宋仕茂　陳宇　張治國　駱志國

湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院腫瘤科，湖北十堰442000

胃癌細胞SGC7901凋亡的PI3K/Akt通路介導(dǎo)作用及雷帕霉素的作用機制分析

宋仕茂#陳宇張治國駱志國

湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院腫瘤科，湖北十堰442000

目的分析雷帕霉素對胃癌細胞中PI3K/Akt蛋白表達的影響作用，以為臨床治療提供參考。方法將生長狀態(tài)良好的胃癌細胞SGC7901隨機分為4組：對照組，雷帕霉素低劑量組、中劑量、高劑量組（n=8）。采用DAPI染色法分析各組細胞的凋亡情況；采用免疫印跡法和Real-time PCR檢測PI3K/AKT信號通路中相關(guān)蛋白PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表達。結(jié)果雷帕霉素低、中、高劑量組均可抑制細胞的增殖，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；雷帕霉素下調(diào)了胃癌細胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表達，且與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論雷帕霉素主要通過抑制PI3K、AKT及mTOR的過表達發(fā)揮腫瘤抑制作用。

細胞凋亡；PI3K/AKT信號通路；雷帕霉素；免疫印跡法

Oncol Prog，2016，14（6）

胃癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［1-3］。但目前對胃癌的治療尚無十分有效的方法，而且其確切的發(fā)病機制也尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路參與了腫瘤的增殖、分化及凋亡等過程，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且參與了腫瘤的遷移、黏附以及血管生成過程［4-6］。以該信號通路為靶點的小分子藥物有望成為腫瘤藥物開發(fā)的新思路。雷帕霉素為大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，通過作用于細胞因子受體阻斷多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低細胞周期依賴性激酶和蛋白激酶復(fù)合物活性，阻斷T淋巴細胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化［7-9］。本研究分析胃癌細胞SGC7901增殖過程與PI3K/AKT信號通路的關(guān)系，并探討雷帕霉素在此過程中的參與作用。

1　材料與方法

1.1材料

胃癌細胞SGC7901購自上海細胞所，并由本實驗室保存；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液購自美國Sigma Aldrich公司；AKT及mTOR抗體購自美國Abcam公司；PI3K抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗及顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司；PBS磷酸緩沖液購自天根生物；SGC7901細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；細胞培養(yǎng)板購自Gibco公司；離心機購自德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；蛋白垂直電泳槽購自美國Bio Rad公司；酶標儀購自美國Biotec公司；移液器為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。其余試劑為市售分析純產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.14'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色各組細胞爬片培養(yǎng)利用去甲基化藥物處理后，將制好的玻片上滴加DAP（I100 ng/ml）染液，染色10 min，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長360～400 nm。

1.2.2細胞計數(shù)試劑盒8檢測法分析細胞活性將培養(yǎng)好的胃癌SGC7901細胞接種至96孔Costa細胞培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中（37℃、5%二氧化碳，飽和濕度）進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的細胞完全隨機分組（n=8），在各組中加入相應(yīng)藥物孵育（對照組細胞給予溶劑DMSO處理；雷帕霉素低劑量、中劑量和高劑量組細胞給予的藥物濃度分別為1 μM、10 μM和100 μM），并于不同時間點取樣（0/6/12/ 24/48 h），棄去培養(yǎng)液用冰的無菌PBS充分沖洗，并加入MTT溫孵240 min。然后在每個培養(yǎng)孔中加入DMSO進行振蕩溶解，檢測各組細胞的吸光度，并計算細胞的抑制率。細胞抑制率=100%-（對照組吸光度-試驗組吸光度）/對照組吸光度× 100%。

1.2.3免疫印跡法檢測蛋白表達總蛋白提取方法均嚴格按照說明書進行。雙縮脲法進行總蛋白定量后，以等量蛋白進行垂直SDS-PAGE和半干法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后以5.0%脫脂牛奶封閉，然后與一抗溫孵4 h，并用無菌的磷酸緩沖液漂洗4次后與二抗室溫反應(yīng)2 h，隨后顯色、定影。用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，以GAPDH蛋白作為內(nèi)部參照進行定量分析。

1.2.4Real-time PCR檢測相關(guān)分子表達熒光定量PCR的擴增體系為，qPCR mix（2×）：5 μl，上游和下游引物分別為1 μl，cDNA 2 μl，去離子水1 μl；擴增條件為：95℃，10 s；60℃，40 s，共擴增30個循環(huán)。采用△Ct法計算各組mRNA的表達。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件對數(shù)-據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組變量均經(jīng)正態(tài)性檢驗。組內(nèi)造模前后資料采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1雷帕霉素促進細胞凋亡的DAPI染色及抑制率檢測分析

DAPI染色后，雷帕霉素中、高劑量組的胃癌SGC7901細胞存在部分皺縮，細胞內(nèi)可見部分凋亡小體，且細胞體積較對照組變?。欢蛣┝康睦着撩顾貙毎男螒B(tài)基本無明顯影響（圖1）。同時，細胞計數(shù)試劑盒8檢測法分析抑制率發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素低劑量、中劑量和高劑量組均可抑制細胞的增殖，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.2PI3K蛋白的表達

研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理細胞48 h后，SGC7901細胞的PI3K蛋白表達明顯降低，且與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.012，F(xiàn)= 21.54）；同時，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后PI3K表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖1　雷帕霉素促進細胞凋亡的DAPI染色分析（bar=100 μm）

表1　雷帕霉素抑制胃癌細胞增殖分析（±s）

表1　雷帕霉素抑制胃癌細胞增殖分析（±s）

組別對照組（n=8）低劑量組（n=8）中劑量組（n=8）高劑量組（n=8）抑制率（%）6 h 0.12±0.02 7.6±1.23 14.5±3.02 23.3±4.21 12 h 0.23±0.04 10.4±2.01 19.6±3.07 29.7±5.01 24 h 0.24±0.03 14.6±2.55 21.5±3.88 39.6±4.78 48 h 0.25±0.05 22.4±3.74 39.7±6.14 52.5±6.37

圖2　四組PI3K蛋白的表達情況

2.3AKT蛋白的表達

研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理細胞48 h后，SGC7901細胞的AKT蛋白表達明顯下降，且與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.028，F(xiàn)=28.37）；同時，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后AKT表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖3）

圖3　四組AKT蛋白的表達情況

2.4mTOR蛋白的表達

研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理細胞48 h后，SGC7901細胞的mTOR蛋白表達明顯下降，且與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.017，F(xiàn)=25.77）；同時，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后mTOR表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖4）

圖4　四組mTOR蛋白的表達情況

2.5雷帕霉素上調(diào)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的mRNA表達

Real-time PCR分析該通路相關(guān)蛋白mRNA表達發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理細胞后PI3K、AKT及mTOR蛋白mRNA表達均明顯降低，且與對照組比較，中劑量和高劑量組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。另外，與蛋白檢測結(jié)果一致，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后PI3K、AKT及mTOR蛋白mRNA表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。（表2）

表2　四組PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白mRNA的表達量（±s）

表2　四組PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白mRNA的表達量（±s）

組別（n=8）對照組低劑量組中劑量組高劑量組PI3K 7.44±0.92 7.29±0.87 6.56±1.02 5.44±0.72 AKT 6.81±0.82 6.68±0.91 6.43±1.04 5.43±0.43 mTOR 6.35±1.02 6.14±0.99 5.88±1.33 5.12±0.69

3　討論

胃癌是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，具有較高的病死率，給患者家庭和社會帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔。胃癌發(fā)病的早期癥狀不明顯，診斷困難，因此手術(shù)的成功切除率較低，患者的5年生存率也較低［10］；同時，胃癌手術(shù)切除后復(fù)發(fā)的比例較高。因此，化療藥物輔助術(shù)后治療在提高患者生存率和生活質(zhì)量方面發(fā)揮不可替代的作用。雷帕霉素是大環(huán)內(nèi)酯類的免疫抑制劑，具有阻斷T淋巴細胞及其他細胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化過程。本文研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素促進了胃癌細胞SGC7901發(fā)生細胞凋亡，且具有劑量依從性；同時免疫印跡法結(jié)果顯示雷帕霉素下調(diào)了PI3K、AKT及mTOR蛋白及mRNA的表達。因此，雷帕霉素主要通過抑制PI3K、AKT及mTOR的過表達發(fā)揮腫瘤抑制作用。

PI3K/AKT信號通路是多種生理及病理過程的共同通路，且參與了多種腫瘤的增殖、分化及轉(zhuǎn)移過程［11-12］。相關(guān)研究在分析PI3K/AKT/ERK通路與胃腸道腫瘤的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白在胃腸道腫瘤組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織，且該蛋白與患者的年齡及臨床分期等無關(guān)聯(lián)，表明PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白在胃腸道組織中高表達，并與腫瘤發(fā)生的早期事件存在關(guān)系［13］。已有的研究證實，PI3K/AKT通路與腫瘤生理過程中的免疫調(diào)控具有密切的相關(guān)性［14］。同時，在分析PI3K/AKT通路與CA916798誘導(dǎo)肺癌患者對順鉑耐藥的相關(guān)性研究中也發(fā)現(xiàn)，CA916798是PI3K/AKT信號通路的下游靶點，肺癌患者對順鉑的耐藥性可能與轉(zhuǎn)錄水平上CA916798的調(diào)控有關(guān)［15］。有研究對胃腸道間質(zhì)瘤與PI3K及AKT蛋白的相關(guān)性分析中也發(fā)現(xiàn)，AKT mRNA水平在高侵襲及中度侵襲腫瘤中的表達明顯高于對照組，即AKT的表達陽性率與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和黏膜受侵襲密切相關(guān)，同時PI3K與AKT蛋白的表達呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性［16］。本研究證實，雷帕霉素在抑制腫瘤細胞增殖的同時，對SGC7901細胞的PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達呈現(xiàn)抑制作用，且具有劑量依從性，表明激活的PI3K/AKT信號通路可能參與了雷帕霉素引起的胃癌細胞增殖抑制過程。細胞凋亡是細胞的程序化死亡過程，是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的主要作用機制。DAPI染色是通過DAPI透過細胞膜與DNA強力結(jié)合表現(xiàn)熒光檢測細胞的凋亡狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，DAPI染色后中、高劑量的胃癌SGC7901細胞存在部分皺縮、細胞內(nèi)可見部分凋亡小體，且細胞體積較對照組變小，而低劑量雷帕霉素對細胞的形態(tài)基本無明顯影響，表明中、高劑量的雷帕霉素引起了胃癌SGC7901細胞的凋亡過程。同時，細胞計數(shù)試劑盒8檢測法分析也獲得相同的結(jié)論：雷帕霉素提高了細胞的抑制率，且其抑制細胞的增殖具有時間和濃度依賴性，也表明雷帕霉素抑制細胞的增殖過程。

因此，激活的PI3K/AKT信號通路參與了雷帕霉素引起的腫瘤細胞的生長抑制，而雷帕霉素主要通過抑制PI3K、AKT及mTOR的過表達發(fā)揮腫瘤抑制作用。在今后的抗胃癌新藥研發(fā)是可以將PI3K/AKT信號通路蛋白作為藥物研制的潛在靶點，從而探索該通路蛋白表達抑制腫瘤細胞增殖的可能性，同時，采用基因沉默方法抑制PI3K/ AKT信號通路相關(guān)蛋白過表達也可能是未來抗胃癌治療的手段。

［1］鄒小農(nóng)，孫喜斌，陳萬青，等.2003—2007年中國胃癌發(fā)病與死亡情況分析［J］.腫瘤，2012，7（2）:109-114.

［2］王婕敏，林三仁.胃癌研究及診治新進展［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2012，1（1）:3-5.

［3］廖明娟，陳紅風.PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑在乳腺癌中的研究進展［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，6（3）:230-234.

［4］張馳，胡祥.胃癌合并肝硬化病理生理特點及外科治療［J］.中國實用外科雜志，2012，3（3）:247-250.

［5］祝冰晶，周向東.PI3K/AKT通路在肺癌轉(zhuǎn)移和耐藥中的研究［J］.中國肺癌雜志，2011，7（8）:689-694.

［6］韓璐，翟晶.雷帕霉素對人宮頸癌HeLa細胞增殖和HIF-1α及VEGF表達的影響［J］.腫瘤防治研究，2013，2（3）: 245-248.

［7］陳曦，王晗，歐陽學農(nóng)，等.PI3K/Akt信號通路活化在曲妥珠單抗耐藥機制意義的研究［J］.中國藥理學通報，2013，3（4）:568-573.

［8］吳潔玲，韓璐，楊麗肖.雷帕霉素聯(lián)合順鉑對宮頸癌Hela細胞生長和對HIF-1α與VEGF表達影響的觀察［J］.中華腫瘤防治雜志，2013，11（14）:1075-1078.

［9］張華丹，謝雅聰，翁靈，等.雷帕霉素對匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇小鼠學習記憶的改善作用［J］.浙江大學學報（醫(yī)學版），2013，5（6）:602-608.

［10］陳錦華.Her-2基因?qū)ξ赴┎∪松媛视绊懙南嚓P(guān)因素研究［D］.福建醫(yī)科大學，2013.

［11］武強，趙全年，宋衛(wèi)東.PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路在腫瘤的研究進展［J］.疾病監(jiān)測與控制，2013，7（6）:346-347.

［12］肖尤川，李云峰，楊之斌.PI3K/AKT信號通路軸在腫瘤上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中作用的研究進展［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2013，14（9）:2147-2150.

［13］孫海濤，王偉，張藝.PI3K/AKT/ERK在胃腸道腫瘤中的表達與臨床病理的關(guān)系［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2013，1（6）:1-3.

［14］武博榮，金萌，王衛(wèi)真，等.PI3K/AKT信號通路在腫瘤調(diào)控中的免疫作用及分子機制［J］.臨床合理用藥雜志，2013，5（16）:135-137.

［15］王宇亮.PI3K/AKT/mTOR通路調(diào)控CA916798:CA916798誘導(dǎo)肺癌順鉑耐藥的機制研究［D］.第三軍醫(yī)大學，2013.

［16］郭琳，王強.PI3K、Akt以及PTEN在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達及意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2012，11（7）:1401-1405.

Role of rapamycin in the PI3K/AKT mediated apoptosis of SGC7901 cell line

SONG Shi-mao#CHEN Yu ZHANG Zhi-guo LUO Zhi-guo
Department of Oncology，Hubei Taihe Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China

ObjectiveTo explore the role of rapamycin in the apoptosis of SGC7901 cell line which is mediated by PI3K/AKT signaling pathway.MethodSGC7901 cell line were randomized into 4 groups as control group，and treatment groups of rapamycin with low，medium and high dose（n=8）.The apoptosis of cell line in each group was detected by DAPI staining；western blotting and real-time PCR tests were utilized in determining the expression of related proteins as PI3K，AKT，mTOR and mRNA in PI3K/AKT signaling pathway.ResultRapamycin could induce apoptosis of SGC7901 cell line in a dose dependent and time dependent manner，with statistically significant differences observed（P＜0.05）；the expression of PI3K，AKT and mTOR in SGC7901 cell line was significantly downregulated by rapamycin as demonstrated in western blotting（P＜0.05）.ConclusionRapamycin inhibits SGC7901 mainly through restraining the over expression of PI3K，AKT and mTOR.

apoptosis；PI3K/AKT signaling pathway；rapamycin；western blotting

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.31

2016-03-03）

（corresponding author），郵箱：ssm88m@163.com