陳明亮，章祿標，胡蘭香，吳小燕，陳紅萍，肖葉青*

(1.江西省農業(yè)科學院 水稻研究所/水稻國家工程實驗室(南昌)，江西 南昌 330200；2.江西省上饒市食品藥品監(jiān)督管理局，江西 上饒 334000)

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東鄉(xiāng)野生稻耐冷片斷導入系基因表達譜的比較分析

陳明亮1，章祿標2，胡蘭香1，吳小燕1，陳紅萍1，肖葉青1*

(1.江西省農業(yè)科學院 水稻研究所/水稻國家工程實驗室(南昌)，江西 南昌 330200；2.江西省上饒市食品藥品監(jiān)督管理局，江西 上饒 334000)

通過對東鄉(xiāng)野生稻的滲入系群體進行低溫篩選，獲得了5個耐冷性較強的株系。通過對耐冷株系IL732和輪回親本贛香B常溫和低溫下基因表達譜(DEG)差異的分析，篩選得到22個在IL732中特異響應冷脅迫的基因，其中存在多個參與糖類代謝的酶。這些酶基因的特異表達表明東野的耐冷機制可能與東野獨特的能量代謝或多糖類物質代謝調控過程有關。

東鄉(xiāng)野生稻；片段導入系；冷脅迫；表達譜分析

東鄉(xiāng)野生稻(以下簡稱“東野”)是迄今為止發(fā)現(xiàn)分布緯度最北(28°14′ N)的普通野生稻，蘊藏著豐富的抗病蟲害及抗各種不良環(huán)境種質資源，尤其具備其他普通野生稻和栽培稻所不具備的強耐冷性[1]。據(jù)報道東野地下莖能耐受-12.8 ℃低溫，稻蔸可在武漢安全越冬，第二年再生苗植株與種子實生植株相比并無差異[2]。東野的強耐冷性為培育耐冷品種提供了優(yōu)良的種質基礎。研究人員從東野后代群體中篩選到多個綜合農藝性狀較好的強耐冷植株，具有廣闊的育種利用前景[3-4]。東野與粳稻0298的雜交后代通過加壓選擇，培育成功稻蔸能夠越冬的耐冷粳稻東野1號，2003年通過江西省農作物品種審定委員會審定[5]。

多年來的遺傳研究表明：東野的耐冷性狀是個由多基因控制的數(shù)量性狀。目前在東野中通過不同方法確定了3個耐冷基因。Wang等從東野中擴增獲得低溫響應調控因子ICE1同源基因OrbHLH1，過表達OrbHLH1則擬南芥耐冷性增強[6]。Liu等通過芯片分析表達譜差異，結合QTL定位區(qū)段找到候選基因LTT7，過表達植株表現(xiàn)出極強的耐冷性[7]?；蛐头治霰砻鳀|野中還攜帶有耐冷型的Cold1基因。該基因起源于中國普通野生稻，在水稻人工馴化過程中得到選擇，普遍存在于東北亞的粳稻品種中[8]。利用東野與多個不同冷敏感材料構建群體進行耐冷QTL定位，已經(jīng)定位到了多個相關QTL，分布在水稻12條染色體上[9-11]。但到目前為止，QTL定位克隆尚沒有找到確定的東野耐冷基因。

本研究前期已構建成以保持系贛香B為輪回親本，東野為供體親本的滲入系群體BC2F8共180個株系，通過大田低溫篩選獲得多個耐冷株系[3]。本試驗對輪回親本贛香B和其中耐冷性較好株系IL742常溫和低溫下進行表達譜差異測序，分析比較它們之間的表達差異，找到東野中與冷脅迫相關的基因，了解東野耐冷的分子調控機理。

1　材料與方法

將以贛香B為輪回親本，東野為供體親本構建的重組自交群體中各株系種子置于30 ℃恒溫的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至近2葉1心期時，放在常溫下3 d進行煉苗，(0±1)℃低溫下處理3 d，隨后將試驗材料置于常溫條件下使其恢復生長。5 d后統(tǒng)計各株系的存活苗數(shù)。以幼苗存活率(%)=存活苗數(shù)/處理前秧苗數(shù)×100%作為苗期耐冷性的評價指標，篩選耐冷株系。每個樣品3次重復。

將贛香B和耐冷株系IL732置于30 ℃恒溫的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3葉1心期時，放在常溫下進行煉苗3 d，低溫處理在10 ℃低溫下處理7 d，對照處理仍放在常溫下。冷處理完畢后，同時冷處理和常溫處理材料各取葉片1 g，液氮速凍。4個處理分別為贛香B常溫(CKNP)、IL732常溫(STNP)、贛香B低溫(CKLP)和IL732低溫(STLP)。葉片材料交給諾禾致源公司進行表達譜(t-DEG)差異測序。基于illumina HiSeq 2500技術測序平臺，構建常規(guī)轉錄組文庫進行SE50單端測序，獲得樣品的表達譜測序數(shù)據(jù)，每個樣品個體的測序數(shù)據(jù)量不少于10 M的clean reads序列。每個樣品進行3個重復，參照基因組使用秈稻表達數(shù)據(jù)庫ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-23/plants/gtf/oryza_indica/?；虮磉_量用RPKM值表示，RPKM(Reads Per Kilo bases per Million mapped Reads)是每百萬reads中來自某一基因每千堿基長度的reads數(shù)目。采用DESeq[12]進行表達差異分析，尋找表達差異基因，并對表達差異基因進行基因功能GO注釋。

2　結果與分析

從前期大田初篩獲得的株系中，篩選獲得耐冷性較好株系5個，幼苗的存活率在23.9%～48.2%之間，而對照輪回親本贛香B僅為12.3%(表1)。其中株系IL732耐冷性最強，幼苗存活率為48.2%。

表1　耐冷株系數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

將贛香B和耐冷株系IL732進行常溫和低溫下的表達譜DEG差異分析。相關性分析顯示不同溫度處理的表達譜相關系數(shù)高于不同株系之間的相關系數(shù)(圖1)。贛香B和IL732的表達譜在相同溫度處理時相關性系數(shù)在0.96之上，而同一材料在不同溫度相關性系數(shù)都在0.85以下。這表明贛香B和IL732的表達模式基本一致，對于低溫的響應差異不大，較適合尋找到冷脅迫響應的關鍵基因。

表達譜差異分析結果顯示，STNP和CKNP相比有192個基因的表達量發(fā)生變化，其中91個上調，101個下調，主要編碼催化酶類、金屬離子結合蛋白和核酸結合蛋白；STLP和CKLP相比有226個基因的表達發(fā)生變化，其中116個上調，110個下調，主要編碼金屬離子結合蛋白、水解酶類和核酸結合蛋白。IL732株系在常溫和低溫下的表達量，與贛香B均有顯著差異的基因有111個(圖2)。從中挑選IL732中組成型表達高于贛香B(STNP>CKNP，STLP>CKLP)，且在IL732中低溫表達量不顯著低于常溫表達量(STLP≮STNP)的基因，最后篩選獲得22個基因(表2)。能夠注釋到的基因主要是代謝酶類和核酸結合蛋白，其中存在多個以糖類代謝過程中的酶(BGIOSGA003878、BGIOSGA018439、BGIOSGA034087、BGIOSGA038435、BGIOSGA040591和BGIOSGA040592)。另外，IL732中多個基因(BGIOSGA003878、BGIOSGA034106、BGIOSGA035172、BGIOSGA038435)在低溫時的表達量遠高于常溫。

3　討論

通過比較東野耐冷株系常溫和低溫下基因表達譜的差異，不僅有助于找到東野中耐冷的關鍵基因，還可以了解東野耐冷分子調控機理。賀榮華對東野和93-11的冷處理前后表達譜進行比較分析，找到多個東野中特異相應冷脅迫的基因[13-14]。崔豐磊同樣篩選到5個在冷脅迫下表達出現(xiàn)差異的microRNA[15]。結合QTL定位，Liu等通過芯片分析比較冷脅迫下耐冷植株IL112和桂朝2號的表達譜差異，尋找到耐冷基因LTT7[7]。

圖1　樣品間相關系數(shù)圖

基因IDCKNPCKLPSTNPSTLP基因注釋BGIOSGA0038781.3014.663.47140.54α-淀粉酶BGIOSGA0094390.260.1114.3211.75BGIOSGA01843930.3035.29168.85216.77O-糖基水解酶BGIOSGA0184500.041.161.7330.36催化酶BGIOSGA0194712.537.6829.8421.44BGIOSGA0340860.000.004.3311.65BGIOSGA0340870.000.005.0112.16ATP結合蛋白BGIOSGA0341060.320.3524.0874.81甲基轉移酶BGIOSGA0341350.000.0064.4752.30BGIOSGA0341469.994.8431.6331.07谷胱甘肽過氧化物酶BGIOSGA0351719.732.0528.6521.46GTP結合蛋白BGIOSGA0351720.190.1617.6394.06BGIOSGA0352060.000.0418.1815.27核小體蛋白BGIOSGA0379080.782.2622.6618.88BGIOSGA0384354.7834.4423.6381.54磷酸基轉移酶BGIOSGA0391240.100.0923.4316.29BGIOSGA0405482.691.4413.5212.11BGIOSGA0405912.783.2415.6227.60已糖轉移酶BGIOSGA0405926.486.0913.5721.07已糖轉移酶BGIOSGA0406835.514.6617.8018.24EPlOING000000019460.000.007.6911.15EPlOING000000383600.000.0073.9759.01

本實驗中篩選到強耐冷株系IL732，并通過表達譜差異分析最終篩選到了22個在株系IL732中特異響應冷脅迫的基因，與以往報道的東野中冷脅迫表達差異基因不相同。這可能是由于對照親本不同、耐冷株系含有耐冷遺傳位點不同和冷脅迫溫度時間處理不同等導致的。22個基因中能夠注釋到的主要是代謝酶類和核酸結合蛋白，其中存在多個糖類代謝過程中的酶，可能參與能量代謝，或者糖類物質代謝。以往多個植物冷脅迫表達譜分析都表明能量代謝相關基因在冷脅迫下表達發(fā)生變化[16]，并且冷脅迫也能顯著影響植物細胞壁組分中多糖類代謝基因的表達模式[17-18]。糖類物質在植物體的積累能夠增強植株的耐冷性，并且多個細胞壁組分多糖代謝相關基因都能夠改變植株的耐冷性[19-21]。有研究表明東野中莖稈較為堅硬，植株中多糖類物質含量顯著高于栽培稻[22]。因此這些酶基因的特異表達表明東野的耐冷機制可能與東野獨特的能量代謝或多糖類物質代謝調控過程有關。而對于耐冷株系IL732中低溫表達量遠高于常溫的基因，有必要作為研究的重點在以后的實驗中對其功能加以驗證。

圖2　表達差異基因維恩圖

[1] 陳大洲,羅利軍.東鄉(xiāng)野生稻苗期和穗期的耐寒性研究[J].江西農業(yè)學報,1996，18(1):1-6.

[2] 何光存,周一強.東鄉(xiāng)野生稻(Oryzarufipogon)在武漢地區(qū)越冬性能的觀察[J].武漢大學學報:自然科學版,1996(2):252-254.

[3] Zhao J, Qin J, Song Q, et al. (JIA2015-0966)Combining QTL mapping and expression profile analysis to identify candidate genes of cold tolerance from Dongxiang common wild rice (OryzarufipogonGriff.)[J]. Journal of Integrative Agriculture, Doi: 10.1016/S2095-3119(15)61214-X.

[4] 肖葉青,吳小燕,胡蘭香,等.贛香B近等基因導入系構建與目標性狀篩選[J].分子植物育種,2010,8(6):1128-1132.

[5] 陳大洲,肖葉青,皮勇華,等.東鄉(xiāng)野生稻耐冷性的遺傳改良初步研究[J].江西農業(yè)大學學報,2003,25(1):8-10.

[6] Wang Y J, Zhang Z G, He X J, et al. A rice transcription factorOsbHLH1 is involved in cold stress response[J]. Theoretical & Applied Genetics, 2003, 107(8): 743-749.

[7] Liu F, Xu W, Song Q, et al. Microarray-assisted fine-mapping of quantitative trait loci for cold tolerance in rice[J]. Molecular Plant, 2013, 6(3): 757-767.

[8] Ma Y, Dai X, Xu Y, et al.COLD1 confers chilling tolerance in rice[J]. Cell, 2015, 160(6): 1209-1221.

[9] Mao D, Yu L, Chen D, et al. Multiple cold resistance loci confer the high cold tolerance adaptation of Dongxiang wild rice (Oryzarufipogon) to its high-latitude habitat[J]. Theoretical & Applied Genetics, 2015, 128(7): 1359-1371.

[10] 左佳,高婧,賀榮華,等.東鄉(xiāng)野生稻苗期抗寒性QTL的初步定位[J].雜交水稻,2012,27(3):56-59.

[11] 夏瑞祥,肖寧,洪義歡,等.東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷性的QTL定位[J].中國農業(yè)科學,2010,43(3):443-451.

[12] Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data[J]. Genome Biology, 2010, 11(10): 1-12.

[13] 賀榮華.冷脅迫下東鄉(xiāng)野生稻表達譜測序分析[D].長沙：中南大學,2012.

[14] 沈春修,李丁,夏玉梅,等.冷脅迫條件下東鄉(xiāng)野生稻中高表達基因位點BGIOSGA004402的氨基酸序列分析[J].雜交水稻,2015，30(1):64-67.

[15] 崔豐磊.東鄉(xiāng)野生稻冷脅迫應答microRNA的篩選及驗證[D].南昌：江西師范大學,2015.

[16] 徐兆華,吳為人.擬南芥冷害脅迫下基因表達譜的統(tǒng)合分析[J].華南農業(yè)大學學報,2013(4):511-516.

[17] Shen C, Li D, He R, et al. Comparative transcriptome analysis of RNA-seq data for cold-tolerant and cold-sensitive rice genotypes under cold stress[J]. Journal of Plant Biology, 2014, 57(6): 337-348.

[18] Le M Q, Pagter M, Hincha D K. Global changes in gene expression, assayed by microarray hybridization and quantitative RT-PCR, during acclimation of threeArabidopsisthalianaaccessions to sub-zero temperatures after cold acclimation[J]. Plant Mol Biol, 2015, 87(1): 1-15.

[19] Qi Z, Chen Q, Wang S, et al. Rice and cold stress: methods for its evaluation and summary of cold tolerance-related quantitative trait loci[J]. Rice, 2014, 7(1): 1-12.

[20] Purugganan M M, Braam J, Fry S C. The Arabidopsis TCH4 xyloglucan endotransglycosylase. Substrate specificity, pH optimum, and cold tolerance[J]. Plant Physiology, 1997, 115(1): 181-190.

[21] Ji H, Wang Y, Cloix C, et al. TheArabidopsisRCC1 family proteinTCF1 regulates freezing tolerance and cold acclimation through modulating lignin biosynthesis[J]. Plos Genetics, 2015, 11(9): 1-9.

[22] Tang W W, Wu X L. Comparison of neutral detergent fiber, acid detergent fiber and acid detergent lignin contents of dongxiang wild rice and cultivated rice[J]. Agricultural Science & Technology, 2010, 11(3): 11-14.

(責任編輯：曾小軍)

Comparative Analysis of Expression Profile of Gene in Cold-tolerant Introgression Line from Dongxiang Wild Rice

CHEN Ming-liang1, ZHANG Lu-biao2, HU Lan-xiang1,WU Xiao-yan1, CHEN Hong-ping1, XIAO Ye-qing1*

(1. Rice Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences / National Engineering Laboratory of Rice (Nanchang), Nanchang 330200, China; 2. Shangrao Food and Drug Administration of Jiangxi Province, Shangrao 334000, China)

Five cold-tolerant rice lines were selected from the introgression line population of Dongxiang wild rice under cold stress. The digital gene expression profiling (DEG) differences of cold-tolerant line IL732 and recurrent parent Ganxiang B at both normal temperature and low temperature were analyzed, and 22 genes which could specifically respond to cold stress in IL732 were screened out, including several genes encoding carbohydrate metabolism enzymes. The specific expression of these enzymatic genes showed the cold-tolerant mechanisms of Dongxiang wild rice might be related to the unique energy metabolism or carbohydrate metabolism process in Dongxiang wild rice.

Dongxiang wild rice; Introgression line; Cold stress; Expression profiling analysis

2016-04-08

江西省優(yōu)勢科技創(chuàng)新團隊建設計劃項目(20142BCB24011)；江西省青年科學基金計劃(20142BAB214013)。

陳明亮(1982─)，男，江西南昌人，副研究員，博士，主要從事水稻遺傳育種。*通訊作者：肖葉青。

S511

A

1001-8581(2016)09-0001-04