梁剛　何盟國　馬清涌

1陜西核工業(yè)215醫(yī)院肝膽外一科病區(qū)，陜西咸陽712000

2西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安710000

Slit/Robo信號通路在胰腺癌細胞中的表達及其對胰腺癌細胞生長的影響

梁剛1何盟國1馬清涌2#

1陜西核工業(yè)215醫(yī)院肝膽外一科病區(qū)，陜西咸陽712000

2西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安710000

目的探討Slit/Robo信號通路在胰腺癌細胞中的表達情況，及其對胰腺癌細胞增殖的影響。方法分別采用RT-PCR、免疫細胞化學、免疫熒光方法檢測胰腺癌細胞株BxPC-3、Panc-1中Slit和Robo的表達；通過Slit/Robo信號通路阻斷劑RoboN阻斷該通路，采用MTT法觀察其對細胞生長的影響。結(jié)果胰腺癌細胞株Bx-PC-3、Panc-1中存在著Slit2、Robo1基因和蛋白表達；在RoboN的作用下，胰腺癌細胞體外生長受到抑制，增殖能力下降。結(jié)論胰腺癌細胞中可能存在著Slit2/Robo1信號通路，它能夠負性調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的生長，提示Slit/ Robo信號通路可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展的過程。

Slit/Robo信號通路；胰腺癌細胞；細胞生長

1　材料與方法

1.1實驗材料

人胰腺癌細胞株BxPC-3（中度分化）、Panc-1（低分化），由西安交通大學醫(yī)學院肝膽外科實驗室提供；兔抗人Slit2多克隆抗體（博士德生物工程有限公司）；兔抗人Robo1多克隆抗體（Abcam公司）；阻斷劑Robo1（N-20）P（RoboN，Santa Cruz Biotechnology）；MTT試劑（西唐生物科技有限公司）；引物由北京三博志遠生物工程技術服務有限公司合成：Slit2：P1 5-CTGTAACTGCTACCTGGCTTGG-3（2205-），P25-ACTCTGTGACATCTCTTGGAATACC-3（-2497）；product：275 bp。

Robo1：P1 5-CCTACTCCTTACGCCACCACTC-（34054-），P25-GCCACTTCTTGTTTCTGCTGTCC-3（-4175）；product：122 bp。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人胰腺癌細胞株BxPC-3、Panc-1用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于含5%CO2、37℃恒溫、飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.2.2RT-PCR法檢測各組細胞中Slit、Robo基因表達分別提取胰腺癌細胞株BxPC-3、Panc-1中細胞總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將Slit2、Robo1

引物稀釋至工作濃度100 pmol/μl，按照PCR反應體系加入引物及cDNA合成DNA，最后通過瓊脂糖凝膠電泳得到目的基因條帶。

1.2.3免疫細胞化學法檢測Slit2、Robo1蛋白在各組細胞中的表達取對數(shù)生長細胞，將其接種于鋪有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定，中性樹膠固定蓋玻片，滴加0.5%Tritonx-100、3%H2O2，血清封閉，滴加一抗（PBS配制，濕盒）4℃孵育過夜，滴加生物素化的二抗孵育（濕盒），DAB顯色，蘇木素復染，脫水，固定，拍照。陰性對照組免去一抗滴加。陽性結(jié)果判斷標準：光鏡下觀察到以細胞質(zhì)內(nèi)有棕褐色細顆粒染色為陽性信號。

1.2.4免疫熒光染色法檢測Slit2、Robo1蛋白在各組細胞中的表達免疫熒光法步驟大體同免疫組化法，不同的是：在滴加一抗過夜后，滴加熒光標記的二抗工作液，脫水、透明、封片后于熒光顯微鏡下觀察照相。陰性對照組免去一抗滴加。陽性結(jié)果判斷標準：熒光顯微鏡下觀察到細胞受激發(fā)出的綠色熒光。

1.2.5MTT法檢測Slit/Robo信號通路阻斷后對胰腺癌細胞增殖的影響取對數(shù)生長期的胰腺癌細胞，胰酶消化后，以5～10×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中。設定1個對照組和3個實驗組，對照組不加阻斷劑，實驗組加競爭性阻斷劑Robo1（N-20）P（簡寫為RoboN）的濃度分別為5、10、20 μg/ml。胰腺癌細胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)孵育5 h，吸棄培養(yǎng)孔上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使甲瓚充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490 nm光吸收值（OD值），計算細胞生長抑制率繪制生長曲線。抑制率=1-實驗孔OD值/對照孔OD值×100%。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x-±s）表示。采用t檢驗，比較各組間是否存在統(tǒng)計學差異，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1Slit2、Robo1基因在胰腺癌細胞中的表達

在胰腺癌細胞株BxPC-3（圖1）、Panc-1（圖2）中，通過RT-PCR法發(fā)現(xiàn)Slit2和Robo1均有基因表達。其中Slit2的退火溫度為55℃，Robo1的退火溫度為64℃，β-actin的退火溫度為56℃。

圖1　Slit2、Robo1基因在BxPC-3細胞中的表達

圖2　Slit2、Robo1基因Panc-1細胞中的表達

2.2免疫細胞化學法檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞中的表達

通過免疫細胞化學法，檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞株BxPC-3（圖3）、Panc-1（圖4）中均有表達。

在BxPC-3中，圖3中A圖示為對照組，細胞質(zhì)內(nèi)未見棕褐色細顆粒，只見染成藍紫色的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞內(nèi)可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞內(nèi)可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核。上述實驗結(jié)果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌BxPC-3中表達。

在Panc-1中，圖4中A圖示為對照組，細胞質(zhì)內(nèi)未見棕褐色細顆粒，只見染成藍紫色的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞內(nèi)可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞內(nèi)可見棕色細顆粒，及染成藍紫色的細胞核。上述實驗結(jié)果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌Panc-1中表達。

圖3　Slit2、Robo1蛋白在BxPC-3細胞中的表達

2.3免疫熒光法檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞中的表達

通過免疫熒光法，檢測出Slit2、Robo1蛋白在胰腺癌細胞株BxPC-3（圖5）、Panc-1（圖6）中均有表達。

在BxPC-3中，圖5中A圖示為對照組，細胞上未見綠色熒光，只見發(fā)出藍色熒光的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發(fā)出藍色熒光的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發(fā)出藍色熒光的細胞核。上述實驗結(jié)果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌BxPC-3中表達。

在Panc-1中，圖6中A圖示為對照組，細胞上未見綠色熒光，只見發(fā)出藍色熒光的細胞核；B圖示為加了Slit2蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發(fā)出藍色熒光的細胞核；C圖示為Robo1蛋白一抗組，細胞上可見綠色熒光，及發(fā)出藍色熒光的細胞核。上述實驗結(jié)果說明，Slit2、Robo1蛋白可以在胰腺癌Panc-1中表達。

圖5　Slit2、Robo1蛋白在BxPC-3細胞中的表達

圖6　Slit2、Robo1蛋白在Panc-1細胞中的表達

2.4胰腺癌細胞生長能力

2.4.1 MTT法繪測定各組胰腺癌細胞的OD值及抑制率表1為MTT法檢測BxPC-3胰腺癌細胞在培養(yǎng)24、48、72 h后的OD值及抑制率。從表中可以看出：阻斷Slit/Robo信號通路后，隨著胰腺癌細胞培養(yǎng)時間的延長，胰腺癌細胞生長抑制率逐漸增高。

表1　BxPC-3細胞培養(yǎng)24、48、72 h各組的OD值及抑制率

表2為MTT法檢測Panc-1胰腺癌細胞在培養(yǎng)24、48、72 h后的OD值及抑制率。從表中同樣可以看出：阻斷Slit/Robo信號通路后，隨著胰腺癌細胞培養(yǎng)時間的延長，胰腺癌細胞生長抑制率也逐漸增高。

表2　Panc-1細胞培養(yǎng)24、48、72 h各組的OD值及抑制率

2.4.2細胞生長抑制率在胰腺癌BxPC-3細胞中，實驗組對胰腺癌細胞生長的抑制率存在濃度依賴性，在24、48、72 h時，實驗組20 μg/ml與10 μg/ml的抑制率存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；在48、72 h時實驗組10 μg/ml與5 μg/ml的抑制率也存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見圖7。

和胰腺癌BxPC-3細胞類似，在Panc-1細胞中，在24、48、72 h時，實驗組10 μg/ml與5 μg/ml間，實驗組20 μg/ml與10 μg/ml間的抑制率均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見圖8。

圖7　不同濃度RoboN對胰腺癌BxPC-3細胞的生長影響差異

圖8　不同濃度RoboN對胰腺癌BxPC-3細胞的生長影響差異

3　討論

胰腺癌是一種具有高度侵襲行為的消化道惡性腫瘤，在我國，發(fā)病率呈逐年增長趨勢。胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移是嚴重影響預后的因素，而有關上述方面的研究仍是目前研究的熱點問題。

Slit/Robo信號通路較早是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中進行研究的，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有抑制神經(jīng)細胞遷移，阻止合縫處神經(jīng)軸突穿過神經(jīng)管中線，控制神經(jīng)軸突在神經(jīng)系統(tǒng)中準確定位［14］的作用。Slit/Robo信號通路對感覺神經(jīng)元的中樞突分支及延伸有抑制作用，而對其周圍突分支及延伸有促進作用［15］。此外，Slit/Robo信號通路在外周自主神經(jīng)系統(tǒng)的形成和發(fā)展中也具有一定作用［16］。

Slit/Robo信號通路對腫瘤發(fā)生發(fā)展也有作用，但各方面的研究報道結(jié)果尚不統(tǒng)一，主要表現(xiàn)在以下三個方面，第一，Slit/Robo信號通路在腫瘤中表達情況不同，表現(xiàn)在其是癌基因與抑癌基因方面的認識不同；第二，Slit/Robo信號通路對腫瘤新生血管形成的作用報道不一，來源于該信號通路可以通過誘導血管內(nèi)皮細胞的遷移促進新生血管形成，還是抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移減少新生血管形成的結(jié)論不同；第三，Slit/Robo信號通路對腫瘤細胞遷移作用的報道也尚不一致，出現(xiàn)該信號通路可以抑制腫瘤細胞遷移，或者誘導腫瘤細胞遷移，從而促進腫瘤細胞的侵襲、擴散及轉(zhuǎn)移。

目前尚無Slit/Robo信號通路在胰腺癌中的研究報道，由于胰腺癌具有神經(jīng)浸潤的特征性表現(xiàn)，其神經(jīng)浸潤機制可能與某些神經(jīng)導向因子有關。Slit/Robo信號通路不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)的生長及分支，且其已被發(fā)現(xiàn)存在于許多惡性腫瘤細胞中發(fā)揮一定作用?；谝陨涎芯繄蟮?，本實驗首先通過RTPCR、免疫細胞化學、免疫熒光兩種方法證實胰腺癌細胞中存在Slit2、Robo1基因及蛋白的表達。表明在胰腺癌細胞中同樣存在Slit/Robo信號通路，即Slit2/Robo1信號通路。與肝癌、直腸癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌等其他惡性腫瘤類似，Slit/Robo信號通路可能對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展具有一定作用。

為了進一步探討Slit/Robo信號通路對胰腺癌細胞的作用，本實驗通過用不同濃度的Robo1胞外區(qū)阻斷劑RoboN，它可以競爭性結(jié)合Robo第1個免疫球蛋白功能區(qū)，從而阻斷Slit2/Robo1信號通路活性，通過檢測細胞生長情況，發(fā)現(xiàn)添加阻斷劑RoboN的實驗組較正常對照組胰腺癌細胞的吸光度下降，細胞生長的抑制率上升，表明Slit2/Robo1信號通路對胰腺癌細胞的生長具有一定影響作用。通過統(tǒng)計學方法驗證各組間細胞生長抑制率差異的顯著性，發(fā)現(xiàn)在24、48、72 h時，各濃度組的抑制率存在顯著性差異（P＜0.05），并且隨著實驗組對Slit2/Robo1信號通路阻斷時間的延長，這種抑制作用也越來越明顯。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Slit/Robo信號通路可以抑制胰腺癌細胞的生長，這和馬宇光［17］用Slit/Robo信號阻斷劑R5預處理人舌鱗狀上皮癌細胞系Tb細胞后，Tb細胞的增殖率減弱，PCNA蛋白表達水平下降結(jié)果一致，表明Slit/Robo信號通路也參與了胰腺癌細胞生長的過程。

隨著進一步的研究，Slit家族和Robo家族的其他成員可能在胰腺癌其他細胞株中將會被發(fā)現(xiàn)；Slit/Robo信號通路對胰腺癌生長、浸潤、轉(zhuǎn)移的生物學行為作用也將被揭示；此外通過研究，具有神經(jīng)導向和促進腫瘤發(fā)生發(fā)展雙重作用的Slit/Robo信號通路，可能為胰腺癌的神經(jīng)浸潤機制提供新的分子水平上的理論依據(jù)。

胰腺癌預后極差，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過添加Slit/Robo信號通路阻斷劑RoboN可以抑制胰腺癌細胞的生長。因此，進一步深入研究Slit/Robo信號通路對胰腺癌的作用及機制，治療方法提供新的理論支持。目前關于Slit/Robo信號通路在腫瘤中的作用報道不多，且現(xiàn)有的報道結(jié)果尚不統(tǒng)一，各種不明確的研究結(jié)果均揭示了Slit/Robo信號對腫瘤發(fā)生發(fā)展作用的復雜性，而這種不統(tǒng)一的研究結(jié)果可能與該信號通路中不同配、受體的相互作用有關，其機制也需要進一步深入研究。

［1］Brose K，Bland KS，Wang KH，et al.Slit proteins bind Robo receptors and have an evolutionarily conserved in repulsive axon guidance［J］.Cell，1999，96（6）：795-806.

［2］Wu W，Wong K，Chen J，et al.Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit［J］.Nature，1999，400（6742）：331-336.

［3］Dickson BJ，Gilestro GF.Regulation of commissural axon pathfinding by slit and Robo receptors［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2006，22（6）：651-675.

［4］Hohenester E.Structural insight into Slit-Robo signalling［J］.Biochem Soc Trans，2008，36（2）：251-256.

［5］Hussain SA，Piper M，F(xiàn)ukuhara N，et al.A molecular mechanism for the heparan sulfate dependence of slit-robo signaling［J］.J Biol Chem，2006，281（51）：39693-39698.

［6］Fukuhar N，Howwitt JA，Hussain SA，et al.Sturctual and functional analysis of Slit and heparin binding to immunoglobulin-like domains 1 and 2 of Drosophila Robo［J］.J Biol Chem，2008，283（23）：16226-16234.

［7］Wang B，Xiao Y，Ding BB，et al.Induction of tumor angiogenesis by Slit-Robo signaling and inhibition of cancer growth by blocking Robo activity［J］.Cancer Cell，2003，4（1）：19-29.

［8］Singh RH，Indra D，Mitra S，et al.Deletions in chromosome 4 differentially associated with the development of cervical cancer：evidence of slit2 as a candidate tumor suppressor gene［J］.Hum Genet，2007，122（1）：71-78.

［9］Wang LJ，Zhao Y，Han B，et al.Targeting Slit-Roundabout signaling inhibits tumor angiogensis in chemical-induced squamous cell squamous cell carcinogenesis［J］.Cancer Sci， 2008，99（3）：510-517.

［10］Legg JA，Herbert JM，Clissold P，et al.Slits and Roundabouts in cancer，tumour angiogenesis and endothelial cell migration［J］.Angiogensis，2008，11（1）：13-21.

［11］Schmid BC，Rezniczek GA，F(xiàn)abjani G，et al.The neuronal guidance cue Slit2 induces targeted migration and may play a role in brain metastasis of breast cancer cells［J］. Breast Cancer Res Treat，2007，106（3）：333-342.

［12］Yuasa-Kawada J，Kinoshita-Kawada M，Rao Y，et al.Deubiquitinating enzyme USP33/VDU1 is required for Slit sigmaling in inhibiting breast cancer cell migration［J］. Proc Nati Acad Sci USA，2009，106（34）：14530-14535.

［13］Yiin JJ，Hu B，Jarzynka MJ，et al.Slit2 inhibits glioma cell invasion in the brain by suppression of Cdc42 activity［J］. Neuro Oncol，2009，22（6）：779-789.

［14］Bagri A，Marin O，Plump AS，et al.Slit proteins prevent midline crossing and determine the dorsoventral position of major axonal pathways in the mammalian forebrain［J］. Neuron，2002，33（2）：233-248.

［15］Le Ma，Marc Tessier-Lavigne M.Dual branch-promoting and branch-repelling Actions of Slit/Robo signaling on peripheral and central branches of developing sensory axons［J］.J Neurosct，2007，27（25）：6843-6851.

［16］Young HM，Anderson RB，Anderson CR.Guidance cues involved in the development of the peripheral autonomic nervous system［J］.Auton Neurosci，2004，112（1-2）：1-14.

［17］馬宇光，王麗京，韓冰.信號對口腔癌Tb細胞增殖作用的影響［J］.實用口腔醫(yī)學雜志，2006，21（4）：441-444.

Expression of Slit/Robo signaling pathway in pancreatic cancer cells and its effect on cell growth

LIANG Gang1HE Meng-guo1MAQing-yong2#1Department of Hepatobiliary Surgery，Xianyang 215 Hospital of the Nuclear Industry in Shaanxi Province，Xianyang 712000，Shaanxi，China2Department of Hepatobiliary Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710000，Shaanxi，China

ObjectiveTo detect the expression of Slit/Robo signaling pathway in pancreatic cancer cells，and to analyze its impact on cell growth.MethodThe expression of Slit/Robo signaling pathway was detected in pancreatic cancer cell line BxPC-3 and Panc-1 by RT-PCR，immunohistochemistry，and immunofluorescence，respectively.Then the blocker RoboN was used to block the Slit/Robo signal pathway，and the cell proliferation was observed as per MTT method. ResultThe gene and protein expression of Slit2 and Robo1 was observed in pancreatic cancer cell line BxPC-3 and Panc-1.With the addition of inhibitor RoboN，the in-vitro cell growth and proliferation of pancreatic cancer cells was suppressed.ConclusionThere may be a Slit2/Robo1 signaling pathway in pancreatic cancer cells，which may negatively regulate the growth of pancreatic cancer cells，suggesting that the Slit/Robo signaling pathway is potentially engaged in the occurrence and development of pancreatic cancer.

Slit/Robo signaling pathway；pancreatic cancer；cell growth

R735.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.02.15

Oncol Prog，2016，14（2）

（corresponding author），郵箱：qyma56@mail.xjtu.edu.cn作用。但Slit/Robo信號在胰腺癌細胞中是否也有表達，是否參與調(diào)控胰腺癌細胞的生長，國內(nèi)外尚未見報道。本研究通過檢測胰腺癌細胞中Slit、Robo的表達情況及阻斷Slit/Robo信號通路，分析該通路對胰腺癌細胞生長的影響。

2015-06-30）

較早的研究發(fā)現(xiàn)，Slit/Robo信號通路作為神經(jīng)導向因子在神經(jīng)系統(tǒng)中具有軸突排斥［1］、軸突導向［2］、抑制神經(jīng)元遷移［3］等作用。目前，已知Slit家族由Slit1、Slit2、Slit3組成，它們在神經(jīng)系統(tǒng)、其他細胞中均有表達，如白細胞、肺臟、腎臟、黃體等。Slit蛋白含有4個亮氨酸富有區(qū)序列（LRRs，D1～D4）、7～9個EGF樣的重復序列、一個半胱氨酸富有區(qū)C末端序列和一個層黏素G序列，其中LRRs參與和受體結(jié)合。Robo家族是一類保守跨膜受體蛋白，由4個成員組成：Robo1、Robo2、Robo3、Robo4，它們主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達，也可表達于非神經(jīng)系統(tǒng)，如血管內(nèi)皮細胞、肌細胞等。Robo1、Robo2、Robo3由含有5個Ig樣功能區(qū)及3個纖連蛋白Ⅲ組件（fibronectin typeⅢmodule，F(xiàn)N）的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)區(qū)組成，胞內(nèi)區(qū)含有分別命名為：CC0、CC1、CC2、CC3的4個小區(qū)域。Robo4胞外區(qū)域只含兩個Ig樣功能區(qū)以及3個纖連蛋白Ⅲ組件，胞內(nèi)區(qū)域只有CC0和CC2。研究表明，在硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）蛋白多聚糖的參與下，Slit主要通過第2個LRR（D2）結(jié)合Robo胞外前兩個Ig樣功能區(qū)，激活Robo受體胞內(nèi)區(qū)域，使其與一些重要信號分子，如srGAPs等相互作用，而產(chǎn)生相應的生物學作用［4-6］?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，Slit/Robo信號通路在多種腫瘤細胞中都有表達，不同腫瘤細胞中該信號通路基因表達亞型不同［7-8］，并且其對腫瘤新生血管的形成［7，9-10］、細胞的遷移［11-13］都具有一定