron truncatumGW真菌多糖中的蛋白質有利于其抗氧化活性的發(fā)揮；Jiang等［15］研究發(fā)現(xiàn)不同的青蛤多糖級分中蛋白質含量最高的CSPS-3具有最強的抗氧化活性。本研究中中性糖和蛋白質含量高的LPII比LPI具有更好的抗氧化活性，此結果與他人研究結果一致。

2.4荔枝果肉多糖級分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的關鍵酶，它可以從低聚糖類物質的非還原末端切開α-1，4糖苷鍵釋放出葡萄糖，被認為是控制II型糖尿病患者餐后血糖升高的治療靶點。在本研究中，LPI和LPII對α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在劑量依賴關系，相同濃度下LPII的抑制作用顯著強于LPI（p＜0.05）。在0.05～1 mg/mL，LPI、LPII和拜唐蘋的抑制率分別是13.00%～77.69%，13.76%～81.89%和31.95%～92.03%。LPI、LPII和拜唐蘋抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值分別是0.327，0.256，0.109 mg/mL。結果表明LPII對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強于LPI，但是兩者均低于拜唐蘋，見圖4。

圖4　荔枝多糖級分LPI和LPII的α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.4 α-Glucosidase inhibitory activities of LPI and LPII

多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性與其基本組成密切相關。Wang等［16］研究發(fā)現(xiàn)茶樹葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨其中性糖含量的增加而增強；Hsu等［17］研究發(fā)現(xiàn)云芝菌絲體多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性與其蛋白質含量呈正相關［16］。本研究中LPII因其含有更多的中性糖和蛋白質，表現(xiàn)出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，與文獻［16-17］的研究結果一致。此外，對于多糖表現(xiàn)出不同的α-葡萄糖苷酶抑制活性，有研究表明多糖的單糖組成和糖苷鏈的差異導致其與α-葡萄糖苷酶的活性中心反應程度不同，從而表現(xiàn)出不同的活性。荔枝果肉多糖與α-葡萄糖苷酶抑制活性的構效關系還有待進一步研究。

3　結 論

通過分析荔枝果肉多糖不同級分的基本組成、ORAC和CAA抗氧化能力及其對α-葡萄糖苷酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)LPII因含有更多的中性糖和蛋白質，具有更好的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究結果在一定程度上豐富了荔枝果肉多糖的生物活性，為其構效研究提供了基礎。

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Antioxidant Activity and α-Glucosidase Inhibitory Effect of Litchi Pulp Polysaccharide Fractions

HUANG Fei，ZHANG Ruifen，DONG Lihong，XIAO Juan，TANG Xiaojun，ZHANG Mingwei*
（Sericultural and Agri-Food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610，China）

In order to explore the differences of litchi pulp polysaccharide fractions，the content and composition，as well as antioxidant capacities and α-glucosidase inhibitory activities of varied litchi pulp polysaccharide fractions were studied.A DEAE-52 anion-exchange column was used to obtain two different litchi pulp polysaccharide fractions，denoted as LPI and LPII.The contents of neutral sugar，uronic acid，and protein were analyzed.In addition，their antioxidant activities were evaluated by oxygen radical absorbance capacity（ORAC）and cellular antioxidant activity（CAA）.The p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside method was used to measure the α-glucosidase inhibitory activity.The results showed that LPII contained more neutral sugar and protein than LPI，but less uronic acid.LPII exhibited higher antioxidant activity in ORAC value（30.08 μmol/g）and CAA value（8.72 μmol/g）that those of LPI（24.51 μmol/g and 5.36 μmol/g）.In addition，the IC50values of α-glucosidase inhibition were 0.33 and 0.26 mg/mL for LPI and LPII.The results demonstrated that bioactivities of litchi pulp polysaccharide fractions were related to its neutral sugar and protein contents.

litchi；polysaccharides；antioxidant activity；α-glucosidase

TS255.2；TS201.2

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.04.005

2095-6002（2016）04-0026-05引用格式：黃菲，張瑞芬，董麗紅，等.荔枝果肉多糖級分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究［J］.食品科學技術學報，2016，34（4）:26-30.

（責任編輯:檀彩蓮）

20160704

國家自然科學基金-廣東聯(lián)合基金重點項目（U1301211）；廣東省自然科學基金資助項目（2016A030310321）；廣東省科技計劃項目（2016B070701012）。

黃 菲，女，助理研究員，博士，主要從事植物多糖的結構與生物活性研究；

*張名位，男，研究員，博士，主要從事植物活性成分和功能性食品研究。通信作者。