周鴻，顧磊，蔣春暉，孫隆慈，劉曄，許春杰，徐慶

1，25（OH）2D3通過(guò)STAT5抑制Th17細(xì)胞分化的調(diào)控作用研究*

周鴻，顧磊，蔣春暉，孫隆慈，劉曄，許春杰，徐慶

目的研究1.25二羥基維生素D3［1，25（OH）2D3］抑制輔助性T細(xì)胞17（Th17）的分化與STAT5調(diào)控的關(guān)系。方法通過(guò)分選出的CD4+T細(xì)胞，在1，25（OH）2D3和/或STAT5抑制劑的作用下，采用ELISA法檢測(cè)抑制劑處理后細(xì)胞培養(yǎng)上清液Th17細(xì)胞因子（IL-17A、IL-22）水平的變化；采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)STAT5的磷酸化水平，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)STAT5蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1，25（OH）2D3組細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17A和IL-22水平（12.5±0.5 ng/ml，48.5±0.9 pg/ml）明顯低于對(duì)照組（22.7±0.5 ng/ml，73.8±1.9 pg/ml），而STAT5抑制劑組IL-17A 和IL-22水平明顯升高（33.5±0.7 ng/ml，89.1±1.4 pg/ml），1，25（OH）2D3與STAT5抑制劑聯(lián)合作用細(xì)胞IL-17A和IL-22水平（18.5±0.7 ng/ml，54.1±1.6 pg/ml）顯著高于1，25（OH）2D3組，但低于STAT5抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；1，25（OH）2D3組細(xì)胞p-STAT5表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組，1，25（OH）2D3聯(lián)合STAT5抑制劑組p-STAT5表達(dá)量低于對(duì)照組，而STAT5抑制劑組細(xì)胞p-STAT5表達(dá)量最低；1，25（OH）2D3組STAT5蛋白表達(dá)明顯升高，而1，25（OH）2D3聯(lián)合STAT5抑制劑組或STAT5抑制劑組STAT5蛋白表達(dá)明顯降低，以STAT5抑制劑組細(xì)胞表達(dá)最弱，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論1，25（OH）2D3通過(guò)STAT5信號(hào)通路能抑制Th17細(xì)胞分化。

輔助性T細(xì)胞17；1，25-二羥基維生素D3，STAT5；細(xì)胞分化；小鼠

JNK/STAT通路是主要的細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的信號(hào)通路［1～4］。STAT5是IL-2重要的下游通路轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)T細(xì)胞分化和增殖［5，6］。IL-2基因敲除或是應(yīng)用抗IL-2抗體阻斷都會(huì)促進(jìn)體內(nèi)Th17細(xì)胞的分化。敲除STAT5也會(huì)促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，可能是由于敲除STAT5導(dǎo)致IL-2的抑制效應(yīng)消失，進(jìn)而STAT3促進(jìn)RORγt表達(dá)和Th17細(xì)胞分化［7，8］。STAT5的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)有可能與STAT3競(jìng)爭(zhēng)同一個(gè)編碼IL-17的基因座IL-17A有關(guān)［9］。Pandiyan et al［10］發(fā)現(xiàn)，IL-15通過(guò)促進(jìn)STAT5表達(dá)來(lái)抑制IL-15的產(chǎn)生和抑制Th17細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）-生長(zhǎng)激素受體軸（Growth hormone receptor axis，GHR）是引起STAT5活化的最主要的路徑。GHR主要位于肝細(xì)胞，當(dāng)GH分泌不足和GHR表達(dá)下降時(shí)，STAT5的活性亦隨之降低［11～13］。本研究主要是在脾淋巴細(xì)胞Th17誘導(dǎo)分化過(guò)程中加入1.25二羥基維生素D3［1，25（OH）2D3］或/ 和STAT5抑制劑，來(lái)探究1，25（OH）2D3是否可以通過(guò)促進(jìn)STAT5的表達(dá)來(lái)抑制Th17細(xì)胞的分化。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑8 w齡健康C57小鼠30只，購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段。1，25（OH）2D3購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；刺激劑混合物（PMA/Ionomycin/Brefeldin A/Monensin）和Percoll分離液（以色列ProSpec公司）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；10%FBS（美國(guó)Gibco公司）；固定破膜劑、0.01%Triton-X、抗原修復(fù)液（BIOSH公司）；抗p-STAT5、抗STAT5、抗CD4、抗IFN-γ、抗IL-17A、抗IL-4和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（HRP標(biāo)記）、異硫氰酸熒光素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（FITC標(biāo)記）均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；檢測(cè)IL-22和IL-17A的ELISA試劑盒（BIOSH公司）；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液和STAT5抑制劑（上海碧云天生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；CD4+T細(xì)胞分選試劑盒（美國(guó)Selleck公司）。

1.2誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化無(wú)菌條件下，取小鼠脾臟組織，研磨，通過(guò)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞；加PBS 8 ml，重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液與40% Percoll分離液混合，緩慢加到70%Percoll分離液上，離心；吸取兩層溶液之間的白細(xì)胞，獲得淋巴細(xì)胞；采用磁珠分選初始CD4+T細(xì)胞（按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作）；用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞，分別加入抗人CD3/CD28單抗（2 mg/ml）、抗人IL-2（1.28 mg/ml）、抗IFN-γ單抗（1mg/ml）和重組人細(xì)胞因子（TGF-β、IL-6、IL-1β）；將細(xì)胞分為4組：第1組加1，25（OH）2D3（10-8 mol/L）、第2組加STAT5抑制劑、第3組加1，25（OH）2D3（10-8 mol/L）和STAT5抑制劑、第4組為對(duì)照組，加等量的PBS液；5 d后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清、備用。

1.3細(xì)胞上清細(xì)胞因子水平檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)IL-22和IL-17A水平。

1.4細(xì)胞表面STAT5免疫熒光檢測(cè)收集各組的細(xì)胞，分別涂片后，經(jīng)4%多聚甲醛固定、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、3%H2O2/PBS洗滌、浸入抗原修復(fù)液（檸檬酸三鈉緩沖液）等過(guò)程。10%FBS封閉，室溫15 min；加入抗p-STAT5，4℃孵育過(guò)夜；加入FITC標(biāo)記的二抗，每片1滴。37℃孵育30 min；封片，在熒光顯微鏡下觀察。STAT5活化后被磷酸化成為p-STAT5，通過(guò)p-STAT5的表達(dá)量來(lái)衡量STAT5活性。

1.5細(xì)胞STAT5蛋白檢測(cè)采用Western Blot法，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量；上樣前，水浴煮沸15 min；上樣20 μl；進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；稀釋抗STAT5，加入一抗后與硝酸纖維素膜4℃孵育過(guò)夜；次日，按照1:1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，加入二抗后37℃孵育2 h；DAB顯色，用紅外掃描儀掃描，分析蛋白條帶灰度值。

2　結(jié)果

2.1Th17細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)情況經(jīng)1，25（OH）2D3處理細(xì)胞后，上清IL-17A和IL-22水平（12.5±0.5 ng/ml和48.5±0.9 pg/ml）均比對(duì)照組明顯降低【（22.7±0.5 ng/ml和73.8±1.9 pg/ml，P＜0.01），而STAT5抑制劑組（33.5±0.7 ng/ml和89.1± 1.4 pg/ml）均明顯升高（P＜0.01）；當(dāng)1，25（OH）2D3與STAT3抑制劑聯(lián)合作用時(shí)，IL-22和IL-17A水平（18.5±0.7 ng/ml和54.1±1.6 pg/ml）均明顯高于1，25（OH）2D3組，而明顯低于STAT3抑制劑組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。以上結(jié)果表明，1，25 （OH）2D3降低細(xì)胞IL-17A和IL-22表達(dá)，相反，STAT5抑制劑則促進(jìn)IL-17A和IL-22的表達(dá)，對(duì)Th17細(xì)胞分化具有各自的調(diào)節(jié)作用。

圖1　各組培養(yǎng)細(xì)胞上清細(xì)胞因子水平比較

2.2各組細(xì)胞p-STAT5表達(dá)情況STAT5活化后被磷酸化成為p-STAT5，通過(guò)檢測(cè)p-STAT5表達(dá)量可以衡量STAT5的活性。與對(duì)照組比，1，25（OH）2D3處理細(xì)胞p-STAT5表達(dá)量最高，而STAT5抑制劑組p-STAT5表達(dá)量明顯減少，聯(lián)合作用組p-STAT5表達(dá)量高于抑制劑組，但明顯弱于1，25（OH）2D3組，表明1，25（OH）2D3具有增強(qiáng)STAT5表達(dá)活性的作用（圖2）。

圖2　脾淋巴細(xì)胞p-STAT5表達(dá)情況（藍(lán)色為Hochest染核，綠色為p-STAT5表達(dá)部位）

2.3各組細(xì)胞STAT5蛋白表達(dá)情況與對(duì)照組比，1，25（OH）2D3組STAT5蛋白表達(dá)最高，STAT5抑制劑組STAT5蛋白表達(dá)最低，而聯(lián)合作用組STAT5表達(dá)低于單獨(dú)1，25（OH）2D3組，但高于STAT5抑制劑組，并且具有顯著性差異（P＜0.01，圖3），表明在誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化過(guò)程中，1，25（OH）2D3具有促進(jìn)STAT5表達(dá)的作用。

圖3　各組細(xì)胞STAT5蛋白表達(dá)情況

3　討論

輔助性T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。根據(jù)其產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同，輔助性CD4+T細(xì)胞可分為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）、輔助性T細(xì)胞17（T helper cells 17，Th17）、Th1和Th2等細(xì)胞亞群，他們之間相互調(diào)節(jié)，在分化發(fā)育上相互制約，在功能上存在著拮抗或協(xié)同的復(fù)雜關(guān)系，影響免疫應(yīng)答的格局。Treg是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，在維持免疫穩(wěn)態(tài)和阻止自身免疫病的發(fā)生上發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，這些細(xì)胞的缺失或者調(diào)節(jié)功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致免疫功能紊亂及自身免疫病的發(fā)生。這些細(xì)胞有效的應(yīng)用將有可能治療自身免疫病以及阻止器官移植中的移植物排斥反應(yīng)。而在維持免疫耐受的同時(shí)保證有效防御反應(yīng)的關(guān)鍵就是Treg和Th17細(xì)胞之間的平衡［14］。IL-2是體內(nèi)重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，不僅能促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，也能通過(guò)SATA5介導(dǎo)的信號(hào)途徑抑制Th17細(xì)胞的分化［15］。SATA5是IL-2信號(hào)途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)IL-2對(duì)Treg的誘導(dǎo)功能以及對(duì)Th-17細(xì)胞的抑制作用。SATA5被激活后聚集并結(jié)合IL-17基因啟動(dòng)子，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制SATA3等IL-17活化因子結(jié)合IL-17基因，或者通過(guò)募集抑制復(fù)合物干預(yù)IL-17表達(dá)環(huán)路，抑制IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制IL-17的分化以及IL-17的表達(dá)［16］。SATA5同時(shí)也是FOXP3表達(dá)必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與FOXP3基因直接結(jié)合，增加FOXP3基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)FOXP3的表達(dá)，從而增強(qiáng)Treg的調(diào)節(jié)功能。IL-2基因敲除小鼠或SATA5缺陷小鼠體內(nèi)Treg產(chǎn)生都減少，而Th17細(xì)胞產(chǎn)生增加，表明IL-2可通過(guò)SATA5途徑影響FOXP3與RORγt的平衡，降低RORγt的表達(dá)，抑制Th17細(xì)胞分化，增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的FOXP3表達(dá)和Treg的功能［17］。

目前，STAT5對(duì)Th17細(xì)胞的調(diào)控研究較少。Yang et al［18］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)活性STAT5不影響Th17細(xì)胞的分化，但Laurence et al［19］發(fā)現(xiàn)STAT5參與介導(dǎo)IL-2對(duì)Th17分化的抑制效應(yīng)。有很多研究顯示抑癌基因p53在抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展方面具有重要作用。Park發(fā)現(xiàn)p53-/-小鼠T細(xì)胞STAT5的活性降低，STAT5磷酸化程度降低。p53蛋白和STAT5直接結(jié)合，隨著p53的活性增強(qiáng)，STAT5的活性也增強(qiáng)。在炎癥條件下，p53可以通過(guò)STAT5信號(hào)級(jí)聯(lián)放大抑制Th17細(xì)胞分化并促進(jìn)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抑制炎癥。p53通過(guò)對(duì)STAT5的促進(jìn)，進(jìn)而在炎癥和自身免疫性疾病中充當(dāng)一個(gè)保護(hù)者的角色［20］。

STAT5和1，25（OH）2D3都在抑制Th17細(xì)胞活化的同時(shí)，它們相互之間是否存在某種聯(lián)系或相互作用卻未可知。本研究通過(guò)在Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中加入STAT5抑制劑或/和1，25（OH）2D3，研究和探索1，25（OH）2D3是否可以以類似抑制STAT3的作用方式來(lái)促進(jìn)STAT5的表達(dá)，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞分化。結(jié)果顯示，1，25（OH）2D3可以促進(jìn)STAT5的表達(dá)及其磷酸化作用，STAT5抑制劑的加入能促進(jìn)Th17細(xì)胞特異細(xì)胞因子IL-17A和IL-22的表達(dá)和分泌，表明STAT5在某種程度上可以抑制Th17細(xì)胞的分化，初步表明1，25（OH）2D3可以通過(guò)上調(diào)STAT5的表達(dá)及促進(jìn)STAT5的活化來(lái)抑制Th17細(xì)胞的分化。

［1］Jason S，Raw lings，Kristin M.The JAK/STAT signaling pathway.Cell Sci，2004，117（Pt8）：1281-1283.

［2］Schindler C，Levy DE，Decker T.JAK-STAT signaling：from interferons to cytokines.J Biol Chem，2007，282（28）：20059-20063.

［3］Lee CK，Smith E，Gimeno R，et al.STAT1 affects lymphocyte survivalandproliferationpartiallyindependentofitsrole downstream of IFN-γ.J Immunol，2000，164（3）：1286-1292.

［4］Kaplan MH，Sun YL，Hoey T，et al.Impaired IL-12 responses and enhanced development of Th2 cells in Stat4-deficient mice. Nature，1996，382（6587）：174-177.

［5］Ho IC，Glimcher LH.Transcrition：Tantalizing times for T cells. Cell，2002，109（suppl l）：S109-S120.

［6］張?jiān)娳S，徐亞明，宋一超，等.Stat5：多功能的轉(zhuǎn)錄因子.生命化學(xué)，2012，32（2）：180-184.

［7］McGeachy MJ，Chen Y，Tato CM，et al.The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo.Nat Immunol，2009，10（3）：314-324.

［8］Zhou L，Ivanov II，Spolski R，et al.IL-6 programs T（H）-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways，Nat Immunol，2007，8（9）：967-974.

［9］Yang XP，Ghoreschi K，Steward-Tharp SM，et al.Opposing regulation of the locus encoding IL-17 through direct，reciprocal actions of STAT3 and STAT5.Nat Immunol，2011，12（3）：247-254.

［10］Pandiyan P，Yang XP，Saravanamuthu SS，et al.The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes.J Immunol，2012，189（9）：4237-4246.

［11］Chilton BS，Hewetson A.Prolactin and growth hormone signaling.Curr Top Dev Biol，2005，68（1）：1-23.

［12］WatersMJ，Hoang HN，F(xiàn)airlieDP，etal.New insightsinto growth hormone action.J Mol Endocrinol，2006，36（1）：1-7.

［13］Lang CH，Hong-BrownL，F(xiàn)rostRA.Cytokineinhibitionof JAK-STAT signaling：a new mechanism of growth hormone resistance.Pediatr Nephrol，2005，20（3）：306-312.

［14］武華棟，王新華，周榮斌.不調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞之間平衡作用的機(jī)制.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2011，11（9）：1164-1166.

［15］LiMO，WanYY，F(xiàn)lavellRA.T cell-producedtransforming growth factor beta1 controls T cell tolerance and regulates Th1 and Th17-cell differentiation.Immunity，2007，26：579-591.

［16］王晨宇，王星，王琳，等.Th17細(xì)胞分化調(diào)節(jié)機(jī)制及與自身免疫性疾病關(guān)系研究進(jìn)展.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30（6）：660-662.

［17］Eberl G，Marmon S，Sunshine MJ，et al.An essential function for the nuclear receptor RORγt in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.Nat Immunol，2004，5：64-73.

［18］Yang XO，Panopoulos AD，Nurieva R，et al.STAT3 regulates cytokine-mediated generation of inflammatory helper T cells.J Biol Chem，2007，282（13）：9358-9363.

［19］Laurence A，Tato CM，Davidson TS，et al.Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation.Immunity，2007，26（3）：371-381.

［20］ParkJS，Lim MA，Cho ML，et al.p53controlsautoimmune arthritis via STAT-mediated regulation of the Th17 cell/Treg cell balance in mice.Arthritis Rheum，2013，65（4）：949-959.

（收稿：2016-01-10）

（本文編輯：陳從新）

Objective Toexploretheroleof1，25-（OH）2D3ininhibitingThelpercell17（Th17）differentiation and the role of STAT5 in this process.Methods Sorted CD4+T cells were treated with 1，25-（OH）2D3and/or STAT5 inhibitors.The Th17 cytokines（IL-17A，IL-22）levels in supernatants weredetected by ELISA；the phosphorylation level of STAT5 was examined by cell immunofluorescence，and Western blot was used to detect STAT5 protein expression.Results The levels of IL-17A and IL-22 in 1，25-（OH）2D3-treated group were significantly lower than those in the control group［（12.5±0.5）ng/ml and（22.7±0.5）pg/ml vs.（48.5±0.9）ng/ml and（73.8±1.9）pg/ml，respectively，P＜0.01］，while in STAT5 inhibitor-treated group had higher levels of IL-17A［（33.5±0.7）ng/ml］ and IL-22［（89.1±1.4）pg/ml，P＜0.05］；IL-17A［（18.5±0.7）ng/ml］ and IL-22［（54.1±1.6）pg/ml］ levels in cells treated with 1，25（OH）2D3combined with STAT5 inhibitor were significantly higher than those in 1，25-（OH）2D3-treated alone，whereas lower than those inSTAT5 inhibitor-treated cells（P＜0.01 for both）；the expression of p-STAT5 was higher in 1，25-（OH）2D3-treated cells and lower in 1，25-（OH）2D3combined with STAT5 inhibitor-treated cells，while in STAT5 inhibitor-treated cells had the lowest p-STAT5；the STAT5 protein expression was significantly higher in 1，25-（OH）2D3-treated cells，whereas lower in 1，25-（OH）2D3combined with STAT5 inhibitor-treated cells or in STAT5 inhibitor-treated cells had the lowest STAT5 protein expression（P＜0.01 for all）.Conclusion 1，25-（OH）2D3might inhibit Th17 cell differentiation via STAT5 signaling pathway.

T helper cell 17；1，25-（OH）2D3；STAT5；Cell differentiation；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.04.006

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題（編號(hào)：20154Y0207）

200127上海市交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科

周鴻，男，41歲，博士研究生，主治醫(yī)師。主要從事消化內(nèi)鏡診斷與治療學(xué)研究。E-mail：renjizhouhong@163.com通訊作者：徐慶，E-mail：renjixuqing@163.com

1，25-（OH）2D3inhibits Th17 cell differentiation via STAT5 signaling Zhou Hong，Gu Lei，Jiang Chunhui，et al.DepartmentofGastrointestinalSurgery，RenjiHospital，SchoolofMedicine，JiaoTongUniversity，Shanghai 200127，China