周文文，尹端端，薛　雷，楊雁鴻*，吳劍冬，王真真

(1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤二科，河北 秦皇島 066000；2.承德醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 承德 067000)

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·論著·

尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑對人肺腺癌A549細(xì)胞的體外實驗

周文文1，尹端端1，薛雷1，楊雁鴻1*，吳劍冬1，王真真2

(1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤二科，河北 秦皇島 066000；2.承德醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 承德 067000)

目的探討尼妥珠單抗(Nimotuzumab h-R3)聯(lián)合順鉑對人肺腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。方法h-R3和順鉑序貫作用于人肺腺癌A549細(xì)胞，試驗分為5個組：A組(h-R3單抗，終濃度為200 mg/L)、B組(順鉑單藥，終濃度2.0 mg/L)、C組(200 mg/L 的h-R3提前24 h預(yù)處理后加用2.0 mg/L的順鉑)、D組(200 mg/L的h-R3和2.0 mg/L的順鉑同時給予)及E組(空白對照組)。用MTT法觀察各組藥物對細(xì)胞的抑制情況，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期分布，免疫蛋白印跡法測定細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)水平。 結(jié)果不同時點比較：各組隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長，對細(xì)胞生長的抑制率逐漸升高(P<0.01)；組間比較：在24、48和72 h中，B組、C組和D組對細(xì)胞生長的抑制率高于A組，C組高于B組，D組低于C組(P<0.01)，在所有時點中C組抑制率都是最高的。在不同的細(xì)胞周期中，各組對細(xì)胞生長的抑制率不同：在G0～G1期，A、B、C、D各組的抑制率均高于E組(P<0.05)，C組的抑制率仍最高，D組抑制率低于B組(P<0.05)； 在S期，A、B、C、D各組抑制率低于E組(P<0.05)，C組的抑制率最低(P<0.05)，D組抑制率高于B組和C組(P<0.05)；在G2～M期，各組對細(xì)胞生長抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 D組中Cyclin D1蛋白表達(dá)量反而高于B組。 結(jié)論提前應(yīng)用h-R3干預(yù)能加強順鉑對A549細(xì)胞的殺傷作用，通過下調(diào)Cyclin D1水平將細(xì)胞抑制于G0～G1期；同時給予h-R3和順鉑時反而起到拮抗作用，更好地印證了臨床上靶向藥物應(yīng)在化療前給予。

肺腫瘤；細(xì)胞周期蛋白D1；順鉑；尼妥珠單抗

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.09.022

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，隨著大氣環(huán)境污染的加劇，吸煙人群的增加，肺癌成為全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其病死率在惡性腫瘤中也位居第一位[1]。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small-cell carcinoma,SCLC)，NSCLC比例約占87.05%，每年全球有超過一百萬人死于此病[2]，肺腺癌是NSCLC中的一個主要類型，約占NSCLC的40%，其發(fā)生率呈逐年上升趨勢。由于其原發(fā)腫瘤較小且多位于外周，經(jīng)常無明顯癥狀，較容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，大部分患者發(fā)現(xiàn)并確診時已發(fā)展為晚期，無法進(jìn)行手術(shù)治療，所以預(yù)后較差。晚期肺癌只能進(jìn)行姑息性放化療延緩病情的進(jìn)展，但晚期肺癌患者體質(zhì)較差，許多患者無法耐受放化療的不良反應(yīng)。隨著分子靶向藥物的誕生和發(fā)展，現(xiàn)已成為晚期NSCLC的又一治療方法，但是靶向藥物用于臨床的時間較短，與目前現(xiàn)有化療藥物聯(lián)合的療效仍存在較大爭議。本研究旨在探討尼妥珠單抗(Nimotuzumab h-R3)聯(lián)合順鉑對人肺腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，報告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和試劑細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌A549細(xì)胞株由河北省秦皇島市第一醫(yī)院中心實驗室保存，用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；四季青)、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素雙抗合劑的DMEM/高糖(Gibco)培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。主要試劑：順鉑(山東齊魯制藥廠)；h-R3(百泰生物藥業(yè)有限公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法測定藥物對A549細(xì)胞的增殖抑制作用實驗分為A組(h-R3單藥，終濃度為200 mg/L)、B組(順鉑單藥，終濃度2.0 mg/L)、 C組(200 mg/L 的h-R3提前24 h預(yù)處理后加用2.0 mg/L的順鉑)、D組(200 mg/L的h-R3和2.0 mg/L的順鉑同時給予)及E組(空白對照組)。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化液消化細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM制備成單細(xì)胞懸液，并使其濃度配置為3×104/mL，之后將其按100 μL/孔種于96孔板中，接種細(xì)胞貼壁培養(yǎng)12 h后，換用無血清培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)12 h。去除舊培養(yǎng)基，加入用含1%FBS培養(yǎng)基稀釋的上述不同濃度的藥物至總體積相等，均為200 μL，空白對照組只加含1%FBS的培養(yǎng)基。取加藥后的24、48、72 h進(jìn)行MTT檢測，每孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后停止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，使用PBS小心沖洗孔板2遍，最后每孔加入150 μL DMSO，用吸管反復(fù)抽吸10次，使結(jié)晶物充分溶解。在波長為492 nm的酶標(biāo)儀上測定各孔吸光值(OD值)，記錄結(jié)果。實驗設(shè)6個平行孔，重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞生長抑制率(%)=(空白對照組OD值-實驗組的OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)測定各組細(xì)胞在藥物處理后的細(xì)胞周期分布分組及處理同MTT，但細(xì)胞培養(yǎng)時換用培養(yǎng)瓶，加入藥物培養(yǎng)48 h后用0.25%胰酶消化，制備成單細(xì)胞懸液后，移入10 mL離心管，2 000 r/min離心5 min，收集沉淀， PBS洗滌沉淀1次。細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷的固定液2 mL，4 ℃固定30 min。1 000 r/min離心10 min，加入PI染色液1 mL[33 mg/L PI，0.13 mg/mL RnaseA，10 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，0.5% Triton-100]，室溫孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測DNA-PI的熒光強度，調(diào)整流式細(xì)胞儀的激發(fā)光波長488 nm、發(fā)射光波長530 nm。采用Modit軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3Western blot測定CyclinD1水平分組及處理同流式細(xì)胞術(shù)，通過提取蛋白質(zhì)、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)等步驟得出條帶。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)　　果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置光學(xué)顯微鏡下(調(diào)至100倍)觀察各組作用于A549細(xì)胞。A、B、C、D各組均能使A549細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞密度變小，且 C組抑制作用明顯高于其他各組(圖1)。

2.2各組對A549細(xì)胞的增殖抑制作用不同時點比較：各組隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長，對細(xì)胞生長的抑制率逐漸升高(P<0.01)；組間比較：在24、48和72 h中，B、C和D組對細(xì)胞生長的抑制率高于A組，C組高于B組，D組低于C組(P<0.01)，在所有時點中C組抑制率都是最高的。見表1。

組別24h48h72hFPA組4.40±1.835.58±3.2110.11±6.2210.9140.000B組14.35±0.32*31.19±1.74☆56.97±1.42*☆▲367.2490.000C組17.00±0.76*#51.62±2.37*#☆82.17±1.62*#☆▲1970.5510.000D組11.97±1.08*#△24.39±0.63*#△☆48.39±1.84*#△☆▲661.2290.000F154.972944.891506.742P0.0000.0000.000

*P<0.01與A組比較#P<0.01與B組比較△P<0.01與C組比較☆P<0.01與24 h比較▲P<0.01與48 h比較(SNK-q檢驗)

2.3各組細(xì)胞藥物處理后的細(xì)胞周期分布不同藥物處理方式下4組細(xì)胞中的細(xì)胞周期呈現(xiàn)不同變化：在G0～G1期，A、B、C、D組對細(xì)胞生長抑制率高于E組(P<0.05)，B組和C組抑制率高于A組(P<0.05)；C組高于B組(P<0.05)； 在S期，A、B、C、D組抑制率低于E組(P<0.05)；B組、C組抑制率低于A組(P<0.05)，C組低于B組(P<0.05)，D組高于C組(P<0.05)；在G2～M期，各組對細(xì)胞生長抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組細(xì)胞藥物處理48 h后的細(xì)胞周期分布比較　，%)

*P<0.05與E組比較#P<0.05與A組比較△P<0.05與B組比較☆P<0.05與C組比較(SNK-q檢驗)

2.4各組中Cyclin D1表達(dá)A、B、C、D組中Cyclin D1蛋白的表達(dá)均較E組降低，其中C組降低最為明顯，D組反而較B組表達(dá)量高。

3　討　　論

h-R3是我國第一個自主研發(fā)的用于治療惡性腫瘤的單抗類藥物，于2008年獲準(zhǔn)上市，具有人源性、高選擇性和半衰期長的特點[3]。國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)其適應(yīng)證為：適用于與放療聯(lián)合治療抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達(dá)陽性的Ⅲ/Ⅳ期鼻咽癌。但目前大量臨床研究表明h-R3對于腦膠質(zhì)瘤、頭頸部惡性腫瘤、胰腺癌等多種癌癥都有較好的抑制作用，且上述研究已在國外完成其Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗。目前仍有大量臨床試驗正在研究h-R3單藥及其聯(lián)合化療用于腦轉(zhuǎn)移瘤、NSCLC、乳腺癌、食管癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、前列腺癌和宮頸癌等。

h-R3的作用機制為：其特異性結(jié)合EGFR，占據(jù)EGFR分子的3A表位，阻礙表皮生長因子、腫瘤壞死因子α等天然配體與EGFR結(jié)合，從而切斷EGFR的下游通路，最終達(dá)到抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制腫瘤新生血管的生成[4-8]。該抗體抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并增強放化療的殺傷作用。王秀力等[9]研究顯示，h-R3在體外單獨應(yīng)用時無明顯抑制率，但h-R3聯(lián)合順鉑后增強了順鉑對CAL-27細(xì)胞的殺傷作用，同時還抑制了CAL-27細(xì)胞分泌表皮生長因子與血管內(nèi)皮生長因子。武獻(xiàn)珍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，h-R3可增強放療對胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的生長抑制作用，其增敏作用的機制可能與抑制EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加等有關(guān)。凌華毓等[11]研究表明，體外應(yīng)用h-R3聯(lián)合表阿霉素提高了對HepG2細(xì)胞的殺傷作用，且2種藥物都可以影響HepG2細(xì)胞的周期分布，h-R3可使HepG2細(xì)胞阻滯于G0～G1期，表阿霉素使細(xì)胞阻滯在S期，2藥物聯(lián)合使細(xì)胞大量停滯在G0～G1期和S期，G2/M期的細(xì)胞比例僅為0.16%。李小燕[12]研究發(fā)現(xiàn)，h-R3單獨應(yīng)用時在體外不論對EGFR高表達(dá)還是低表達(dá)均無明顯的抑制作用，聯(lián)合伊立替康和氟尿嘧啶能增加化療的敏感性，聯(lián)合奧沙利鉑時與細(xì)胞株種類有關(guān)，效應(yīng)機制可能是通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路，引起細(xì)胞發(fā)生G0～G1期阻滯。木亞林[13]研究顯示，體外單獨使用h-R3能使人食管鱗癌EC9706細(xì)胞(EGFR高表達(dá))阻滯于G1期，且有微弱的細(xì)胞抑制作用，與順鉑或氟尿嘧啶聯(lián)合起到相加作用，但h-R3無論單藥或是聯(lián)合化療藥物對人食管鱗癌EC1細(xì)胞(EGFR低表達(dá))的體外實驗均無明顯作用。顏瑩等[14]研究發(fā)現(xiàn)，h-R3單獨應(yīng)用對A549細(xì)胞的生長增殖未見明顯抑制作用，但增強了照射對A549細(xì)胞的生長抑制作用。袁智勇等[15]研究表明，h-R3對肺腺癌細(xì)胞株(A549)、人肺癌細(xì)胞系(未分化癌，Calu-6)細(xì)胞均有抑制增殖作用，不同加藥時序影響放射增敏效應(yīng)，其中放療前加藥放射增敏效應(yīng)最強。

NSCLC患者中，EGFR過度表達(dá)率較高，且與腫瘤分化、局部控制率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。國外學(xué)者研究表明多種肺癌細(xì)胞株應(yīng)用h-R3可增強放療療效，與細(xì)胞株的EGFR表達(dá)有關(guān)，而與EGFR突變無關(guān)。齊大亮等[16]研究顯示，聯(lián)合組采用h-R3聯(lián)合紫杉醇脂質(zhì)體、卡鉑方案治療，對照組采用紫杉醇脂質(zhì)體、卡鉑方案化療，聯(lián)合組能提高療效，延長患者至疾病進(jìn)展時間，且不良反應(yīng)較輕。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用h-R3單藥的A組對A549細(xì)胞有增殖抑制作用，但效果弱于應(yīng)用細(xì)胞毒性藥順鉑的B組，在聯(lián)合用藥中，提前應(yīng)用h-R3預(yù)處理后加用順鉑的C組 較單用順鉑的B組抑制率增加，其機制是通過下調(diào)Cyclin D1使細(xì)胞抑制于G0～G1期，而同時給予2種藥物的D組未顯示協(xié)同效應(yīng)，具體機制目前不明，需進(jìn)一步研究。本實驗結(jié)果正好為臨床上先給予靶向藥物再給予化療藥提供了一定的理論基礎(chǔ)。(本文圖見封三)

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(本文編輯：許卓文)

2015-10-29；

2016-05-02

秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(2012023A130)

周文文(1983-)，女，山東淄博人，河北省秦皇島市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事惡性腫瘤診治研究。

。E-mail:13833520070@163.com

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1007-3205(2016)09-1080-05