袁 陸，張麗杰，李 鷗，楊艷艷，張 琪，王新月，耿美麗，姜春陽，王 洋，馬 冬

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白介素17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與宮頸癌的相關(guān)性研究

袁 陸，張麗杰，李 鷗，楊艷艷，張 琪，王新月，耿美麗，姜春陽，王 洋，馬 冬

目的探討白介素17(IL-17)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與宮頸癌的相關(guān)性，為臨床診斷和免疫治療宮頸癌提供新思路。方法選取2011年3月—2012年5月在唐山工人醫(yī)院住院部就診的宮頸癌患者43例(宮頸癌組)、癌前病變患者62例〔其中宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ級(jí)23例(CINⅠ組)、CINⅡ～Ⅲ級(jí)39例(CINⅡ～Ⅲ組)〕，另選取本院同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者43例作為對(duì)照組。4組患者宮頸組織標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)獲得。提取4組宮頸組織DNA并進(jìn)行高危型人乳頭瘤病毒(HPV)16 DNA檢測(cè)，采用CpG島甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，采用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè)IL-17 mRNA表達(dá)水平，分析IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與IL-17 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性及其與HPV16 DNA陽性率的關(guān)聯(lián)性，并分析不同年齡、臨床特征宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率。結(jié)果4組HPV16 DNA陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率低于對(duì)照組(P<0.01)；CINⅠ組與對(duì)照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組和宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；CINⅠ組與CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化檢測(cè)結(jié)果將所有患者分為IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化患者(93例)和非甲基化患者(55例)，IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島非甲基化患者IL-17 mRNA表達(dá)水平高于甲基化患者(P<0.05)。所有患者宮頸組織中IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與IL-17 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.627，P<0.05)。所有患者宮頸組織中IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率和HPV16 DNA感染陽性率存在關(guān)聯(lián)性(χ2=33.209，P<0.05,r=-0.474)。臨床分期為Ⅱ期、Ⅲ期的宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率低于臨床分期為Ⅰ期的宮頸癌患者(P<0.05)；不同年齡、病理分級(jí)、腫瘤直徑及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與高危型HPV16感染具有關(guān)聯(lián)性，IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島低甲基化可能與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

宮頸腫瘤；白細(xì)胞介素17；DNA甲基化；CpG島；人乳頭瘤病毒16

袁陸，張麗杰，李鷗，等.白介素17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與宮頸癌的相關(guān)性研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(27)：3300-3305.[www.chinagp.net]

YUAN L,ZHANG L J,LI O,et al.Correlation between CpG island methylation in IL-17 gene promoter and cervical cancer[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3300-3305.

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[1-2]，同時(shí)宿主遺傳、自身免疫反應(yīng)[3-4]等因素對(duì)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展亦十分重要。白介素(IL)-17是一類促炎性細(xì)胞因子，主要由活化的CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2免疫平衡和清除細(xì)胞外病原體方面發(fā)揮重要作用，與自身免疫和腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。相關(guān)臨床研究顯示，IL-17可能參與宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。CpG島是指在基因組中長(zhǎng)度為300～3 000 bp富含CpG二核苷酸的區(qū)域，啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)是基因轉(zhuǎn)錄所必需的，而CpG序列中C的甲基化是導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄被抑制的可能機(jī)制之一[7]，但其在宮頸癌進(jìn)展中的變化及臨床意義尚未見報(bào)。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)法研究IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，結(jié)合宮頸癌的臨床病例特征與HPV檢測(cè)結(jié)果，探討IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與宮頸癌的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡28～69歲，臨床資料及病理資料完整；(2)無子宮切除史；(3)納入研究時(shí)未妊娠；(4)手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，且患者術(shù)前未行化療、放療或免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前3個(gè)月行陰道藥物治療及任何宮頸手術(shù)者；(2)卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等患者；(4)存在供血不足的慢性疾病史：(5)肝硬化、腎衰竭、心血管疾病、有藥物依賴者；(6)精神疾病患者。

1.2臨床資料選取2011年3月—2012年5月在唐山工人醫(yī)院住院部就診的宮頸癌患者43例(宮頸癌組)、癌前病變患者62例〔其中CINⅠ級(jí)23例(CINⅠ組)、CINⅡ～Ⅲ級(jí)39例(CINⅡ～Ⅲ組)〕，另選取本院同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者43例作為對(duì)照組。4組患者宮頸組織標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)獲得，于-80 ℃冰箱保存。宮頸癌患者的臨床分期參照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟子宮頸癌的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，病理類型參照WHO制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]。本研究經(jīng)唐山工人醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，臨床資料的收集和組織標(biāo)本的采集均經(jīng)研究對(duì)象知情同意。

1.3方法

1.3.1宮頸組織DNA的提取及HPV16 DNA檢測(cè)[10]采用飽和酚三氯甲烷抽提法提取宮頸組織細(xì)胞DNA，PCR擴(kuò)增HPV16 DNA基因片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.3.2MSP法檢測(cè)IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)[7]按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit試劑盒說明書對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾及純化。檢索NCBI(AY630567)IL-17基因序列，確定啟動(dòng)子區(qū)，采用Methyl Primer Express v1.0軟件分析IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島并設(shè)計(jì)甲基化與非甲基化兩對(duì)引物(由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成)。IL-17啟動(dòng)子甲基化上游引物5′-TTTTTATGATTTTATTGGGGGC-3′，下游引物5′-ATAAACAAAATATAACGCTATCGTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度138 bp。非甲基化上游引物5′-TTTATGATTTTATTGGGGGTGG-3′，下游引物5′-AATAAACAAAATATAACACTATCATC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度137 bp。PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各3 μl，DNA模板2 μl，超純水25 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱3 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：電泳結(jié)果只出現(xiàn)非甲基化條帶視為非甲基化結(jié)果；電泳結(jié)果同時(shí)出現(xiàn)甲基化和非甲基化條帶或只出現(xiàn)甲基化條帶視為甲基化結(jié)果。PCR產(chǎn)物送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證甲基化或非甲基化檢測(cè)結(jié)果。

1.3.3半定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè)IL-17mRNA表達(dá)水平Trizol法提取宮頸組織細(xì)胞總RNA，人IL-17mRNA序列(NM 002190)下載自NCBI網(wǎng)站，采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，采用β-actin(其序列下載自NCBI網(wǎng)站)作為內(nèi)參基因。IL-17mRNA上游引物5′-GAAGGCAGGAATCACAAT-3′，下游引物5′-AGCCCACGGACACCAGTA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度138 bp。β-actin上游引物5′-TGCCGACAGGATGCAGAAG-3′，下游引物5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度76 bp。RT-PCR反應(yīng)體系為2×Reaction Mix 25 μl，總RNA 1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，RT/Platinum?Taq Mix 1 μl，超純水50 μl。RT-PCR反應(yīng)條件：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)熱2 min，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，行半定量分析，IL-17 mRNA與β-actin 的綜合光密度(OD)比值代表相對(duì)表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.14組患者一般資料比較對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組及宮頸癌組年齡、婚史、初潮年齡、經(jīng)期時(shí)長(zhǎng)、月經(jīng)周期、流產(chǎn)次數(shù)、吸煙率、飲酒率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2HPV16 DNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組HPV16 DNA陽性率分別為16.3%(7/43)、47.8%(11/23)、69.2%(27/39)、90.7%(39/43)。4組HPV16 DNA陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.108，P<0.001)。

2.3IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化檢測(cè)結(jié)果MSP檢測(cè)結(jié)果見圖1～2(本文圖1～2彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率分別為81.4%(35/43)、73.9%(17/23)、51.3%(20/39)和48.8%(21/43)。4組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.389，P=0.004)。其中CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率低于對(duì)照組(χ2值分別為4.850、6.835，P<0.01)；CINⅠ組與對(duì)照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為1.319、0.606、1.235，P>0.05)；CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.150，P>0.05)。

表1　4組患者一般資料比較

注：a為χ2值；CIN=宮頸上皮內(nèi)瘤變；吸煙定義為每天吸煙至少1支，連續(xù)吸煙6個(gè)月以上；飲酒定義為每周飲酒至少1次(≥250 ml/次)，連續(xù)6個(gè)月以上

2.4IL-17 mRNA表達(dá)水平比較對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組及宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平分別為(0.50±0.18)、(0.62±0.26)、(0.70±0.19)和(0.76±0.29)。4組IL-17 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.026,P<0.05)。其中CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組和宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-3.331、-2.584、-2.550，P<0.05)；CINⅠ組與CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.609、1.843，P>0.05)；CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.117，P>0.05)。根據(jù)IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化檢測(cè)結(jié)果將所有患者分為IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化患者(93例)和非甲基化患者(55例)，其IL-17 mRNA表達(dá)水平分別為(0.50±0.16)、(0.90±0.17)。IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島非甲基化患者IL-17 mRNA表達(dá)水平高于甲基化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.928，P<0.05)。

2.5IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與IL-17 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性所有患者宮頸組織中IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率為62.8%(93/148)，IL-17 mRNA表達(dá)水平為(0.65±0.29)。所有患者宮頸組織中IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與IL-17 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.627，P<0.05)。

2.6IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與HPV16 DNA陽性率的關(guān)聯(lián)性分析所有患者宮頸組織中IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率和HPV16 DNA感染陽性率存在關(guān)聯(lián)性(χ2=33.209，P<0.05,r=-0.474，見表2)。

2.7不同年齡和臨床特征宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較不同臨床分期的宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中臨床分期為Ⅱ期、Ⅲ期的宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率低于臨床分期為Ⅰ期的宮頸癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、病理分級(jí)、腫瘤直徑及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

注：N為空白對(duì)照，1為對(duì)照組，2為宮頸癌組，3為CINⅠ組，4為CINⅡ～Ⅲ組，U表示非甲基化，M表示甲基化；CIN=宮頸上皮內(nèi)瘤變

圖1MSP法檢測(cè)IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Figure 12% agarose gel electrophoresis results of CpG island methylation status in IL-17 gene promoter was detected by MSP

注：MSP=甲基化特異性PCR

圖2MSP測(cè)序驗(yàn)證

Figure 2Sequencing verification of MSP

表2宮頸組織中IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與HPV16 DNA感染的結(jié)果

Table 2Correlation between CpG island methylation status of IL-17 gene promoter and HPV16 DNA infection in cervical tissues

IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化HPV16DNA+ -合計(jì)+3657 93 -48 7 55 合計(jì)8464148

注：IL-17=白介素17；HPV=人乳頭瘤病毒

表3不同年齡和臨床特征宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率比較〔n(%)〕

Table 3Comparsion of CpG island methylation rate of IL-17 gene promoter of cervical cancer patients in different ages and clinical features

項(xiàng)目例數(shù)IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率χ2值P值年齡(歲)0.1960.658 <501910(23.3) ≥502411(25.6)病理分級(jí)4.5620.109 高分化鱗癌76(14.0) 中分化鱗癌239(20.9) 低分化鱗癌136(14.0)臨床分期8.7680.014 Ⅰ期2517(39.5) Ⅱ期113(7.0)a Ⅲ期71(2.3)a腫瘤直徑(cm)1.9830.203 <32912(27.9) ≥3149(20.9)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.6010.438 有127(16.3) 無3114(32.6)

注：病理分級(jí)及臨床分期的兩兩比較采用Fisher′s確切概率法，其余采用χ2檢驗(yàn)；與臨床分期為Ⅰ期的患者比較，aP<0.05

3　討論

宮頸癌是由慢性宮頸炎癥經(jīng)歷各種癌前病變演變而成。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要影響因素，而單獨(dú)HPV感染不足以引起宮頸癌。IL-17是主要由Th亞群分泌的促炎性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的招募、激活中性粒細(xì)胞的功能，在促進(jìn)細(xì)胞增殖及新生血管生成過程中發(fā)揮重要作用。目前，IL-17在宮頸癌變過程中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用還是抑制作用尚存在爭(zhēng)議[11]。細(xì)胞因子DNA甲基化能改變腫瘤細(xì)胞的惡性程度[12]。HASHIMOTO等[13]研究證實(shí)，IL-8基因甲基化水平降低能促使IL-8水平升高，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。CAMPOS等[14]研究顯示，干擾素γ(IFN-γ)基因甲基化水平升高能使具有病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的IFN-γ水平下降，促使牙根尖腫物的形成。因此本研究從IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化角度探討其在宮頸癌病變過程中的表達(dá)情況及其與高危型HPV感染的關(guān)系，為宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展提供科學(xué)理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率低于對(duì)照組；CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組IL-17 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與IL-17mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率和HPV 16 DNA感染陽性率存在關(guān)聯(lián)性。因此推測(cè)IL-17在宮頸癌變過程中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用，分析原因?yàn)椋篒L-17一方面可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌IL-6和IL-8，協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，加速腫瘤周圍血管的形成；另一方面與存在于細(xì)胞膜上的跨膜蛋白白介素17受體C(IL-17RC)特異性結(jié)合，激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。青文婕等[15]研究表明，在裸鼠體內(nèi)植入人宮頸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-17可促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞增生，在腫瘤部位促進(jìn)IL-6分泌，激活巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及抑制抗腫瘤功能。IL-17可促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞增長(zhǎng)，使腫瘤體積明顯增大。鄧康麗[16]的研究亦表明，IL-17能促進(jìn)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的體外增殖、抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡。IL-17RC啟動(dòng)子區(qū)CpG島的低甲基化在眼局部炎癥、滲出、新生血管形成的過程中發(fā)揮了一定作用[17]。同時(shí)BENARD等[18]、張哲雄等[19]和薛紀(jì)森等[20]研究均表明，HPV感染陽性患者、宮頸癌患者的IL-17水平均較HPV陰性患者明顯增高，提示IL-17與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)系，本研究亦證實(shí)該觀點(diǎn)。因此本研究認(rèn)為，IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的低甲基化狀態(tài)可能與HPV感染協(xié)同促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。但由于本研究樣本量較少，且本研究?jī)H針對(duì)唐山地區(qū)婦女，因此可能存在一定偏倚，仍需以后繼續(xù)擴(kuò)大樣本量及地域范圍深入研究。

分析宮頸癌患者IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與年齡、臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化率與年齡、病理分級(jí)、腫瘤直徑、淋巴結(jié)狀態(tài)無關(guān)，但與臨床分期存在一定聯(lián)系，提示IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與宮頸癌的惡性進(jìn)展可能有關(guān)。宋利[21]研究亦證實(shí)IL-17表達(dá)水平和宮頸癌的臨床分期有關(guān)，宮頸癌晚期患者的IL-17表達(dá)水平高于宮頸癌早期患者，而IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的降低是其表達(dá)水平升高的重要因素。IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的低甲基化可能是促使宮頸癌病情進(jìn)展的一個(gè)重要因素，IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率可作為預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后的早期指標(biāo)。

綜上所述，宮頸癌組織IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率與IL-17 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與HPV16 DNA陽性率存在關(guān)聯(lián)性，推測(cè)IL-17基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島低甲基化狀態(tài)可抑制宮頸癌患者免疫功能，為臨床診斷和免疫治療宮頸癌提供參考。

作者貢獻(xiàn)：袁陸進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；張麗杰、李鷗、楊艷艷、張琪、王新月、耿美麗、王洋進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、資料收集，姜春陽進(jìn)行文章評(píng)估，馬冬進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Correlation between CpG Island Methylation in IL-17 Gene Promoter and Cervical Cancer

YUANLu,ZHANGLi-jie,LIOu,YANGYan-yan,ZHANGQi,WANGXin-yue,GENGMei-li,JIANGChun-yang,WANGYang,MADong.

NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,KeyLaboratoryofHebeiCoalOccupationalHealthandSafety,Tangshan063000,ChinaCorrespondingauthor:MADong,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,KeyLaboratoryofHebeiCoalOccupationalHealthandSafety,Tangshan063000,China;E-mail:mamamadong@163.com

ObjectiveTo investigate the correlation between CpG island methylation of IL-17 gene promoter and cervical cancer,and to provide new ideas for clinical diagnosis and immunotherapy of cervical cancer.Methods43 cervical cancer patients (cervical cancer group) and 62 patients with precancerous lesions〔23 cases with CINⅠ(CINⅠ group),39 cases with CINⅡ～Ⅲ(CINⅡ～Ⅲ group)〕 who received treatment in Inpatient Department of Tangshan Gongren Hospital from March 2011 to May 2012 were selected,and another 43 patients who had undergone total abdominal hysterectomy in this hospital at the same period due to uterine fibroids were enrolled as control group.Cervical tissue specimens of patients in four groups were obtained by surgery.DNA in cervical tissue of patients in four group was extracted to make a detection of HPV16 DNA,CpG island methylation status in IL-17 gene promoter was detected by using CpG island methylation specific PCR (MSP),IL-17 mRNA expression levels were detected by semi-quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR),correlation between CpG island methylation rate of IL-17 gene promoter and IL-17 mRNA expression levels,and the relevance of this rate to the positive rate of HPV16 DNA were analyzed,and CpG island methylation status of IL-17 gene promoter in cervical cancer patients of different ages and clinical features were also analyzed.ResultsHPV16 DNA positive rates in four groups were significantly different (P<0.001).CpG island methylation rate of IL-17 gene promoter in CINⅡ～Ⅲ group and cervical cancer group was significantly lower than that in control group(P<0.01);CpG island methylation rates of IL-17 gene promoter in CINⅠ group and control group,CINⅠ group,CINⅡ～Ⅲ group,cervical cancer group were not significantly different (P> 0.05);CpG island methylation rates of IL-17 gene promoter between CINⅠgroup and CINⅡ～Ⅲ group were not significantly different (P>0.05).The expression levels of IL-17 mRNA in CINⅠ group,CINⅡ～Ⅲ group and cervical cancer group were higher than those in control group (P<0.05);the expression levels of IL-17 mRNA in CINⅠgroup,CINⅡ～Ⅲ group and cervical cancer group was not significantly different (P>0.05);the expression level of IL-17 mRNA between CINⅡ～Ⅲ group and cervical cancer group was not significantly different (P>0.05).According to the detected results of CpG island methylation in IL-17 gene promoter,all patients were divided into patients with CpG island methylation of IL-17 gene promoter (93 cases) and non-methylation patients (55 cases),IL-17 mRNA expression level of patients with CpG island non-methylation in IL-17 gene promoter was higher than that in methylation patients (P<0.05).In all patients′ cervical tissues,CpG island methylation rate of IL-17 gene promoter was negatively correlated with its mRNA expression level(rs=-0.627,P<0.05).There was correlation between CpG island methylation rate of IL-17 gene promoter in all patients′ cervical tissue and infection positive rates of HPV16 DNA (χ2=33.209,P<0.05,r=-0.474).CpG island methylation rate of IL-17 gene promoter in cervical cancer patients at Ⅱ and Ⅲ clinical stages were lower than that of patients at Ⅰ clinical stage (P<0.05);CpG island methylation rates of IL-17 gene promoter among cervical cancer patients of different ages,pathological grading,tumor diameter,and with or without lymph node metastasis were not significantly different (P>0.05).ConclusionCpG island methylation of IL-17 gene promoter is related with high-risk HPV16 infection,CpG island methylation of IL-17 gene promoter may be associated with the occurrence and development of cervical cancer.

Uterine cervical neoplasms；Interleukin-17；DNA methylation；CpG islands；Human papillomavirus 16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81541149)；河北省青年科學(xué)自然基金(H 2016209046)

063000河北省唐山市，華北理工大學(xué)，河北省煤炭職業(yè)衛(wèi)生與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(袁陸，張琪，王新月，王洋，馬冬)；唐山工人醫(yī)院婦科(張麗杰，李鷗，楊艷艷，耿美麗)；天津市人民醫(yī)院胸外科(姜春陽)

馬冬，063000河北省唐山市，華北理工大學(xué)，河北省煤炭職業(yè)衛(wèi)生與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；E-mail：mamamadong@163.com

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.009

2016-03-06；

2016-08-12)