石　鍇，孔祥怡，杜建時(shí)，徐金玲，李水明，王　勇，趙　晴

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春　130033；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春　130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院血管外科，吉林 長春　130033；4.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳　518060)

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人唾液蛋白質(zhì)組的納升液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜鑒定及高豐度蛋白質(zhì)分析

石鍇1，孔祥怡2，杜建時(shí)3，徐金玲4，李水明4，王勇4，趙晴1

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院血管外科，吉林 長春130033；4.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518060)

常規(guī)的定性分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)能否以及如何應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的相對(duì)定量分析是實(shí)際工作中經(jīng)常遇到的問題。本研究采用一維納升液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜(nano-HPLC-Triple TOF 5600)法鑒定人唾液蛋白質(zhì)組，并分析其基本組成，以探討質(zhì)譜數(shù)據(jù)與唾液中高豐度蛋白質(zhì)的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)共鑒定了6 044條特異性酶切肽段，歸屬于α-淀粉酶1、碳酸酐酶6、血清白蛋白、粘蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和免疫球蛋白等各種已知的高豐度蛋白質(zhì)在內(nèi)的521個(gè)蛋白，這為一維納升液相色譜分離條件下的唾液蛋白質(zhì)組的基本組成分析提供了參考。結(jié)果表明，僅用蛋白質(zhì)排序指標(biāo)Unused值表征蛋白質(zhì)的相對(duì)含量具有局限性，而蛋白質(zhì)排序、檢出肽段數(shù)目和肽段平均強(qiáng)度等綜合指標(biāo)與蛋白質(zhì)相對(duì)含量具有正相關(guān)性，即排名較后的蛋白質(zhì)均只有1條肽段被檢出，且肽段強(qiáng)度較低。這說明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)含量差別較大時(shí)，肽段的化學(xué)性質(zhì)和電離效率差異對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響已不占主要地位，即可以認(rèn)為當(dāng)肽段檢出數(shù)目、鑒定覆蓋率和肽段強(qiáng)度均較低時(shí)，蛋白質(zhì)的相對(duì)含量也較低。該結(jié)果可為利用Triple TOF 5600質(zhì)譜儀的定性鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行初步半定量判斷提供參考，也可為唾液蛋白質(zhì)組生物標(biāo)志物研究提供借鑒。

唾液；蛋白質(zhì)組；納升液相色譜；高分辨質(zhì)譜；信號(hào)強(qiáng)度；高豐度蛋白質(zhì)

唾液中的蛋白質(zhì)和多肽主要來自于腺體、其他體液和生物組織，其中包含豐富的生物體病理和生理信息[1]，也提供了一種除血清或血漿外非侵入性的生物標(biāo)志物來源[2]。唾液中的蛋白質(zhì)成分與生物的生理狀態(tài)密切相關(guān)，例如，大鼠在固定化壓力或連續(xù)光照下，唾液蛋白質(zhì)組成分會(huì)發(fā)生變化[3]；系統(tǒng)炎癥和蛋白質(zhì)能量營養(yǎng)不良會(huì)引起唾液蛋白質(zhì)成分的改變[4-5]；糖尿病患者Statherin蛋白的合成和分泌會(huì)減少[6]。

目前，關(guān)于唾液蛋白質(zhì)組及生物標(biāo)志物的研究已有較多報(bào)道[7-10]，但不同質(zhì)譜方法檢測(cè)的唾液蛋白質(zhì)組的結(jié)果差異較大。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目要多于雙向電泳和串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果，且與樣品用量和分離方法有關(guān)。例如，Bandhakavi等[11]利用六肽文庫和三維肽段分離在唾液蛋白質(zhì)組中鑒定了2 300多個(gè)蛋白質(zhì)；而Devic等[12]利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)研究慢性移植物抗宿主病時(shí)則只鑒定了249個(gè)蛋白。多維分離能夠鑒定更多蛋白質(zhì)的原因是唾液中蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)范圍較寬，占總質(zhì)量85%的腺體分泌蛋白占全部蛋白質(zhì)數(shù)目的比例小于10%[13]。

一維納升液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是蛋白質(zhì)組學(xué)分析的常用技術(shù)，本研究擬利用該技術(shù)分析健康人的唾液蛋白質(zhì)組，并利用蛋白質(zhì)排序、蛋白質(zhì)檢出肽段數(shù)目和肽段平均強(qiáng)度等指標(biāo)，綜合分析其中的高豐度蛋白質(zhì)組成。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

Eksigent nano LC-UltraTM2D納升液相色譜系統(tǒng)、TripleTOF 5600 Plus高分辨質(zhì)譜儀、Protein Pilot 4.5軟件：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)：美國Thermo Savant公司產(chǎn)品；乙腈和水為質(zhì)譜純，其他試劑均為分析純。

1.2樣品處理

取7名健康志愿者的唾液混合樣品，在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取400 μL唾液上清液于10 kD超濾管中；再以11 000 r/min離心20 min，重復(fù)3次，提取唾液蛋白；用200 μL 50 mmol/L的tris-HCl清洗，以11 000 r/min離心20 min，重復(fù)2次，除去唾液蛋白中的其他代謝物；加入200 μL 50 mmol/L的tris-HCl溶解蛋白后，利用牛血清白蛋白法定量。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件C18毛細(xì)管色譜柱(75 μm×15 cm)；流動(dòng)相：A為水-乙腈(含 0.1% 甲酸)溶液(98∶2，V/V)，B為乙腈-水(含 0.1% 甲酸)溶液(98∶2，V/V)；梯度洗脫程序：0～5 min、5%B，5～35 min、5%～40%B，35～65 min、80%B，65～70 min、5%B；流速300 nL/min；進(jìn)樣量7 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件采用Triple TOF 5600系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧離子源，噴霧電壓2.4 kV，氣簾氣壓力2×106Pa，霧化氣壓力3.4×105Pa，加熱溫度150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式(information dependent analysis, IDA)。一級(jí)TOF-MS單張圖譜的掃描時(shí)間為250 ms，每次IDA循環(huán)下，最多采集35張電荷為2+～7+，且單秒計(jì)數(shù)大于150的二級(jí)圖譜，每張二級(jí)圖譜的累積時(shí)間為60 ms。

1.4數(shù)據(jù)分析

對(duì)質(zhì)譜采集到的原始wiff圖譜文件，采用Protein Pilot 4.5軟件進(jìn)行檢索分析。參數(shù)設(shè)置如下：半胱氨酸烷基化為碘乙酰胺修飾、胰蛋白酶酶解，數(shù)據(jù)庫為uniprot_Homo sapiens(20 210條蛋白質(zhì)序列)，檢索方式為徹底檢索分析，假陽性率控制在1%。

1.5生物信息學(xué)分析

數(shù)據(jù)庫搜索得到蛋白對(duì)應(yīng)的基因名稱，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將唾液蛋白質(zhì)組對(duì)應(yīng)的基因名稱在Omicsbean平臺(tái)上進(jìn)行GO富集分析，計(jì)算這些蛋白同GO分類中某(幾)個(gè)特定分支的超幾何分布關(guān)系，并對(duì)每個(gè)有差異基因存在的GO返回一個(gè)p-value，小的p值表示差異基因在該GO中出現(xiàn)了富集。針對(duì)生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)中涉及的GO條目，列出所有相應(yīng)的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)，并繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2　結(jié)果與分析

2.1唾液蛋白質(zhì)組的鑒定結(jié)果及功能分析

本研究共檢測(cè)到6 044條特異性酶切肽段，歸屬于521個(gè)蛋白質(zhì)，它們的分子功能富集圖示于圖1。可見，鑒定到的唾液蛋白質(zhì)主要參與應(yīng)激反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的生物過程，并且在細(xì)胞的各個(gè)部分均有分布，主要行使分子的結(jié)合功能。

2.2唾液蛋白質(zhì)組中高豐度蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

闡明唾液蛋白質(zhì)組的高豐度蛋白質(zhì)是利用唾液多肽組進(jìn)行生物標(biāo)志物研究的基礎(chǔ)。雖然關(guān)于唾液中高豐度蛋白的報(bào)道較多，但通過質(zhì)譜的定性鑒定數(shù)據(jù)反映大體的定量信息尚未見報(bào)道。Protein pilot軟件基于未被其他蛋白質(zhì)利用的肽段序列的多少對(duì)所鑒定蛋白質(zhì)的可靠性進(jìn)行打分和排名，即Unused值，該值越高，說明鑒定結(jié)果越可信。本實(shí)驗(yàn)希望利用該值表示唾液蛋白質(zhì)組中的高豐度蛋白，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)該值的表征結(jié)果與文獻(xiàn)[7]報(bào)道不完全一致，這可能是因?yàn)門riple TOF 5600質(zhì)譜儀具有較寬的動(dòng)態(tài)范圍，定性鑒定的可靠性不能與相對(duì)定量的結(jié)果完全一致。從文獻(xiàn)[14]可知：對(duì)于某一特定蛋白質(zhì)，其上樣量與該蛋白質(zhì)的Unused值、肽段檢出數(shù)目和信號(hào)強(qiáng)度呈正相關(guān)；但對(duì)于不同蛋白質(zhì)，由于肽段序列的不同導(dǎo)致肽段的化學(xué)性質(zhì)和電離效率存在差異，一般認(rèn)為不能根據(jù)肽段檢出數(shù)目和信號(hào)強(qiáng)度比較不同肽段或蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，因而限制了這些指標(biāo)的應(yīng)用。本研究以Unused值排名前20位和后20位的蛋白質(zhì)為例，說明Unused值、序列覆蓋度和肽段平均信號(hào)強(qiáng)度與唾液中蛋白質(zhì)相對(duì)含量的相關(guān)性，并驗(yàn)證利用這些指標(biāo)判斷相對(duì)含量的可行性，結(jié)果分別列于表1和表2。

圖1　唾液蛋白質(zhì)的功能富集分析Fig.1　Functional enrichment analysis of saliva proteomics

表1　nano HPLC-ESI-MS/MS鑒定的唾液多肽組中Unused值排名前20位的蛋白質(zhì)

續(xù)表1

表2　nano HPLC-ESI-MS/MS鑒定的唾液多肽組中Unused值排名后20位的蛋白質(zhì)

表1中排在前列的蛋白質(zhì)多為唾液中的主要蛋白質(zhì)。例如：α-淀粉酶1是唾液中行使消化功能的主要成分；血清白蛋白和各種球蛋白來自血液；α-淀粉酶1、免疫球蛋白α鏈、血清白蛋白和鋅-α2糖蛋白等均被雙向電泳分離[15]。這證明了它們是唾液中的高豐度蛋白質(zhì)，說明Unused值的大小與蛋白質(zhì)的相對(duì)含量大小具有一致性。但是，僅僅應(yīng)用該值判斷蛋白質(zhì)的含量存在一定的局限性，難以反映唾液中全部高豐度蛋白質(zhì)的信息。例如，粘蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin都是唾液中的主要蛋白質(zhì)[16]，本研究共檢測(cè)到7種Cystatin，但它們的Unused值排名均在30位以后，粘蛋白則排在第257位。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)排名靠前的蛋白質(zhì)的檢出肽段數(shù)目和平均肽段強(qiáng)度均較高。例如，排名前100位蛋白質(zhì)的檢出肽段數(shù)目大多數(shù)大于10個(gè)，而排名后100位的蛋白質(zhì)均只檢出1～2個(gè)肽段。排名靠前的蛋白質(zhì)肽段平均強(qiáng)度也較高。例如，前20個(gè)高置信度蛋白質(zhì)中葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的肽段平均強(qiáng)度最低，但也在6 000 cps以上；排名最后的20個(gè)蛋白質(zhì)中，不僅均只檢測(cè)到1條肽段，而且最低肽段信號(hào)強(qiáng)度僅為155 cps，20個(gè)蛋白質(zhì)的平均信號(hào)強(qiáng)度為1 689 cps，結(jié)果列于表2。此外，排名前20的蛋白質(zhì)的最低鑒定覆蓋率為35%；而排名最后20的蛋白質(zhì)中最高覆蓋率僅為11%，即白介素36γ亞基，這是因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量較小，而其他大多數(shù)蛋白質(zhì)的覆蓋率在5%以下。以上結(jié)果表明，排名靠后的蛋白質(zhì)不僅Unused值較低，而且肽段檢出數(shù)目、鑒定覆蓋率和信號(hào)強(qiáng)度也較??；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)含量差別較大時(shí)，肽段的化學(xué)性質(zhì)和電離效率差異對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響可適當(dāng)忽略，即可以認(rèn)為較低的肽段檢出數(shù)目和肽段強(qiáng)度與較低的蛋白質(zhì)含量正相關(guān)。

以上結(jié)果說明，綜合考慮Unused值和肽段信號(hào)強(qiáng)度有可能為分析唾液中蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度提供參考信息。通過進(jìn)一步考察唾液中高豐度蛋白質(zhì)與其鑒定覆蓋率和信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)表1中排在前3位的蛋白質(zhì)α-淀粉酶1、碳酸酐酶6和血清白蛋白的總信號(hào)強(qiáng)度依次排在前3位，這說明對(duì)于這3個(gè)蛋白質(zhì)，利用Unused值排序和利用信號(hào)強(qiáng)度排序的結(jié)果是一致的，而且表1的20種蛋白質(zhì)中有14種蛋白質(zhì)的總信號(hào)強(qiáng)度在前20位以內(nèi)。按照蛋白質(zhì)總信號(hào)強(qiáng)度遞減的順序選取表1中未包括的10種蛋白質(zhì)，考慮到鑒定的蛋白質(zhì)肽段數(shù)目不同，利用肽段平均強(qiáng)度表示，以驗(yàn)證它們是否為唾液中的高豐度蛋白質(zhì)，結(jié)果列于表3。

表3　nano HPLC-ESI-MS/MS鑒定的其他高豐度蛋白

從表3可見，部分蛋白質(zhì)Unused值排序與其肽段強(qiáng)度差異較小。例如，血紅蛋白亞基β和熱休克70 Da蛋白1A/1B的兩種排序結(jié)果都在第20位左右；但是，有些蛋白質(zhì)的Unused值排名較后而信號(hào)強(qiáng)度較高，如粘蛋白-7雖然只有5條肽段被鑒定，但肽段平均信號(hào)強(qiáng)度為69 717 cps，在所有蛋白質(zhì)中最高；此外，免疫球蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、頜下腺雄激素調(diào)節(jié)蛋白、粘蛋白和熱休克70 Da蛋白等的Unused值排名稍后，但它們都是來源于腺體或血液中的唾液高豐度蛋白質(zhì)，并且肽段平均強(qiáng)度較高。以上結(jié)果說明，考慮肽段強(qiáng)度因素更有利于發(fā)現(xiàn)唾液中的高豐度蛋白。由于水溶性和電離效率不同，在質(zhì)譜分析中不能通過比較肽段的信號(hào)強(qiáng)度推測(cè)其相對(duì)含量。本研究發(fā)現(xiàn)，唾液蛋白質(zhì)組中高豐度蛋白與質(zhì)譜信號(hào)具有正相關(guān)性的原因可能有3個(gè)：1) 唾液蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)范圍較寬，蛋白質(zhì)含量的高低是影響質(zhì)譜信號(hào)的主要因素；2) 采用肽段平均強(qiáng)度可以將來自于同一蛋白質(zhì)的不同肽段化學(xué)性質(zhì)的差異平均化；3) 肽段檢出數(shù)目與信號(hào)強(qiáng)度具有相關(guān)性，檢出1條肽段的蛋白質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度通常都較低。

3　結(jié)論

本研究在唾液多肽組中共鑒定到521個(gè)蛋白質(zhì)，這為一維納升液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析唾液多肽組的基本組成提供了參考。通過綜合考慮肽段檢出數(shù)目、蛋白質(zhì)鑒定覆蓋率和肽段平均信號(hào)強(qiáng)度，可以從這些定性鑒定的數(shù)據(jù)中提取相對(duì)定量的信息，所得結(jié)果比單獨(dú)應(yīng)用Unused值更有利于發(fā)現(xiàn)唾液中的高豐度蛋白。

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Proteomic Identification and High Abundant Proteins Analysis of Human Saliva by Nano-Liquid Chromatography-High Resolution Tandem Mass Spectrometry

SHI Kai1, KONG Xiang-yi2, DU Jian-shi3, XU Jin-ling4, LI Shui-ming4,WANG Yong4, ZHAO Qing1

(1.DepartmentofNeurology,China-JapanUnionHospital,Changchun130033,China;2.NormanBethuneHealthScienceCenter,JilinUniversity,Changchun130021,China;3.VascularSurgeryofChina-JapanUnionHospital,Changchun130033,China;4.CollegeofLifeScience,ShenzhenKeyLaboratoryofMarineBioresourcesandEcology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

In mass spectrometry-based proteomics, one of the most common problem is whether and how to apply the mass spectrum data of qualitative analysis for the relative quantitative analysis, because not only there is interest for making full use of the data but also there is a demand in practical work. In this study, nano flow high performance liquid chromatography-high resolution tandem mass spectrometry (nano-HPLC-Triple TOF 5600) was used to analyze the basic components of the human saliva proteome, furthermore, the relationship between the mass spectrum data and the high abundant proteins in saliva was discussed. A total of 6 044 specific enzyme peptides arising from 521 proteins were identified, in whichα-amylase 1, carbonic anhydrase 6, serum albumin, mucin and several kinds of cystatin et al were identified as high abundant proteins. This study provided a basic reference for the component of saliva proteome based on the one-dimensional HPLC-MS/MS method. In addition, the result showed that although the Unused value is the most important parameters to measure the reliability of qualitative analysis protein, only using Unused value to stand for the relative abundance of proteins is not suitable. Fortunately, there is a positive correlation among the combination of the protein rank (Unused value), the number of peptides detected as well as the average intensity of peptides and the relative contents of protein. For example, for those of proteins whose Unused value is low, which only one peptide is detected and the intensity of peptides is also low. Namely, this result indicated that when the relative contents of protein is very different, the chemical properties and ionization efficiency of peptides are not the main parameters to affect the signal intensity. In other words, the low number of peptides detected combined with the low signal intensity indicated the content of protein is low. This result is helpful for evaluating the relatively quantitative composition of human saliva by using Triple TOF 5600 mass spectrometer and for the research on saliva proteome biomarkers.

saliva; proteomics; nano liquid chromatography; high resolution mass spectrometry; intensity of signal; high abundant protein

2016-02-03;

2016-05-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470804)；吉林省科技廳項(xiàng)目(20130727029YY，20150204057SF)；深圳市科技項(xiàng)目(JSGG20140703163838793)資助

石鍇(1987—)，男(漢族)，山東人，碩士研究生，從事阿爾茲海默癥的診斷和治療。E-mail: 37476347@qq.com

趙晴(1969—)，女(漢族)，吉林人，教授，從事認(rèn)知功能障礙的生物標(biāo)志物研究。E-mail: qingzhao888@hotmail.com

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0401-07

10.7538/zpxb.2016.37.05.0401