謝有科　黃丁平

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科，南寧530011

康萊特對晚期乳腺癌患者外周血CD4及PD-1陽性T細胞的影響△

謝有科#黃丁平

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科，南寧530011

目的檢測康萊特（KLT）對晚期乳腺癌患者外周血CD4+及程序性死亡分子1（PD-1）陽性T細胞比例的影響，探討KLT在乳腺癌患者中誘導抗腫瘤免疫的作用。方法選取接受過化療或內(nèi)分泌治療后腫瘤進展的晚期乳腺癌患者30例，以KLT注射液處理；處理前后取外周血經(jīng)流式細胞術(shù)檢測治療前后外周血中CD4+和CD4+PD-1+T淋巴細胞數(shù)量變化。并選取同期健康體檢者20名為對照組，常規(guī)抽血檢測。結(jié)果晚期乳腺癌患者治療前外周血CD4+T細胞較健康人群低，而CD4+PD-1+T細胞的比例較健康人群高；經(jīng)KLT治療后的晚期乳腺癌患者外周血CD4+T細胞較治療前顯著增高，而CD4+PD-1+T細胞的比例較治療前顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論KLT有效降低晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T淋巴細胞比例，減弱機體腫瘤免疫抑制狀態(tài)。

乳腺癌；康萊特；CD4；PD-1；免疫

Oncol Prog，2016，14（6）

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移是多因素共同參與的復雜過程，與機體免疫功能密切相關(guān)。免疫監(jiān)視的失能，T細胞功能缺失及免疫抑制因子的產(chǎn)生是腫瘤免疫耐受的重要原因。程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）是細胞免疫調(diào)控中的負性調(diào)控分子，主要表達于淋巴細胞表面。研究證明，PD-1及其配體PD-L1通路在腫瘤細胞和其浸潤的淋巴細胞中的表達與部分惡性腫瘤患者預后密切相關(guān)［1-2］。PD-1/PD-L1阻斷劑（如KEYTRUDA、Opdivo）在非小細胞肺癌和黑色素瘤等臨床試驗中顯示出了巨大的臨床潛力，以PD-1/PDL1為代表的免疫治療成為繼手術(shù)治療、化療、放療、分子靶向治療之后的新方法［3-4］。但這些PD-1單抗藥物價格昂貴，存在不同程度不良反應，在臨床上受到一定的限制。傳統(tǒng)中醫(yī)中藥在調(diào)節(jié)身體亞健康狀態(tài)和免疫平衡等方面具有明顯的優(yōu)勢。以薏苡仁為原料制備而成的多功能藥物康萊特（KLT）具有直接抗腫瘤作用和多種免疫調(diào)節(jié)作用，在臨床上廣泛應用于免疫調(diào)節(jié)和輔助化療，并取得較好的療效［5-7］。本研究探討CD4+T淋巴細胞作為機體細胞免疫功能的重要組成部分，KLT對晚期乳腺癌患者外周血中CD4+和（或）PD-1+T細胞的影響，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014年12月至2015年8月收治的晚期乳腺癌患者30例，年齡38～85歲，中位年齡57歲。其中Ⅲb期11例，Ⅳ期19例；病理類型：浸潤性導管癌24例，浸潤性小葉癌6例。入組標準：經(jīng)病理、影像等檢查，確診為浸潤性導管癌或浸潤性小葉癌，至少接受過內(nèi)分泌治療和（或）解救化療，出現(xiàn)內(nèi)分泌治療耐藥或不耐受化療合并腫瘤進展。排除標準：有心腦腎等重要器官功能異常；預期存活時間＜3個月。另取20名同期體檢健康者作為對照組，中位年齡52歲。

1.2治療方法

乳腺癌患者按產(chǎn)品說明書予靜脈滴注康萊特注射液200 ml，每日1次，3周為一個療程，治療期間予支持治療，不行化療或靶向治療等抗腫瘤治療，休息2～7 d后進行第2個療程，共行兩個療程。

1.3檢測指標

乳腺癌患者在治療前和治療后1周分別抽靜脈血5 ml進行檢測。健康體檢者即時抽取靜脈血。采用流式細胞術(shù)檢測乳腺癌患者治療前后和健康體檢組外周血中CD4及PD-1雙陽性T淋巴細胞比例，并進行分析。流式細胞術(shù)檢測流程如下：取混勻后的外周血每管100 μl，加入10 μl Fc受體封閉液（美國BD公司），混勻，置于室溫10 min；再加入5 μl熒光抗體：PE-anti-hCD4抗體（sc-1176PE，購于Santa Cruz公司），F(xiàn)ITC-anti-hPD-1抗體（ab95791，購自abcam公司），混勻，置于室溫，避光孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），2000 r/min，5 min離心以除去非特異性結(jié)合抗體；加入1 ml紅細胞裂解工作液（購自美國BD公司）置于室溫10 min，離心后棄上清，再以PBS洗滌1次；然后用少量PBS重懸細胞，上機分析。采用流式細胞儀（BD FACS ARIA）進行檢測。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計-軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1兩組外周血中CD4+、PD-1+T細胞比例比較

晚期乳腺癌患者外周血中CD4+細胞低于對照組，而CD4與PD-1雙陽性T細胞比例高于對照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001、0.003）。（表1、圖1）+T細胞比例比較

表1　晚期乳腺癌患者與健康人群組外周血T細胞亞群比較（%±s）

表1　晚期乳腺癌患者與健康人群組外周血T細胞亞群比較（%±s）

2.2治療前后患者外周血CD4+PD-1+T細胞比例比較

KLT治療后晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T細胞的比例較治療前顯著降低，CD4+T細胞較治療前顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表2、圖1）

圖1　晚期乳腺癌患者及對照組患者外周血中CD4+及PD-1+T細胞比例

表2　晚期乳腺癌患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群比例比較（%±s）

表2　晚期乳腺癌患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群比例比較（%±s）

3　討論

乳腺癌患者經(jīng)過內(nèi)分泌治療如他莫昔芬、芳香化酶抑制劑和（或）卵巢功能抑制后出現(xiàn)全身多發(fā)轉(zhuǎn)移，進入腫瘤晚期。對于晚期乳腺癌患者，目前臨床治療方法包括化療，曲妥珠單抗靶向治療，新型內(nèi)分泌藥物（如氟維司群）和新型藥物（palbociclib、依維莫司等）治療［8］。從國內(nèi)臨床實踐來看，化療并不能阻止腫瘤的進展，而一些新的治療方法，如靶向藥物、新型藥物等都因價格昂貴而阻礙其在臨床上的應用。PD-1/PD-L1阻斷劑作用機制研究表明，當CD4+T細胞存在的情況下，PD-L1阻斷劑首先阻斷CD4+T細胞表面的PD-L1，繼而活化CD4+T細胞；當CD4+T細胞活化后才開始阻斷CD8+T細胞表面PD-L1進而活化CD8+T細胞。因為腫瘤誘導CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞可抑制免疫應答［9］，削弱CD8+T細胞在抗腫瘤中的作用，所以PD-1/PD-L1阻斷劑的腫瘤殺傷效應在無CD4+T細胞介導時效率更高［10］。PD-1/PD-L1阻斷劑給人們帶來全新的啟示：通過抑制腫瘤組織內(nèi)浸潤的淋巴細胞可以激活機體腫瘤免疫，從而得到持久的抗腫瘤免疫效果。

PD-1是表達于多種腫瘤表面的共抑制分子，它在介導乳腺腫瘤細胞免疫逃逸中起著重要作用。PD-1的主要配體PD-L1（B7-H1）選擇性地表達在許多腫瘤上和腫瘤微環(huán)境內(nèi)的抗原提呈細胞、活化T細胞、活化B細胞、巨噬細胞上。而CD4+T淋巴細胞分為多個功能亞群，在抗腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用，在癌癥患者中表達水平普遍降低。研究表明，CD4+T淋巴細胞表達抑制性分子PD-1在不同健康狀態(tài)下呈現(xiàn)不同的改變，如胃腺癌患者外周血中CD4+T細胞表面PD-1表達較健康人群明顯上調(diào)，而且晚期患者外周血CD4+PD-1+T細胞的比例明顯高于早期患者［1］。而腫瘤內(nèi)浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）因腫瘤細胞原因而處于功能受損或缺失狀態(tài)，特別是乳腺癌組織中PD-1+、TIL和FOXP3+（forkhead box P3+），TIL往往提示預后不佳［11］。本研究結(jié)果顯示，晚期乳腺癌患者CD4+T淋巴細胞低于健康人群，而CD4+PD-1+T淋巴細胞高于健康人群，這說明晚期乳腺癌患者機體免疫功能處于免疫低下狀態(tài)，而且CD4+PD-1+T淋巴細胞代表的腫瘤免疫逃逸處于高峰狀態(tài)。盡管未見乳腺癌外周血及TIL中的CD4+PD-1+T淋巴細胞之間相關(guān)性的報導，本課題組推測兩者之間可能表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，即外周血CD4+PD-1+T淋巴細胞可代表同種表型的TIL，提示乳腺癌病灶局部微環(huán)境中的抗腫瘤免疫狀態(tài)高于健康人群。

康萊特對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制和殺傷作用，臨床主要用于提高化療敏感性，誘導細胞凋亡，減輕化療不良反應及免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，康萊特可顯著提高化療患者CD3+、CD4+、CD4/CD8值，保護化療過程中機體的免疫功能，增強化療耐受性［6］。本研究也提示康萊特能明顯提高晚期乳腺癌患者外周血CD4+T淋巴細胞比例，結(jié)果與既往文獻報道相符［6］。更重要的是，康萊特治療后晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T淋巴細胞較治療前明顯下降，說明康萊特在上調(diào)機體免疫力的同時，減弱腫瘤免疫耐受，有助于誘導特異性腫瘤免疫，提高機體抗腫瘤免疫水平。但康萊特治療后外周血CD4+PD-1+T淋巴細胞水平下降仍高于健康人群的數(shù)值，提示康萊特阻斷PD-1/ PD-L1通路的能力相對較弱，可能需要結(jié)合其他治療手段，特別是靶向PD-1/PD-L1通路的藥物，以達到有效控制腫瘤的目的。同時本結(jié)果不排除因晚期乳腺癌患者腫瘤負荷過大所致的康萊特療效減弱。

本研究發(fā)現(xiàn)，康萊特治療晚期乳腺癌，可以提高患者的外周血CD4+T細胞比例，降低CD4+PD-1+T淋巴細胞比例，從而提高患者機體免疫功能，減弱局部腫瘤免疫抑制狀態(tài)。

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The effect of Kanglaite on the PD-1+and CD4+T lymphocytes in the peripheral blood of patients with advanced breast cancer△

XIE You-ke#HUANG Ding-ping
Department of Oncology，Ruikang Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，Guangxi China

ObjectiveTo investigate the effect of Kanglaite（KLT）on the PD-1+and CD4+T lymphocytes in peripheral blood of patients with advanced breast cancer（ABC），and discuss the role of KLT in inducing anti-cancer immune response in these patients.Method30 patients with ABC who had prior chemotherapy or endocrine therapy were included in this study as study group，given KLT injection，and the peripheral blood of these patients were sampled before and after treatment of KLT to determine the level of T lymphocytes of CD4+and CD4+/PD-1+using flow cytometry.Another 20 case of healthy adults were enrolled as control，whose peripheral blood was sampled and tested with the same procedure as in study group.ResultThe level of CD4+T lymphocytes in the peripheral blood of ABC patients before treatment was lower than that in control group，but the level of CD4+/PD-1+in these patients was notably higher.After treatment of KLT，the level of CD4+was increased in study group after treatment，and the level of CD4+/PD-1+was lower than that before treatment，with statistically significant difference observed（P＜0.05）.ConclusionKLT is effective in decreasing the level of CD4+PD-1+T lymphocytes in peripheral blood of advanced breast cancer patients，and thus attenuates tumor immunosuppression status in those patients.

breast cancer；Kanglaite；CD4；PD-1；immune

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.07

2016-01-14）

國家自然科學基金（81560476）；八桂學者建設(shè)工程專項經(jīng)費資助

（corresponding author），郵箱：xieyouke1215@sina.com.