仝艷艷，李光明，鄧怡林，石翠翠，黃福德，范建高

氧化苯砷體外對大鼠原代肝星狀細胞活化的阻抑作用研究*

仝艷艷，李光明，鄧怡林，石翠翠，黃福德，范建高

目的探討氧化苯砷（PAO）對肝星狀細胞（HSC）活化的影響。方法采用密度梯度離心法提取SD大鼠原代HSC，在倒置顯微鏡下觀察HSC形態(tài)的改變；以25、50、100、150和200 nmol/L濃度PAO處理活化的HSC-T6細胞，以四甲基偶氮唑鹽（MTT）法評估PAO的細胞毒性；分別以25、50、100 nmol/L濃度的PAO處理離體培養(yǎng)4 d的HSC 72 h，并設(shè)對照組，采用Western blot和Real-time PCR法檢測各組細胞α-SMA和I型膠原mRNA和蛋白表達。結(jié)果原代HSC離體培養(yǎng)過程中α-SMA表達量逐漸升高，與培養(yǎng)1 d時（0.762±0.062）比，培養(yǎng)4 d時其α-SMA蛋白表達【（1.51±0.045），P＜0.05】顯著升高；PAO在25～100 nmo/L濃度范圍內(nèi)對活化的HSC無明顯的細胞毒性，但能濃度依賴性抑制活化的HSC α-SMA和I型膠原mRNA水平和蛋白表達。結(jié)論離體培養(yǎng)4 d時，HSC呈初始活化狀態(tài)。PAO在25～100 nmol/L范圍可濃度依賴性地阻抑離體培養(yǎng)的HSC的自發(fā)激活，提示PAO有潛力成為一類新型的抗肝纖維化藥物。

肝纖維化；肝星狀細胞；氧化苯砷；體外

1　材料與方法

1.1動物、試劑和設(shè)備SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量400 g左右，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。PAO由中國科學(xué)研究院黃福德教授惠贈，用DMSO配制成10 mmol/L的原液，再用DPBS稀釋成10 μmol/L的母液，用0.22 μm的無菌濾器過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。鏈酶蛋白酶、Ⅳ型膠原酶均購自美國Sigma公司；I型DNA酶購自Roche公司；Nycodenz購自挪威Axis-Shield公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Hydcm公司；D-Hank's緩沖液、Hank's緩沖液均購自上海碧云天生物科技公司；Chemi Doc XRS凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；BCA試劑盒購自海門碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠Tubulin單克隆抗體和小鼠抗大鼠PI4K單克隆抗體購自美國Sigma公司；抗α-SMA單克隆抗體、Goat-anti-Rabbit IgGHRP購自美國Santa Cruz公司；二抗檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；6孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板購自美國Corning Costar公司。

1.2大鼠原代HSC分離及培養(yǎng)取SD大鼠，無菌條件下經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，門脈插管，以D-Hank's灌注沖洗，同時將肝臟游離；取出肝臟，置于無菌培養(yǎng)皿中切碎，去除筋膜，轉(zhuǎn)入含0.5g/LⅣ型膠原酶和0.1g/L蛋白酶E的D-Hank's液中，37℃水浴，振蕩消化。細胞懸液經(jīng)過200目濾網(wǎng)細胞篩選，離心，DMEM沖洗3遍，在180 g/L Nycodenz行梯度離心，取中間云霧狀細胞層［6］，細胞計數(shù)，以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為1×105個/孔，接種于無包被的6孔塑料培養(yǎng)板上，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2、95%潮濕空氣的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。根據(jù)細胞生長情況，每2～3 d換液。用倒置顯微鏡觀察肝星狀細胞的形態(tài)變化，抽提RNA和蛋白質(zhì)。

1.3PAO有效濃度的篩選由于PAO具有較強的細胞毒性，因此需要預(yù)實驗確定合適的藥物濃度，以活化HSC。采用MTT法評估PAO對活化的HSC的毒性濃度閾值。分別以25、50、100、150和200 nmol/L 5種不同濃度的PAO處理貼壁培養(yǎng)的HSC-T6細胞（本室保持），同時設(shè)空白對照組，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，孵育24 h，每孔加入5 mg/ ml的MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄MTT，加入DMSO150 μl，37℃孵育10 min，于波長562 nm 測OD值。綜合評估PAO對HSC-T6細胞存活率的影響，細胞存活率=實驗組OD/對照組OD× 100%。

1.4原代HSC α-SMA和I型膠原mRNA檢測采用Real-time PCR法，提取原代HSC，以5×104個/孔接種于12孔板，每孔1 ml，每組設(shè)3個復(fù)孔；分別以25、50、100 nmol/L PAO處理培養(yǎng)第4 d的原代HSC，并設(shè)置空白對照組，作用72 h后收集細胞，提取細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測其純度和定量。采用10 μl逆轉(zhuǎn)錄體系，包含5× PrimeScript RT Master Mix（for Real Time）Total RNA 2 μl，用RNase Free dH2O補至10 μl，將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液置于ABI Veriti梯度PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件設(shè)置如下：37℃15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)階段），85℃5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)階段），單次循環(huán)，隨后4℃維持。逆轉(zhuǎn)反應(yīng)結(jié)束后將cDNA產(chǎn)物置于-20℃中保存。根據(jù)GeneBank資料設(shè)計引物，用制備的標準品作模板，確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用SYBR Green-1熒光定量PCR擴增，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，PCR反應(yīng)體系為20 μl，包含cDNA 2 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μl，用DEPC水補至20 μl。在ABI 7500 Real-time PCR儀設(shè)置反應(yīng)程序為：預(yù)變性95℃30 s，1個循環(huán)，PCR擴增反應(yīng)95℃5 s，40個循環(huán)，60℃34 s，40個循環(huán)，95℃15 s，1個循環(huán)。各樣品目的基因和內(nèi)參基因分別進行擴增反應(yīng)。各樣品目的基因和內(nèi)參基因的擴增曲線在擴增反應(yīng)結(jié)束后有機器直接生成。GAPDH引物：上游:5'-GAG GAC CAG GTT GTC TCC TG-3'，下游:5'-GGA TGG ATT GTG AGG GAG A-3'；α-SMA引物：上游: 5'-GGT GAA ACT CTG GAG ATC CT-3'，下游:5'-AAT GGC ATC TGT GTC AAC C-3'；I型膠原引物：上游:5'-CAG GCT GGT GTG ATG GGA TT-3'，下游:5'-CCA AGG TCT CCA GGA ACAC C-3'。

1.5原代HSC α-SMA蛋白表達檢測采用Western-blot法，取原代HSC，以5×104個/孔接種于12孔板，每孔1 ml，每組設(shè)3個復(fù)孔；分別以25、50、100 nmol/L PAO處理培養(yǎng)第4 d的原代HSC，并設(shè)置空白對照組，作用72 h后收集細胞，以RIPA裂解液裂解細胞，加入蛋白酶抑制劑PMSF 10 μl/ml，冰上靜置15 min，4℃15000 r/m離心15 min，取上清，轉(zhuǎn)入新的EP管中，用蛋白質(zhì)定量試劑對每個樣品的總蛋白進行定量。加入5×SDS凝膠電泳上樣緩沖液，沸水浴5 min，在蛋白樣品變性后置于-80℃保存。取各組總蛋白60 μg，用SDS-PAGE分離，灌制12%SDS-PAGE分離膠、4%濃縮膠，加樣，80 v電泳至分界處，換成120 v直至溴酚藍跑至膠底部；300 mA、40 min轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含5%脫脂奶粉、0.1%Tween20的TBST封閉液室溫下封閉2 h；將PVDF膜在含有各一抗的稀釋液（1:1000）中4℃孵育過夜。同時使用小鼠抗大鼠Tubulin單克隆抗體（1:1000）孵育作為對照；置于洗膜液（含0.1%Tween20的TBS）中洗膜3次，每次10 min；將膜置于HRP標記的山羊抗兔IgG（H+L）或山羊抗小鼠IgG（H+L）的二抗稀釋液（1:1000）中，在搖床上震蕩孵育2 h；洗膜液洗膜3次，每次15 min。暗室中將膜加上ECL發(fā)光劑，鋪上保鮮膜，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用Turkey's檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HSC活化的形態(tài)學(xué)鑒定在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，新分離未貼壁的HSC呈圓形，胞漿折光性很強，體積明顯小于肝細胞。培養(yǎng)1 d后，多數(shù)細胞已貼壁，呈扁圓形或橢圓形。培養(yǎng)3 d后，部分細胞出現(xiàn)多角偽足。培養(yǎng)4 d時，細胞開始呈現(xiàn)典型的星狀外形，胞漿內(nèi)顆粒減少，細胞逐漸融合，體積增大。培養(yǎng)7 d時，細胞由局灶性生長變?yōu)閱螌映善L，胞質(zhì)中脂滴不明顯，或消失，細胞明顯增大，呈現(xiàn)典型的成纖維細胞樣形態(tài)（圖1）。研究結(jié)果表明離體培養(yǎng)4 d的原代HSC呈初始活化狀態(tài)；培養(yǎng)7 d時呈完全活化狀態(tài)，說明形態(tài)學(xué)觀察可作為評估HSC活化狀態(tài)的一個有效方法。

圖1　體外培養(yǎng)的原代HSC形態(tài)變化

2.2PAO有效工作濃度的確定在25～200 nmol/L范圍內(nèi)，隨著PAO濃度的增高，HSC存活率逐漸下降；當(dāng)PAO濃度增高至150 nmol/L時，HSC細胞存活率為對照組的82%（P＜0.05）；當(dāng)PAO濃度增加至200 nmol/L時，細胞存活率降低為對照組的72%以下（P＜0.01，圖2），表明在25～100 nmol/L濃度范圍內(nèi)，PAO對HSC的毒性小，細胞存活率在90%以上，即確定為有效工作濃度。

圖2　PAO對HSC-T6增殖的影響與對照組細胞（C，0 nmol/L）相比，在PAO為150 nmol/L和200 nmol/L時，細胞存活率顯著降低aP＜0.05；bP＜0.01

2.3PAO對HSC α-SMA表達的影響經(jīng)Realtime PCR檢測，發(fā)現(xiàn)與對照比，PAO作用72 h后，各處理組HSC α-SMA mRNA水平呈濃度依賴性顯著下降（P＜0.01，圖3），提示PAO對初始活化的HSC可能具有逆轉(zhuǎn)作用。經(jīng)Western blot檢測，隨著培養(yǎng)時間的延長，HSC表達α-SMA逐漸增強，離體培養(yǎng)4 d時其相對表達量為（1.51±0.045），較對照（0.762±0.062）明顯增高（P＜0.05）；在離體培養(yǎng)7 d時，其α-SMA表達量為（1.752±0.053），證實原代HSC經(jīng)離體培養(yǎng)4 d時已呈初始活化狀態(tài)，并隨時間延長而進一步活化（圖4A）。PAO可以劑量依賴性下調(diào)α-SMA蛋白表達，在50 nmol/L和100 nmol/L濃度時，α-SMA表達量分別為（0.63±0.078）和（0.41±0.09），顯著低于對照組（1.53±0.039），P＜0.05（圖4B），而在25nmol/L PAO處理組，HSC α-SMA蛋白表達（1.25±0.07）與對照相比無顯著性差異（P＜0.05），表明PAO可使活化的HSC發(fā)生逆轉(zhuǎn)分化。

圖3　PAO對離體培養(yǎng)4 d的HSC α-SMA mRNA水平的影響各濃度PAO處理組HSC α-SMA mRNA水平呈濃度依賴性顯著下降*P＜0.05；**P＜0.01

圖4　A離體培養(yǎng)的HSC α-SMA蛋白表達的變化隨著培養(yǎng)時間的延長，HSC表達α-SMA逐漸增強

圖4　BPAO對離體培養(yǎng)4 d的原代HSC α-SMA蛋白表達的影響PAO可以劑量依賴性下調(diào)α-SMA蛋白表達0：Control；A：25 nmol/L；B：50 nmol/L；C：100 nmol/L

2.4PAO可顯著下調(diào)活化的HSC I型膠原mRNA水平與對照比，各濃度PAO對HSC I型膠原mRNA水平均有顯著的下調(diào)作用，且呈濃度依賴性增強（P＜0.01，圖5），結(jié)果表明PAO對初始活化的HSC具有逆轉(zhuǎn)活化作用。

圖5　PAO對離體培養(yǎng)4 d的HSC I型膠原mRNA水平的影響與對照比，各濃度PAO對HSC I型膠原mRNA水平均有顯著的下調(diào)作用，且呈濃度依賴性增強與對照組比，*P＜0.05；**P＜0.01

3　討論

活化的HSC清除障礙是肝纖維化持續(xù)進展的主要原因。因此，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡或逆轉(zhuǎn)為靜止的HSC是防治肝纖維化的有效策略［7，8］。業(yè)已證實，砷制劑具有誘導(dǎo)白血病細胞逆轉(zhuǎn)分化和凋亡的雙重作用，并已應(yīng)用于臨床治療急性早幼粒細胞性白血?。ˋcute promyelocytic leukemia，APL）［9，10］。PAO是磷脂酰肌醇-4激酶抑制劑，可調(diào)控磷脂酸肌醇信號（PI3K/Akt）通路，從而調(diào)控細胞分化（表型轉(zhuǎn)化）、增殖或凋亡［11，12］。PI3K/Akt信號通路與HSC分化（激活）及增殖調(diào)控密切相關(guān)，提示PAO可能對HSC活化具有調(diào)控作用［13～16］。

接種于塑料器皿中的原代HSC可自發(fā)培養(yǎng)激活，是體外研究HSC生物學(xué)特性的經(jīng)典細胞模型［17，18］。我們的研究發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)4 d時HSC處于初始活化狀態(tài)，7 d時為完全活化狀態(tài)。為了動態(tài)評估PAO對HSC激活過程的影響，我們測試了25～200 nmol/L濃度PAO對活化的HSC的細胞毒作用。研究發(fā)現(xiàn)，在150 nmol/L以下時，PAO對活化的HSC無細胞毒性。因此，確定25～100 nmol/L范圍為PAO的有效工作濃度。由于PAO具有細胞毒性，因此我們選擇離體培養(yǎng)4 d的初始活化的HSC作為干預(yù)細胞。研究發(fā)現(xiàn)，在25～100 nmol/L濃度范圍內(nèi)PAO可濃度依賴性使活化的HSC逆轉(zhuǎn)分化，表現(xiàn)為活化的HSC的特征性標志，即α-SMA mRNA及蛋白表達顯著下調(diào)，活化的HSC合成I型膠原等細胞外基質(zhì)的能力下降。

PAO誘導(dǎo)腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)分化或凋亡已有較多的研究報道。除血液系統(tǒng)腫瘤外，砷制劑治療實體腫瘤的臨床試驗也在積累中［19］。我們的合作者黃福德教授課題組最近發(fā)現(xiàn)PAO亦有防治帕金森病的潛力，但迄今尚無PAO在肝纖維化防治相關(guān)領(lǐng)域的研究報道。我們的研究首次證實PAO對活化的HSC具有逆轉(zhuǎn)分化作用，并篩選到PAO治療作用的有效濃度范圍，提示PAO有潛力成為一類新型抗肝纖維化藥物。

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（收稿：2015-12-09）

（本文編輯：陳從新）

Objective To investigate the inhibition of primary cultured hepatic stellate cell（HSC）activation by phenylarsine oxide（PAO）in vitro.Methods Primary cultured HSCs were isolated from rat 1iver by Nycodenz density-gradient centrifugation.The morphological features of the cells were observed under inverted microscope.The cytotoxicity of PAO on HSCs-T6 was determined by MTT after treated with 5 different PAO concentrations（25，50，100，150 and 200 nmol/L）for 24 h.We chose proper concentration of PAO（＜100 nmol/L）in this experiment，and t hen we divided primary cultured HSCs at day 4 into four groups receiving PAO at concentration of 0，25，50 and 100 nmol/L respectively.The expressions of α-SMA and type I collagen were measured by Western blot and Real-time PCR respectively.Results Expression of α-SMA was up-regulated as HSCs activation at primary culture（the expression of α-SMA increased significantly at day 4（1.51±0.045）as compared with at day 1［（0.762±0.062），P＜0.05】；PAO at 25 to 100 nmol/L concentration range had no obvious cytotoxicity to activated HSCs，and down-regulated and inhibited α-SMA mRNA and collagen type I mRNA levels and their protein expression of HSCs in a concentration-dependent manner.Conclusion The HSCs is initially activated at day four in vitro culture，and PAO at 25 to 100 nmol/L range can inhibit the spontaneous activation of HSCs in vitro.

Hepatic fibrosis；Hepatic stellate cells；Phenylarsine oxide；In vitro肝纖維化是各種慢性肝病進展至肝硬化的必經(jīng)階段［1，2］，肝纖維化的發(fā)生與活化的肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）密切相關(guān)［3］。因此，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡或逆轉(zhuǎn)為靜止期HSC將是防治肝纖維化的重要工作［4，5］。有研究發(fā)現(xiàn)氧化苯砷（Ph enylarsine oxide，PAO）可抑制多能干細胞向肌成纖維細胞分化，提示PAO可能具有抗肝纖維化潛能。本研究主要探討了PAO對HSC活化的逆轉(zhuǎn)作用。

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.04.008

國家自然科學(xué)基金資助項目（81070344/81400631）；中國肝炎基金會王寶恩肝纖維化研究基金資助項目（200090007）

200092上海市交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科（仝艷艷，李光明，石翠翠，鄧怡林，范建高）；上?？茖W(xué)院高等研究院神經(jīng)生物學(xué)研究組（黃福德）

仝艷艷，女，24，碩士研究生。主要從事肝損傷與肝纖維化的防治研究。E-mail：tyanyan1991@163.com

李光明，E-mail：ligm68@126.com

Inhibitionof primary culturedhepaticstellate cell activationby phenylarsineoxideinvitro Tong Yanyan，Li Guangming，Deng Yilin，et al.Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital Affiliated to JiaoTong University School of Medicine，Shanghai 200092