趙欣　張學(xué)斌　李漢忠

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科/北京協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京100730

Hsa-miR-498對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13增殖及凋亡的影響△

趙欣張學(xué)斌#李漢忠

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科/北京協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京100730

目的探索微小核糖核酸（micro RNA）Hsa-miR-498對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞（SW-13）增殖及凋亡的影響，并初步預(yù)測(cè)其靶基因。方法將SW-13細(xì)胞分為3組，空白對(duì)照組（A組）為未接受轉(zhuǎn)染細(xì)胞，陰性對(duì)照組（B組）為無(wú)意義寡聚核苷酸和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按1∶1混合轉(zhuǎn)染，敲低組（C組）為轉(zhuǎn)染Has-miR-498 inhibitor組。使用RT-PCR檢測(cè)各組中Has-miR-498的表達(dá)情況；應(yīng)用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率；并用miRDB初步預(yù)測(cè)與Hsa-miR-498相關(guān)的靶基因。結(jié)果經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C組細(xì)胞中Hsa-miR-498表達(dá)下降；MTT結(jié)果顯示，與A、B組相比，C組細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.05）；Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，A、B組相比，C組細(xì)胞凋亡率增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。經(jīng)miRDB初步預(yù)測(cè)Has-miR-498與細(xì)胞增殖及凋亡最相關(guān)的靶基因?yàn)镃D93和JHDM1D。結(jié)論降低Hsa-miR-498在SW-13中的表達(dá)可抑制SW-13的增殖并促進(jìn)其凋亡。表明Hsa-miR-498可能與SW-13的增殖及凋亡相關(guān)。

腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；微小核糖核酸-498

Oncol Prog，2016，14（6）

腎上腺皮質(zhì)腫瘤（adrenalcortical tumor，ACT）是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的腫瘤，尸檢中發(fā)現(xiàn)率為7.3%。在引起腎上腺皮質(zhì)醇癥的腎上腺皮質(zhì)腫瘤中，腎上腺皮質(zhì)腺瘤占10%，腎上腺皮質(zhì)癌（adrenalcortical carcinomas，ACC）占6%［1］。

微小RNA（micro RNA）是一種短鏈非編碼RNA，它的主要作用為調(diào)控靶mRNA的表達(dá)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Hsa-miR-498位于19q13.41，研究表明，Hsa-miR-498在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等疾病起病中起重要作用［2-4］，尚無(wú)研究探索Hsa-miR-498在腎上腺皮質(zhì)癌中的作用。本研究旨在初步探索Hsa-miR-498對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞系SW-13（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心）。

主要試劑包括：L15培養(yǎng)基（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；miR引物、U6引物（上海英俊生物技術(shù)有限公司）；miRNA Inhibitor套裝（蘇州吉瑪生物技術(shù)公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；MTT四甲基偶氮唑鹽（美國(guó)Sigma公司）；Annexin V-FITC（美國(guó)Invitrogen公司）。經(jīng)蘇州吉瑪生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的Has-miR-498 inhibitor。陰性對(duì)照無(wú)意義寡聚核苷酸序列為：5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'。

主要儀器包括：細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific Forma公司）；Eppendorf 5417c離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；SMA4000分光光度計(jì)（北京Meriton公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Courlter公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組SW-13細(xì)胞培養(yǎng)于L15培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），置于37℃、無(wú)CO2環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，每孔3000～10000個(gè)細(xì)胞。其中A組為空白對(duì)照組，為未接受轉(zhuǎn)染細(xì)胞。B組為陰性對(duì)照組，無(wú)意義寡聚核苷酸和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按1∶1混合。C組為轉(zhuǎn)染Has-miR-498 inhibitor組，即敲低組。

1.2.2體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)勢(shì)良好的SW-13細(xì)胞，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞置于24孔培養(yǎng)板中，37℃，無(wú)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞融合達(dá)50%～60%時(shí)，將LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒Hsa-miR-498 inhibitor按1∶1混合，孵育15 min，加入24孔板中，6 h后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后重復(fù)轉(zhuǎn)染一次，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)各組Has-miR-498的表達(dá)情況使用Trizol法提取各組細(xì)胞樣本總RNA，以U6作為內(nèi)參照進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。RT反應(yīng)程序?yàn)?6℃，30 min；42℃，42 min；85℃，5 min。RTPCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃，5 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。通過各組產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線，得到各反應(yīng)管循環(huán)閾值Ct，應(yīng)用GenePix ProV6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。定制的引物序列為：

Has-miR-498 RT Prime 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACGAAAAA-3' 5'-GCTTTCAAGCCAGGGGGCG-3' 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACAAAATATG-3' 5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3' U6 RT Prime

1.2.4MTT法檢測(cè)3組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線①接種細(xì)胞：用L15培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000～ 10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。②培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。③顯色：在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，每孔加MTT溶液（5 mg/ml用PBS配）20 μl繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。④讀取OD值：選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以0 h、24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡率①離心收集懸浮細(xì)胞，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速2000 rpm，離心時(shí)間5 min，棄培養(yǎng)基。②用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次（2000 rpm，5 min，收集細(xì)胞）。③用400 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度約為1×106/ml。④在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入10 μl PI后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5 min。⑤在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6Hsa-miR-498靶基因的初步預(yù)測(cè)經(jīng)miRDB靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具（http://mirdb.org/miRDB/），對(duì)Hsa-miR-498靶基因進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)。各組實(shí)驗(yàn)-均獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

A、B、C組2-ΔΔCt值分別為（1.00±0.00）、（1.12± 0.15）和（0.46±0.11）。C組細(xì)胞中Has-miR-498表達(dá)明顯低于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2MTT法測(cè)定3組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

C組細(xì)胞在48 h、72 h和96 h增殖率（29.80%± 1.45%，37.67%±0.59%和45.1%±1.10%）低于A組（34.60%±3.47%，41.20%±0.78%，54.00%±1.59%）和B組（36.37%±1.15%，47.17%±2.55%，53.35%± 0.28%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1　3組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.3Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

Hsa-miR-498在SW-13細(xì)胞中敲低后，A、B、C組細(xì)胞凋亡率分別為1.92%±0.82%，2.11%±0.76%和4.95%±0.81%，C組細(xì)胞凋亡率高于A、B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4Hsa-miR-498靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

經(jīng)miRDB預(yù)測(cè)Hsa-miR-498有多個(gè)靶基因，包括PDK3、JHDM1D、CD93、NAP1L3、DCTN4、KCNK10、CCPG1等。發(fā)現(xiàn)其中與細(xì)胞增殖、凋亡、血管形成最相關(guān)的靶基因?yàn)镴HDM1D和CD93。

3　討論

Micro RNA具有復(fù)雜功能和調(diào)控途徑。有研究提示Hsa-miR-498與散發(fā)三陰性乳腺癌的發(fā)病有關(guān)，在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，BRCA1為其靶基因，可能是一種癌基因［2］。Gopalan［4］的研究顯示，Hsa-miR-498在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，與結(jié)直腸癌的發(fā)生有密切關(guān)系，可能是一種抑癌基因。有研究提示卵巢癌組織中Hsa-miR-498下調(diào)提示預(yù)后欠佳，其主要的靶基因?yàn)镕OXO3［3，5］，可能是一種腫瘤抑制因子。Wang等［6］研究指出Hsa-miR-498在非小細(xì)胞肺癌中明顯下調(diào)，并與疾病的進(jìn)展有關(guān)。本研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hsa-miR-498可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞的增殖，具有部分癌基因特征，HsamiR-498表達(dá)敲低后，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖明顯下降，因此可作為治療腎上腺皮質(zhì)腫瘤靶向藥物的潛在靶點(diǎn)。但同時(shí)也應(yīng)該關(guān)注將其用作靶向藥物時(shí)帶來的不良反應(yīng)，尤其是導(dǎo)致其他組織腫瘤的發(fā)生，比如結(jié)直腸癌、卵巢癌等。

Hsa-miR-498有多個(gè)的靶點(diǎn)，經(jīng)miRDB靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生最相關(guān)的靶基因?yàn)镴HDM1D和CD93［7-8］。這些靶基因有獨(dú)特的細(xì)胞功能，比如細(xì)胞增殖、血管形成和凋亡等，為進(jìn)一步探索Hsa-miR-498作用途徑提供了線索。

本研究發(fā)現(xiàn)敲低腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞中的HsamiR-498后，腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞的增殖能力降低，提示Hsa-miR-498可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞的增殖。但查閱文獻(xiàn)目前尚無(wú)Hsa-miR-498在腎上腺皮質(zhì)癌組織中表達(dá)上調(diào)的報(bào)道，因此Hsa-miR-498可能僅有促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞增殖的作用，有部分癌基因特征，這對(duì)理解腎上腺皮質(zhì)腫瘤的發(fā)病提供了新的線索，但目前資料無(wú)法評(píng)價(jià)其促使腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞惡變的作用。進(jìn)一步研究應(yīng)檢測(cè)其在腎上腺良性腫瘤及腎上腺皮質(zhì)癌中的表達(dá)，以評(píng)價(jià)其與腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖的關(guān)系，以及主要的靶基因和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

［1］Alan J，Wein LRAW.Campbell-Walsh Urology［M］.10th ed.Elsevier，2012:1693.

［2］Matamala N，Vargas MT，Gonzalez-Campora R，et al.MicroRNA deregulation in triple negative breast cancer reveals a role of miR-498 in regulating BRCA1 expression［J］.Oncotarget，2016，7（15）:20068-20079..

［3］Cong J，Liu R，Wang X，et al.Low miR-498 expression levels are associated with poor prognosis in ovarian cancer［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（24）:4762-4765.

［4］Gopalan V，Smith RA，Lam AK.Downregulation of microRNA-498 in colorectal cancers and its cellular effects［J］.Exp Cell Res，2015，330（2）:423-428.

［5］Liu R，Liu F，Li L，et al.MiR-498 regulated FOXO3 expression and inhibited the proliferation of human ovarian cancer cells［J］.Biomed Pharmacother，2015，72:52-57.

［6］Wang M，Zhang Q，Wang J，et al.MicroRNA-498 is downregulated in non-small cell lung cancer and correlates with tumor progression［J］.J Cancer Res Ther，2015，11（Suppl）: C107-C111.

［7］Nawrocki MJ，Strugala AJ，Piotrowski P，et al.JHDM1D and HDAC1-3 mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus［J］.Z Rheumatol，2015，74（10）:902-910.

［8］Galvagni F，Nardi F，Maida M，et al.CD93 and dystroglycan cooperation in human endothelial cell adhesion and migration adhesion and migration［J］.Oncotarget，2016，7（9）: 10090-10103.

The effect of Hsa-miR-498 on proliferation and apoptosis of human adrenal cortical carcinoma cell line SW-13△

ZHAO Xin ZHANG Xue-bin#LI Han-zhong
Department of Urology/Translational Medicine Center，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ObjectiveTo investigate the effect of Hsa-miR-498 on proliferation and apoptosis of human adrenal cortical carcinoma cell line SW-13，and try to determine the target genes.MethodThe cell line was divided into three groups，including blank group（group A），negative control（NC）group（group B），and inhibitor group（group C），with no transfection，transfection of oligonucleotide and LipofectamineTM2000 transfection reagent（1∶1），and transfection of Has-miR-498 inhibitors，respectively.RT-PCR was applied to determine the expression of the Has-miR-498 in each group；then the proliferation was tested by MTT and the apoptosis by Annexin V-FITC/PI.The target genes of Hsa-miR-498 were predicted using miRDB.ResultRT-PCR showed that Has-miR-498 was knocked down in group C；MTT showed that，compared with group A and group B，proliferation slowed in group C；And in Annexin V-FITC/PI，it was found that knocking down Hsa-miR-498 could mildly promote apoptosis of SW-13 cells，though no statistically significant difference was observed（P＞0.05）.By miRDB analysis，CD93 and JHDM1D were most probably related to the proliferation and apoptosis of SW-13 cell line.ConclusionKnocking down Hsa-miR-498 could reduce proliferation and mildly promote apoptosis of SW-13 cells，suggesting a correlation between them.

adrenocortical carcinoma cell；cell proliferation；cell apoptosis；Has-miR-498

R736.6

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.11

2016-04-19）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81070628）

（corresponding author），郵箱：xuebinzh@126.com