溫博，徐貝貝，王炳元

美他多辛對(duì)酒精性肝病大鼠肝損傷的保護(hù)作用與抑制肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平有關(guān)

溫博，徐貝貝，王炳元

目的觀察美他多辛對(duì)酒精性肝?。ˋLD）大鼠的保護(hù)作用及其對(duì)血清細(xì)胞因子水平的影響。方法將24只雄性Wistar大鼠分為對(duì)照組（NC，n=8）、酒精性肝病組（ALD，n=8）和美他多辛治療組（MT，n=8）。在NC組和ALD組，給予等滲鹽水灌胃，給予MT組等滲鹽水和美他多辛（300 mg·kg-1·d-1）灌胃。2 w后，繼續(xù)給予NC組等滲鹽水，而在ALD組和MT組，給予50%酒精5 g·kg-1灌胃，1次/h，共3次。在末次灌胃8 h取血，采用ELISA法檢測(cè)NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10；取肝組織，采用RT-PCR法檢測(cè)NF-κB和炎癥因子mRNA水平。兩個(gè)樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)或近似t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用LSD檢驗(yàn)。結(jié)果ALD組血清ALT較NC組顯著升高［（100.13±10.64）U/L對(duì)（33.37±4.81）U/L，P＜0.05］，血清AST和GGT水平也顯著升高（P值均＜0.05）；正常組動(dòng)物血清IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL8和NF-ΚB水平分別為（14.73±2.03）pg/ml、（92.38± 12.85）pg/ml、（2.66±0.81）pg/ml、（43.57±10.62）ng/ml、（0.29±0.07）ng/ml和（679.45±36.38）pg/ml，ALD動(dòng)物分別為（16.19±1.94）pg/ml、（1927±233.69）pg/ml、（16.92±2.38）pg/ml、（127.49±9.33）ng/ml、（2.63±0.22）ng/ml和（1247.35±146.05）pg/ml，而美他多辛處理組則分別為（36.81±4.53）pg/ml、（304.13±34.79）pg/ml、（8.83± 1.01）pg/ml、（81.98±8.02）ng/ml、（1.45±0.22）ng/ml和（814.84±82.40）pg/ml，提示ALD組血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著高于NC組（P值均＜0.05），MT組血清TNF-α、IL-1β、IL6和IL-8水平顯著低于ALD組（P值均＜0.05），IL-10水平顯著高于ALD組（P＜0.05）；ALD組肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平顯著高于NC組（P值均＜0.05），MT組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平顯著低于，而IL-10 mRNA水平顯著高于ALD組（P＜0.05）。結(jié)論美他多辛對(duì)酒精性肝病大鼠的肝損傷有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是抑制了與NF-κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制了TNF-α、IL-1β、IL6和IL-8等促炎因子水平，升高了抗炎因子IL-10水平有關(guān)。

酒精性肝??；美他多辛；NF-κB；細(xì)胞因子；大鼠

我國(guó)酒精性肝?。ˋLD）的發(fā)病率在飲酒者中達(dá)6.8%［1，2］。有研究者曾在湖南省居民的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，ALD的發(fā)病率為4.4%，其中酒精性肝炎的發(fā)病率為1.5%，酒精性肝硬化發(fā)病率為0.6%［3］。肝臟是酒精代謝的主要器官。短時(shí)間內(nèi)大量飲酒是造成肝損傷的主要原因之一。酒精性肝損傷復(fù)雜的病理生理學(xué)過(guò)程以及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚。目前，仍缺乏治療ALD的有效藥物。美他多辛（Metadoxine）是一種由吡咯烷酮羧酸和吡哆醇的成鹽形成的藥物，是乙醛脫氫酶的激活劑，能夠加快血液和組織中的酒精代謝，因此被歐洲多個(gè)國(guó)家作為急性酒精中毒（AAI）的輔助治療藥物［4，5］。研究表明，在對(duì)AAI患者的雙盲對(duì)照臨床試驗(yàn)中，美他多辛能夠顯著改善臨床癥狀，并能顯著降低血液中的酒精含量［6］，但美他多辛的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在探討美他多辛對(duì)急性酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用及其對(duì)細(xì)胞因子水平的影響，為美他多辛治療急性酒精性肝損傷提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品和試劑雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（150±10）g，購(gòu)于我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度控制在（23±2）℃，濕度控制在45%～65%，明暗交替為12 h。美他多辛由浙江震元制藥有限公司提供。檢測(cè)血清ALT、AST、GGT和核因子-κB試劑盒（南京建成生物工程研究所），檢測(cè)白介素IL-1β、白介素IL-6、白介素IL-8、白介素IL-10和腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒（深圳達(dá)科為公司）。

1.2酒精性肝病模型制備將24只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組，n=8）、酒精性肝病模型組（ALD組，n=8）和美他多辛治療組（MT組，n=8）。給予所有大鼠普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。每日監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量并觀察生存情況。給予NC組和ALD組等滲鹽水1 ml灌胃，1次/d，給予MT組等滲鹽水1 ml及美他多辛300 mg·kg-1d-1灌胃。2 w后，繼續(xù)給予NC組等滲鹽水1 ml，而給予ALD組和MT組動(dòng)物50%酒精5 g·kg-1灌胃，1次/12 h，共3次。末次灌胃8 h后，脫頸處死動(dòng)物。大鼠禁食8 h，記錄體質(zhì)量，給予10%水合氯醛（0.3 mg·kg-1）腹腔內(nèi)注射，心臟穿刺取血5 ml，立即4℃，10000 r/m離心，10 min，分離血清，檢測(cè)生物化學(xué)指標(biāo)和細(xì)胞因子。取肝組織1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，浸泡于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色，以Knodell（HAI）評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肝臟炎癥程度進(jìn)行評(píng)分［7］。

1.3肝組織細(xì)胞因子mRNA檢測(cè)采用RT-PCR法，肝組織于-80℃保存后，按RNA提取步驟提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取cDNA 2 μl。引物均由華大生物有限公司設(shè)計(jì)、合成。β-actin上游引物：5' -AGCGCAAGTACTCTGTGTGG-3'，下游引物：5' -AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'；TNF-α上游引物：5'-GTGGGCACAGTAATGTGGAG-3'，下游引物：5'-TACACACGCTTGTTCGTTCA-3'；IL-β上游引物：5'-TCTGTGACTCGTGGGATGAT-3'，下游引物：5'-TTGTTGTTCATCTCGAAGCC-3'；IL-10上游引物：5'-TAAGGGTTACTTGGGTTGCC-3'，下游引物：5'-CCAGAGGGTCTTCAGCTTCT-3'；IL-6上游引物：5'-CTTGGGACTGATGTTGTGAC-3'，下游引物：5'-AATTAAGCCTCCGACTTGTG-3'；IL-8上游引物：5'-GCGGAGAGATGAGAGTCTG-3'，下游引物：5'-TCCAAGGGAAGCTTCAACAC-3'；NF-κB上游引物：5'-TCCCCCAGAGACCTCATAGT-3'，下游引物：5'-TGGAAATTCCTGATCCCGAC-3'。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示。對(duì)方差不齊資料，采用近似t檢驗(yàn)或Dunnett T3檢驗(yàn)，對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析；對(duì)方差齊性資料，采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1急性酒精性肝損傷模型成模情況光鏡下，NC組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝小葉內(nèi)偶見(jiàn)脂肪變性的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞無(wú)壞死，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯病理性改變；ALD組肝細(xì)胞廣泛空泡變性，其內(nèi)含有大量的脂滴，匯管區(qū)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別大鼠肝小葉內(nèi)存在散見(jiàn)的肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死；MT組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝小葉內(nèi)偶見(jiàn)脂肪變性的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞無(wú)壞死，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。病理學(xué)檢查說(shuō)明急性酒精性肝損傷大鼠模型復(fù)制成功［8］。肝細(xì)胞纖維變性分級(jí)示：NC組F0～F1級(jí)，ALD組F2～F3級(jí)，MT組F1級(jí)［9］；Knodell's HAI評(píng)分示MT組顯著低于ALD組（P＜0.05，表1）。

2.2大鼠血清生物化學(xué)指標(biāo)的比較ALD組血清ALT、AST、GGT水平均顯著高于NC組（P值均＜0.05）；MT組血清ALT、AST、GGT均顯著低于ALD組（P值均＜0.05，表2）。

圖1　各組大鼠肝組織病理學(xué)變化（HE，200×）

表1　各組大鼠肝組織Knodell's HAI評(píng)分（±s）比較

表1　各組大鼠肝組織Knodell's HAI評(píng)分（±s）比較

與正常對(duì)照組比，①P＜0.05；與酒精模型組比，②P＜0.05

只數(shù)炎細(xì)胞浸潤(rùn)點(diǎn)狀壞死HAI評(píng)分對(duì)照組80.0±0.00.0±0.00.0±0.0模型組82.37±0.92①0.38±0.52①2.48±0.72美他多辛81.50±0.53②0.0±0.01.50±0.53②F值30.74.230.77 P值0.000.0290.00

表2　各組大鼠血清生化指標(biāo)水平（U/L，±s）比較

表2　各組大鼠血清生化指標(biāo)水平（U/L，±s）比較

與正常對(duì)照組比，①P＜0.05；與酒精模型組比，②P＜0.05

ALTASTGGT正常組33.37±4.8129.37±6.9336.37±11.49模型組100.13±10.64①185.75±8.84①214.13±13.34①美他多辛75.50±10.27②160.13±9.87②136.63±8.77②F值113.08755.47492.59 P值0.000.010.00

2.3大鼠血清細(xì)胞因子水平比較ALD組血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著高于NC組（P值均＜0.05）；MT組血清TNF-α和IL-1β、IL6和IL-8水平顯著低于ALD組（P值均＜0.05），IL-10水平顯著高于ALD組（P＜0.05，表3）。

2.4肝組織細(xì)胞因子基因水平變化的比較ALD組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平顯著高于NC組（P值均＜0.05）；MT組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平顯著低于，而IL-10 mRNA水平顯著高于ALD組（P＜0.05，表4）。

表3　各組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

表3　各組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

與正常對(duì)照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

IL-10（pg/ml）IL-1β（pg/ml）TNFα（pg/ml）IL-6（ng/ml）IL-8（ng/ml）NF-ΚB（（pg/ml）正常組14.73±2.0392.38±12.852.66±0.8143.57±10.620.29±0.07679.45±36.38模型組16.19±1.941927±233.69①16.92±2.38①127.49±9.33①2.63±0.22①1247.35±146.05①美他多辛36.81±4.53②304.13±34.79②8.83±1.01②81.98±8.02②1.45±0.22②814.84±82.40②F值128.53431.62167.30160.31332.5371.72 P值0.000.000.000.000.000.00

表4　各組大鼠肝組織細(xì)胞因子基因水平（±s）變化的比較

表4　各組大鼠肝組織細(xì)胞因子基因水平（±s）變化的比較

與正常對(duì)照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

IL-10IL-1βTNF-αIL-6IL-8NF-Κb正常組1.00±0.261.00±0.221.00±0.141.00±0.211.00±0.131.00±0.03模型組2.41±0.68①30.72±3.40①10.02±1.45①7.68±1.11①4.97±0.83①1.42±0.27①美他多辛8.48±2.27②6.85±1.76②5.51±1.09②3.17±0.87②2.60±1.04②1.31±0.05 F值167.30431.86128.53136.6753.3515.16 P值0.020.010.0050.010.000.00

3　討論

研究表明，美他多辛可以激活乙醛脫氫酶，提高肝臟三磷酸腺苷濃度，減少乙醇對(duì)色氨酸吡咯酶的抑制，從而起到加速乙醇及其代謝產(chǎn)物代謝速度，減少毒性物質(zhì)在肝臟內(nèi)停留的時(shí)間［9～13］。還有研究顯示美他多辛能預(yù)防肝細(xì)胞的氧化失調(diào)，減少脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的肝臟損害［14］，但其具體作用機(jī)制仍尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用灌胃法建立大鼠急性酒精性肝損傷模型，觀察美他多辛對(duì)肝臟的保護(hù)作用并從炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的角度初步探討了其可能的作用機(jī)制。

酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，其發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，其中包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體損傷、乙醇及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的直接毒理作用、氧化應(yīng)激和免疫誘導(dǎo)損傷等［15］。炎癥反應(yīng)是酒精性肝病發(fā)生的關(guān)鍵因素之一，由內(nèi)毒素、細(xì)胞因子及Kupffer細(xì)胞等多種途徑介導(dǎo)。在酒精性肝病的發(fā)生過(guò)程中，乙醇可以改變腸粘膜的通透性，通過(guò)腸細(xì)菌移位引起腸源性內(nèi)毒素血癥，而內(nèi)毒素對(duì)肝臟的損害主要是通過(guò)激活Kupffer細(xì)胞，誘導(dǎo)如NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化和核轉(zhuǎn)位，促使各種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而釋放大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6等［16］。多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)進(jìn)一步引起放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重肝細(xì)胞的損傷，推進(jìn)酒精性肝病的進(jìn)展。

NF-κB是細(xì)胞中廣泛存在的重要轉(zhuǎn)錄因子，既參與多種炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、免疫反應(yīng)等過(guò)程，又與細(xì)胞凋亡的調(diào)控相關(guān)［17］。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB在胞漿中處于非活性狀態(tài)［18］，當(dāng)細(xì)胞受到如TNF-α、內(nèi)毒素、氧化應(yīng)激及酒精等的外部刺激均可激活NF-κB，啟動(dòng)下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［19］。NF-κB是一種調(diào)控炎癥反應(yīng)的多向因子［20］。本實(shí)驗(yàn)中，ALD組大鼠血清及肝細(xì)胞NF-κB、TNF-α和IL-1β水平均高于正常對(duì)照組，提示急性大量酒精暴露使大鼠體內(nèi)與NF-κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)處于一種活躍狀態(tài)。美他多辛治療組大鼠血清及肝細(xì)胞NF-κB、TNF-α和IL-1β水平均低于模型組，提示該藥使急性大量酒精暴露大鼠體內(nèi)與NF-κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)處于一種抑制狀態(tài)。

近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞因子在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［21］。TNF-α能引起肝細(xì)胞壞死［22，23］。TNF-α既可以導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，也可誘導(dǎo)其凋亡［24］。TNF-α還可以激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激其IL-1和IL-8等的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷或凋亡［25，26］。IL-6作為肝細(xì)胞的刺激因子，可以直接刺激肝細(xì)胞增生并分泌大量的膠原，促進(jìn)肝纖維化的形成［27，28］，提示IL-6與酒精性肝病的發(fā)展密切相關(guān)。IL-8對(duì)中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞具有趨化作用。在酒精性肝病發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞對(duì)TNF-α應(yīng)答而釋放IL-8，進(jìn)一步促使炎癥細(xì)胞聚集至肝臟，引起炎癥。已有研究顯示ALD患者血清IL-8顯著升高。

IL-l0是一種抗炎細(xì)胞因子，對(duì)治療許多肝臟疾病如肝纖維化，有著良好的應(yīng)用前景。研究認(rèn)為IL-10可通過(guò)多個(gè)途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用，主要途徑可能有抑制Kupffer細(xì)胞活化及炎性遞質(zhì)、細(xì)胞因子、氧自由基釋放，抑制NF-KB活性等。研究證實(shí)IL-10促進(jìn)了再灌注損傷大鼠的肝細(xì)胞再生。本實(shí)驗(yàn)中美他多辛組動(dòng)物血清IL-10和肝組織IL-10 mRNA水平均顯著高于酒精性肝損傷模型組。

綜上所述，美他多辛對(duì)急性酒精性肝損傷有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)來(lái)抑制TNF-α和IL-1β水平，升高IL-10水平有關(guān)。

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（收稿：2016-01-13）

（本文編輯：陳從新）

Metadoxine relieving acute alcoholic liver injuries in rats with alcohol-induced liver diseases

Wen Bo，Xu Beibei，Wang Bingyuan.
Department of Geriatics Medicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，Liaoning Province，China Corresponding author:Wang Bingyuan，E-mail:cmu1hfnswby@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of metadoxine（MT）on acute alcoholic liver injury in rats with alcohol-induced liver diseases（ALD）.MethodsTwenty-four Wistar rats were randomly divided into normal control，alcoholic liver disease and metadoxine-intervened group，with 8 rats in each group.All rats were fed with normal chow.In the first two weeks，the rats in control and in ALD groups were administered normal saline，while in MT group were treated with metadoxine at dose of 300 mg·kg-1·d-1.The protocol lasted for 2 weeks.Then，the rats in ALD group and MT group were made acute liver injuries by alcohol gavage with 50%（v/v）ethanol at dose of 5 g·kg-1once every 12 hours，and a total of 3 times，while in rats in NC group were still administered normal saline.Eight hours after the last ethanol administration，the rats were sacrificed，and the blood and liver tissues were collected.The hepatic inflammatory cytokine mRNA was assayed by RT-PCR，and serum NF-κB，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 and IL-10 levels were detected by ELISA.The t-test was used for statistical analysis. ResultsSerum ALT levels in ALD group elevated obviously than in control［（100.13±10.64）U/L vs.（33.37±4.81）U/L，P<0.05］，and serum AST and GGT levels increased also（all P<0.05）；serum IL-10，IL-1β，TNF-α，IL-6，IL8 and NF-KB levels in control group were（14.73±2.03）pg/ml，（92.38±12.85）pg/ml，（2.66±0.81）pg/ml，（43.57±10.62）ng/ml，（0.29±0.07）ng/ml and（679.45±36.38）pg/ml，in ALD group were（16.19±1.94）pg/ml，（1927±233.69）pg/ml，（16.92±2.38）pg/ml，（127.49±9.33）ng/ml，（2.63±0.22）ng/ml and（1247.35±146.05）pg/ml，while in MT group were（36.81±4.53）pg/ml，（304.13±34.79）pg/ml，（8.83±1.01）pg/ml，（81.98±8.02）ng/ml，（1.45±0.22）ng/ml and（814.84±82.40）pg/ml，respectively，suggesting serum TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-8 levels were higher than those in control（all P＜0.05），serum TNF-α，IL-1β，IL6 and IL-8 levels in MT group were lower，and serum IL-10 level in MT group was higher than in ALD group（all P＜0.05）；hepatic TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-8 mRNA levels in ALD group were much higher than in NC group（all P＜0.05），hepatic TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-8 mRNA levels in MT group were much lower，while IL-10 mRNA level much higher than in ALD group（P＜0.05）.ConclusionMetadoxine can protect the alcohol-induced acute liver injuries by down-regulating pro-inflammatory cytokines and alleviating hepatic inflammation.

Alcoholic liver injuries；Metadoxine；Cytokines；NF-κB；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.014

110001沈陽(yáng)市中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年消化科

溫博，女，29歲，碩士研究生

王炳元，E-mail：cmu1hfnswby@126.com