黃建鵬，賀玖明，朱　輝，李鐵鋼，黃正旭，莫　婷，李　梅

(1.暨南大學大氣環(huán)境安全與污染控制研究所，廣東 廣州　510632；2.北京禾信科學儀器有限公司，北京　100081；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京　100050；4.廣州禾信分析儀器有限公司，廣東 廣州　510535)

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國產高分辨飛行時間質譜儀在藥物分子結構鑒定中的應用

黃建鵬1,2，賀玖明3，朱輝4，李鐵鋼3，黃正旭1，莫婷4，李梅1

(1.暨南大學大氣環(huán)境安全與污染控制研究所，廣東 廣州510632；2.北京禾信科學儀器有限公司，北京100081；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京100050；4.廣州禾信分析儀器有限公司，廣東 廣州510535)

為了考察自主研發(fā)的API-TOF MS 10000電噴霧高分辨飛行時間質譜儀(ESI-TOF MS)對離子準確質量數(shù)測定的準確性及其在新藥研發(fā)中的應用前景，采用該儀器對新藥研發(fā)中涉及的291個天然產物及合成物進行質譜分析。以三氟乙酸鈉為內標物進行儀器質量軸校準，將測試得到的目標離子準確質量數(shù)與理論準確質量數(shù)對比，計算兩者的相對誤差。結果表明：248個樣品的分子質量測試結果與預期一致；對其中202個樣品進行高分辨質譜測試，所得實驗值與理論準確質量數(shù)之間的相對誤差均小于5×10-6；與預期不一致的實驗結果提示樣品的結構解析有誤，并得到了其他波譜數(shù)據(jù)的驗證。采用API-TOF MS 10000和美國AB Sciex公司的QSIAR Elite型Q/TOF MS對抗癌藥物馬來酸阿法替尼和降糖藥利格列汀雜質進行質譜分析。結果表明，自主研發(fā)的API-TOF MS 10000與國際同類儀器對藥物分子準確質量數(shù)的測試結果無明顯差異，可以提供化合物準確的分子質量和分子式信息，是新藥研發(fā)中藥物分子結構解析的有力工具。

飛行時間質譜儀(TOF MS)；高分辨質譜；藥物分析；結構鑒定

飛行時間質譜儀(TOF MS)具有測定質量范圍寬、響應速度快、分辨率高以及離子傳輸率高等優(yōu)點[1]。電噴霧(ESI)電離屬于軟電離方式，適用于熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)、極性大的化合物以及蛋白質等生物大分子的研究。兩者結合，即ESI-TOF MS，已成為生物制藥、基因蛋白質工程和生物化學等領域的重要研究工具[2-8]。

近年來，世界醫(yī)藥工業(yè)飛速發(fā)展，新藥的研發(fā)競爭日趨激烈，其中天然產物和微生物代謝物是極為重要的新藥開發(fā)資源，從中尋找新結構活性化合物作為先導化合物，以此為基礎開展新藥的合成或半合成研究是化學藥品投資研發(fā)的熱點[9-10]。不論是先導化合物的發(fā)現(xiàn)還是新藥的合成，目標化合物的結構解析都是不可或缺的工作[11-12]。質譜測試是藥物分子結構解析的重要手段之一，低分辨質譜測試可以通過正、負離子檢測模式初步確定化合物的分子質量，而高分辨質譜測試可以通過對化合物準確質量數(shù)的測定計算化合物可能的元素組成。由于高分辨飛行時間質譜可以通過對化合物準確質量數(shù)的測定，計算目標化合物可能的元素組成(即分子式)，且具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，現(xiàn)已成為藥物研發(fā)中化合物結構鑒定的重要工具[13-16]。廣州禾信分析儀器有限公司于2011年自主研發(fā)了高分辨飛行時間質譜儀(搭載ESI源)整機，該儀器分辨率可達10 000以上，檢出限為2.5 μg/L(利血平)，質量檢測范圍為30～5 000 Da，可以滿足藥物研發(fā)中各種不同結構及類型化合物的準確質量數(shù)測定。

本研究擬采用國產高分辨質譜儀對具有不同結構類型的291種新藥研發(fā)中涉及的天然產物或化學合成產物進行低分辨或高分辨的質譜測試，并在此基礎上確定其可能的元素組成。通過對測定結果進行回訪，并與其他波譜獲得的結果相比較，確定國產高分辨質譜儀測量結果的可靠性，以及其在藥物開發(fā)中的應用前景。

1　實驗部分

1.1儀器和試劑

API-TOF MS 10000電噴霧高分辨飛行時間質譜儀：廣州禾信分析儀器有限公司產品，配備ESI離子源；注射泵：美國Harvard Apparatus公司產品；ApoloMs質譜軟件：廣州禾信分析儀器有限公司產品；ChemDraw軟件：蘇州蘇杰思網絡有限公司產品。

甲醇、甲酸：均為色譜純，德國Merck公司產品；實驗用水：杭州娃哈哈集團有限公司產品；三氟乙酸鈉標準品：美國Sigma-Aldrich公司產品。所有樣品均由中國醫(yī)學科學院藥物研究所各課題組提供，分別由天然植物提取分離或化學合成得到。

1.2實驗條件

注射泵參數(shù)：注射器內徑3.26 mm，流速15 μL/min。

質譜參數(shù)：毛細管溫度150 ℃；電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，離子源電壓4 500 V；負離子模式，離子源電壓-3 800 V；質量分辨率10 000，質量掃描范圍m/z50～2 000；高分辨質譜測試采用內標法，以0.1%三氟醋酸鈉水溶液為內標物質。

流動相或樣品溶解的溶劑：正離子檢測模式下，采用含0.1%甲酸的甲醇-水溶液(4∶1，V/V)；負離子檢測模式下，采用甲醇-水溶液(4∶1，V/V)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用ApoloMs和ChemDraw軟件對數(shù)據(jù)進行采集和分析；利用ApoloMs工作站的質量校正功能，根據(jù)三氟乙酸鈉系列離子峰對得到的目標化合物的分子離子峰進行質量校正，測定其準確質量數(shù)；再根據(jù)客戶推導的可能的分子式，用ChemDraw軟件計算其理論準確質量數(shù)，最終得到實測準確質量數(shù)與理論準確質量數(shù)之間的相對誤差。

2　結果與討論

本研究共檢測各種類型的樣品291個，其中天然產物87個，合成產物204個；對其中的220個化合物進行高分辨質譜測試，71個化合物進行低分辨質譜測試。測試結束后，對客戶進行回訪，詢問該結果與其他波譜獲得結果的一致性和能否相互映證等信息。其中，248個樣品的質譜數(shù)據(jù)與預期結果一致。對與預期結果不一致的樣品，在其他商品化的質譜儀上進行進一步測試，只有1個化合物獲得了目標分子離子峰，其余42個樣品的測試結果與在本機上獲得的結果一致。通過與客戶溝通分析，總結了測試結果與客戶預期不一致的原因：1) 合成得到的產物并非是客戶的目標化合物，即化學合成過程有問題；2) 化合物本身的結構不穩(wěn)定，在測試前發(fā)生了結構變化；3) 化合物的純度不夠，需要進一步分離純化。

圖1　樣品分子質量分布圖Fig.1　Molecular weight distribution of compounds

測試結果與目標化學式一致的天然產物有76個，樣品的結構類型包括糖苷類、生物堿類、黃酮類、苯丙酸類、苯甲酸類、木質素類、香豆素類、萜類、核苷類、肽類、烯炔類、苯酞類等；測試結果與目標化學式一致的合成產物有172個，樣品的結構類型主要為天然產物的衍生物，例如吳茱萸堿衍生物、鹽霉素衍生物、小檗堿衍生物、石蒜堿衍生物、黃連堿衍生物等，還包括一些含有苯并呋喃、硫醚鍵、卟啉環(huán)等特征結構的有機化合物。以上248個樣品的分子質量分布范圍較大，主要集中在100～1 000 Da，分布情況示于圖1；其中，分子質量最小的樣品為145 Da的氮雜環(huán)化合物，分子質量最大的樣品是5 826 Da的門冬胰島素，其質譜圖示于圖2。以上結果說明，該質譜儀對各種不同結構類型的藥物分子、小分子化合物以及生物大分子都具有較好的鑒定能力。

2.1質譜解析實例分析

2.1.1黃酮類化合物本實驗共測試了25個黃酮類化合物，以IJB1701和HH-4為例，考察該方法對黃酮類化合物的分析結果。其中，IJB1701為黃酮苷類化合物，HH-4為查爾酮類化合物，對這2個化合物進行高分辨質譜測試的結果列于表1，對應的高分辨質譜圖示于圖3?？梢钥闯?，高分辨質譜圖峰形良好、信噪比高，其準確質量數(shù)計算結果顯示質量誤差均小于5×10-6。

注：a.五價離子；b.四價離子圖2　門冬胰島素的質譜圖Fig.2　Mass spectrums of insulin aspart

編號分子式分子離子峰理論準確質量數(shù)/Da實測準確質量數(shù)/Da相對誤差/×10-6IJB1702C22H22O10[M—H]—445.1140445.11420.45HH-4C49H52O28[M+Na]+1111.25371111.25723.15

圖3　黃酮類化合物IJB-1702(a)和HH-4(b)的質譜圖Fig.3　Mass spectrums of flavonoids IJB-1702 (a) and HH-4 (b)

該實驗測試的25個黃酮類化合物中，HBJ-21為分子質量未知的黃酮苷類化合物，通過對其進行正、負離子模式的低分辨質譜測試來確定分子質量，以方便進一步的化學式推導。HBJ-21的質譜圖示于圖4?？梢钥闯?，在負離子檢測模式下，離子峰m/z625.15豐度最高，且質量數(shù)大于625.15的區(qū)域無明顯離子峰，初步推斷m/z625.15為分子離子峰[M—H]—，分子質量可能為626；在正離子檢測模式下，可以觀察到基峰離子m/z649.14，它與m/z626相差23，符合正離子可能為[M+Na]+分子離子峰的推斷。依據(jù)2種離子化模式質譜分析的結果，可以判定該化合物的分子質量為626 Da。由客戶反饋意見，并結合其他波譜數(shù)據(jù)，得知該化合物分子式為C27H30O17，這與本實驗的結果完全一致。

2.1.2生物堿類化合物本實驗共測定了109個生物堿類化合物。其中，石蒜堿具有較好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗白血病作用[17-18]；黃連堿具有抑制A型單胺氧化酶、選擇性抑制和雙重抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制破骨細胞分化、選擇性調節(jié)血管平滑肌細胞中的多藥耐藥蛋白質、抗真菌、保護胃黏膜、保護心肌等藥理活性[19-20]；吳茱萸次堿具有保護心臟、降壓、舒血管、抗血栓、抗癌以及抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[5]。石蒜堿衍生物LY-1、LY-2，黃連堿衍生物XMA-33、XMA-64和吳茱萸次堿衍生物L-6和L-7在正離子檢測模式下的測試結果列于表2，吳茱萸次堿衍生物L-6和L-7的質譜圖示于圖5。

圖4　黃酮類化合物HBJ-21在正離子(a)和負離子(b)檢測模式下的質譜圖Fig.4　Mass spectrums of flavonoids HBJ-21 in positive (a) and negative (b) ion detection modes

樣品編號分子式分子離子峰理論準確質量數(shù)/Da實測準確質量數(shù)/Da相對誤差/×10-6LY-1C16H17NO4[M+H]+288.1230288.12310.35LY-2C16H19NO4[M+H]+290.1387290.13860.34XMA-33C28H22N2O6·HCl[M+H]+483.1551483.15530.41XMA-64C27H19F3N2O4·HCl[M+H]+493.1370493.13791.83L-6C18H12ClN3O[M+H]+322.0742322.07410.31L-7C18H12BrN3O[M+H]+366.0236366.02223.82

圖5　生物堿類化合物L-6(a)和L-7(b)的高分辨質譜圖Fig.5　High resolution mass spectrums of alkaloids L-6 (a) and L-7 (b)

由圖5可知：L-6化合物含有氯元素，該化合物中氯元素的同位素豐度比與自然界的氯元素同位素豐度比(約3∶1)一致；而L-7化合物含有溴元素，同樣，該化合物中溴元素的同位素豐度比與自然界的溴元素同位素豐度比一致。這說明該質譜儀能夠準確測定化合物的分子質量及同位素豐度信息。

2.1.3苯丙素類化合物苯丙素類化合物主要分為苯丙酸、香豆素、木質素3大類。本研究對13個苯丙素類化合物進行質譜測試，其中，XK-24化學式為C16H18O9，屬于苯丙酸類化合物，低分辨質譜中觀察到的分子離子峰為[M+Na]+；XK-27化學式為C15H16O9，屬于香豆素類化合物，低分辨質譜中觀察到的分子離子峰為[M—H]-。XK-24和XK-27的低分辨質譜圖示于圖6。

2.1.4木質素類化合物Sjj-w76和sjj-w96為木質素類化合物，對其進行高分辨質譜測試，其結果列于表3，質譜圖示于圖7。

圖6　苯丙素類化合物XK-24(a)和XK-27(b)的低分辨質譜圖Fig.6　Low resolution mass spectrums of phenylpropanoids XK-24 (a) and XK-27 (b)

編號分子式分子離子峰理論準確質量數(shù)/Da實測準確質量數(shù)/Da相對誤差/×10-6sjj-w76C17H18O9[M—H]-365.0878365.08831.37sjj-w96C32H38O20[M+Na]+765.1849765.18470.26

圖7　木質素類化合物sjj-w76(a)和sjj-w96(b)的高分辨質譜圖Fig.7　High resolution mass spectrums of lignins sjj-w76 (a) and sjj-w96 (b)

2.2高分辨質譜測試的準確性

本實驗對220種化合物進行高分辨質譜測試，以考察該儀器對化合物準確質量數(shù)測定的準確性。通過分析，證實了其中202種樣品的結構推導是正確的，它們的相對誤差均小于5×10-6，其分布示于圖8?？梢钥闯?，在202種樣品中，大多數(shù)化合物的質量相對誤差均小于2.5×10-6，占76.7%。這表明國產高分辨飛行時間質譜儀在化合物精確分子質量測試中具有較高的準確度，可以很好地區(qū)分不同元素組成且質量數(shù)相近的化合物。

圖8　202種化合物的相對誤差分布圖Fig.8　Relative error distribution of 202 detected compounds

為了進一步驗證國產高分辨質譜儀測試的準確性，本研究采用API-TOF MS 10000電噴霧高分辨飛行時間質譜儀與美國AB Sciex公司的QSTAR Elite型Q/TOF高分辨串聯(lián)質譜儀，分別對抗癌藥馬來酸阿法替尼和降糖藥利格列汀雜質進行高分辨質譜分析，結果示于圖9和圖10。對比實驗結果發(fā)現(xiàn)，兩款儀器的分辨率均為10 000，由QSTAR Elite和API-TOF MS 10000測試得到的馬來酸阿法替尼和利格列汀雜質的準確質量數(shù)與理論準確質量數(shù)之間的相對誤差分別為3.65×10-6、1.74×10-6和1.03×10-6、1.56×10-6，均小于5×10-6。另外，QSTAR Elite和API-TOF MS 10000測試得到的馬來酸阿法替尼和利格列汀雜質的準確質量數(shù)之間的相對誤差分別為2.47×10-6和3.13×10-6。由此可以判斷，國產高分辨飛行時間質譜儀與國際同類儀器對藥物分子準確質量數(shù)的測試結果無顯著差異，都可為藥物分子結構鑒定提供可靠信息。

圖9　馬來酸阿法替尼(a)和利格列汀雜質(b)的QSTAR Elite高分辨質譜圖Fig.9　QSTAR Elite high resolution mass spectrums of afatinib dimaleate (a) and linagliptin impurity (b)

圖10　馬來酸阿法替尼(a)和利格列汀雜質(b)的API-TOF MS 10000高分辨質譜圖Fig.10　API-TOF MS 10000 high resolution mass spectrums of afatinib dimaleate (a) and linagliptin impurity (b)

3　結論

本研究采用的國產API-TOF MS 10000高分辨飛行時間質譜儀具有正、負離子兩種檢測模式，可對化合物進行低分辨和高分辨的質譜測試。該儀器可以測定各種類型的小分子天然產物或合成物，也可以測定大分子蛋白質，適用于多種藥物結構的解析。此外，該質譜儀具有同位素遵從性強的優(yōu)點，高分辨測試結果具有較高的準確度，所有樣品的測定準確質量數(shù)與理論質量數(shù)的相對誤差都能控制在5×10-6以內。綜上，API-TOF MS 10000質譜儀能夠提供準確的分子質量和分子式信息，是藥物分子結構解析鑒定的重要工具，在新藥研發(fā)領域具有較好的應用前景。

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Analysis of Pharmaceutical Molecules for Structure Identification by Domestic High Resolution Time-of-Flight Mass Spectrometer

HUANG Jian-peng1,2, HE Jiu-ming3, ZHU Hui4, LI Tie-gang3,HUANG Zheng-xu1, MO Ting4, LI Mei1

(1.InstituteofAtmosphericEnvironmentalSafetyandPollutionControl,Ji′nanUniversity,Guangzhou510632,China;2.BeijingHexinScientificInstrumentCompanyLimited,Beijing100081,China;3.InstituteofMaterialMedical,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China; 4.GuangzhouHexinAnalyticalInstrumentCompanyLimited,Guangzhou510535,China)

Electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry (ESI-TOF MS) is one of the important tools for structure identification of molecules in drug research and development, in particular, the accuracy mass measured by high-resolution mass spectrometer can provide the information regard to elemental composition for the test compound. In recent years, with the rapid development of pharmaceutical industry, the demand for high-resolution mass spectrometer is increasing in the field of pharmaceutical research and development. The self-developed high-resolution time-of-flight mass spectrometer API-TOF MS 10000 has been designed in Guangzhou on 2011. The mass resolution of 10 000 can be achieved and the instrument detection limit is less than 2.5 μg/L (reserpine), mass ranges cover 30-5 000 Da. In order to verify the performance of this equipment for structure identification and the determining accurate mass of drug molecules, 291 natural products and synthesis products were analyzed on API-TOF MS 10000. Sodium trifluoroacetate was used as internal standard substance to calibrate the instrument, and the relative mass error was obtained by comparing the measured and theoretical mass. The molecular weights of 248 compounds determined by the machine are accord with their identified results, which have a large range of molecular weight from 145 to 5 826 Da. And the 248 compounds cover most of the chemical structure of natural products, such as flavonoids, alkaloids, lignins, phenylpropanoids, coumarins and so on. Accurate mass measurements were performed to confirm 202 compounds’ formula. The results reveal that all the relative mass error is less than 5×10-6, 76.7% of the relative mass error is less than 2.5×10-6. Other results (43 compounds) were inconsistent with the expected structure indicating the original proposed structure was wrong and the other spectra were also provided information to demonstrate the point. In conclusion, the domestic time-of-flight mass spectrometer can accurately determine the mass of drug molecules and isotope abundance ratio, and it has been demonstrated as a powerful tool to provide the molecule and formula information for structure elucidation of pharmaceutical molecules.

time-of-flight mass spectrometry (TOF MS); high-resolution mass spectrometer; pharmaceutical analysis; structure identification

2015-11-10;

2016-03-25

國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2011YQ170067)；廣東省自然基金(2015A030313339)；廣東省科技創(chuàng)新青年拔尖人才項目(2014TQ01X190)；廣東省工程中心建設項目(2015B0903029)資助

黃建鵬(1980—)，女(漢族)，北京人，助理研究員，從事質譜應用研發(fā)。E-mail: apsorc@aliyun.com

李梅(1980—)，女(漢族)，山東人，助理研究員，從事質譜應用方法開發(fā)和大氣環(huán)境科學研究。E-mail: limei2007@163.com

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0431-09

10.7538/zpxb.youxian.2016.0024

網絡出版時間：2016-07-05；網絡出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1405.028.html