樂 淵*， 張 群， 劉春華， 吳南村

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心/海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南海口 571101)

蓮霧(Syzygiumsamarangense(Blume) Merr.et Perry)是桃金娘科蒲桃屬熱帶常綠果樹，其果實具有特殊的芳香，肉質(zhì)清脆可口。蓮霧主要分布在我國臺灣、海南、廣東和福建等熱帶亞熱帶地區(qū)[1，2]。由于熱帶地區(qū)高溫高濕的氣候特點，且蓮霧果皮薄、果肉組織幼嫩，導(dǎo)致蓮霧很容易發(fā)生病害[3，4]。

氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇都是內(nèi)吸性殺菌劑，在蓮霧種植過程中常用于防治如炭疽病、黑腐病、疫病、黑星病、斑點病等病害。但不合理使用可能會造成在蓮霧果實中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，引發(fā)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題。目前，國內(nèi)外已有報道利用氣相色譜法檢測氟硅唑、烯唑醇和液相色譜法檢測戊唑醇等，但這些方法往往前處理繁瑣、測定時間長、檢出限也較高，且尚未見有報道同時檢測蓮霧中氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇等四種殺菌劑[5 - 9]。由于蓮霧保鮮能力差、不耐儲存，室溫下只能保存一周左右，因此在蓮霧質(zhì)量安全監(jiān)測中急需快速、高通量的檢測方法，減少果農(nóng)因等待檢測結(jié)果而導(dǎo)致的果品損耗。本研究利用QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe)方法凈化蓮霧提取液，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測，方法簡便快速、準(zhǔn)確度高，可用于蓮霧中氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇等四種殺菌劑的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC/Quattro PremierTMXE超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國，Waters公司)， 配有電噴霧離子源(ESI)和MasslynxTM4.0 工作站；電子分析天平(瑞典，梅特勒托利多公司)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇標(biāo)準(zhǔn)品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；甲醇、乙腈為色譜純，購自美國Fisher公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附劑購自美國Agilent公司；C18吸附劑、石墨化炭黑(GCB)粉末購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

蓮霧樣品購自海南省?？谑心媳彼l(fā)市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成濃度為 100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18 ℃ 避光保存，有效期3個月。取空白蓮霧樣品按1.3方法進(jìn)行前處理，得到空白蓮霧基質(zhì)溶液，然后將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別用甲醇和空白蓮霧基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

蓮霧樣品經(jīng)去核取可食部分，用組織搗碎機(jī)搗碎，裝入潔凈容器內(nèi)，密封并于-18 ℃下保存。準(zhǔn)確稱取20.00 g均質(zhì)試樣于50 mL具塞離心管中，加入20.0 mL乙腈、6 g MgSO4、1.0 g NaCl后，高速(18 000 r/min)均質(zhì)1 min，再以5 000 r/min離心5 min。取上層乙腈溶液6.0 mL于預(yù)先加有200 mg PSA、200 mg C18及1 000 mg MgSO4的離心管中，渦旋60 s，再以5 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液過0.22 μm微孔濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器工作條件

1.4.1UPLC工作條件ACQUITY-UPLCTMBEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm；美國Waters公司)；流動相A為甲醇，流動相B為1 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～1.50 min,10%～70%A;1.50～5.50 min,70%～70%A;5.50～6.00 min,70%～90%A;6.00～6.50 min,90%～90%A;6.50～6.60 min,90%～70%A;6.60～7.00 min,70%～10%A;7.00～8.50 min,10%～10%A。流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.4.2ESI-MS/MS工作條件正離子電離模式；毛細(xì)管電壓3.00 kV；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量900 L/h；錐孔氣流量50 L/h；離子源溫度110 ℃；碰撞氣流速0.21 mL/min。多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM 分析的質(zhì)譜參數(shù)

* quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS工作條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源電離模式下，以流動注射方式分別對氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇的單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子全掃描，再對各自的子離子進(jìn)行全掃描，每個化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量及定性離子對，并進(jìn)行MRM參數(shù)的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表2。

在本文色譜條件下，以甲醇和1 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇可獲得較好的分離度及較高的響應(yīng)值。圖1為各殺菌劑濃度為50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖(50 ng/mL)Fig.1 MRM chromatogram of the standard solution(the concentration is 50 ng/mL)

2.2 凈化條件的選擇

QuEChERS方法采用乙腈提取，MgSO4和NaCl鹽析，無水MgSO4和PSA分散固相萃取凈化[10]。QuEChERS方法具有回收率高、速度快、操作簡單、可分析的農(nóng)藥范圍廣等優(yōu)點，但凈化能力較弱。為了提高凈化能力，研究人員在尋找更多吸附劑以不斷改進(jìn)該方法。除PSA外，還常用C18粉、GCB、氨丙基粉等作吸附劑[11 - 13]。PSA能去除強(qiáng)極性的有機(jī)酸、酚類，部分去除糖和脂類基質(zhì)干擾物，C18可以去除非極性的糖類、脂類等基質(zhì)干擾物，GCB能去除基質(zhì)中的色素。本實驗嘗試了使用PSA、PSA+GCB、C18、C18+GCB、PSA+C18、PSA+C18+GCB等條件來凈化蓮霧提取液，各條件下四種殺菌劑回收率見圖2。結(jié)果表明添加有GCB的吸附劑，烯唑醇的回收率低于60%。PSA+C18、PSA、C18三種條件下，四種農(nóng)藥的回收率在70%～115%之間。單獨使用PSA或C18粉末作吸附劑，凈化液呈乳白色，使用PSA+C18作吸附劑，凈化液澄清透明，說明PSA+C18作吸附劑凈化效果較好。因此本文采用PSA+C18作吸附劑來凈化蓮霧提取液。

圖2 不同凈化條件下4種殺菌劑的回收率Fig.2 Recovery of the four fungicides in different cleaning conditions

2.3 方法的線性范圍和檢出限

移取一定量的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白蓮霧基質(zhì)提取液為稀釋溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線系列，采用1.4中方法進(jìn)行測定，以儀器響應(yīng)峰面積(y)對各目標(biāo)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇的質(zhì)量濃度在5.0～500.0 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表2。

表2 氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

以信噪比(S/N)=3計，方法中烯唑醇、戊唑醇、氟硅唑和抑霉唑的檢出限(LOD)為0.71、0.30、0.63和0.80 μg/kg。以S/N=10計，方法中烯唑醇、戊唑醇、氟硅唑和抑霉唑的定量限(LOQ)為2.3、1.1、2.0和2.5 μg/kg。

2.4 方法的精密度和回收率

取空白蓮霧樣品，按2.5、5.0、50.0 μg/kg 3個水平進(jìn)行加入回收實驗，按1.3方法進(jìn)行前處理，平行測定5次，計算回收率和精密度。結(jié)果(表3)顯示，四種殺菌劑的回收率在79.2%～122% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.4%～9.0% 之間，符合方法學(xué)要求。

表3 方法回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

本文通過測定各農(nóng)藥在基質(zhì)匹配溶液中的響應(yīng)值(A)及其在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值(B)，得到基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect,ME)=(A-B)/B×100%。表4為蓮霧基質(zhì)中四種殺菌劑在5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)的基質(zhì)效應(yīng)(正值表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，負(fù)值表示基質(zhì)抑制效應(yīng))。結(jié)果表明，氟硅唑、戊唑醇和烯唑醇表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，抑霉唑表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。除烯唑醇在較高濃度時基質(zhì)效應(yīng)小于10%外，四種殺菌劑的基質(zhì)效應(yīng)都大于10%，最大值為-32.8%，說明基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響較大，計算時需要使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)。

表4 氟硅唑等四種殺菌劑在蓮霧提取液中的基質(zhì)效應(yīng)

2.6 實際樣品的測定

采用本實驗建立的方法測定了采集于?？谑心媳彼l(fā)市場的15份蓮霧樣品，均未檢出氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇四種殺菌劑。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于QuEChERS前處理方法，結(jié)合UPLC-MS/MS法快速檢測蓮霧中氟硅唑、戊唑醇、抑霉唑和烯唑醇等四種殺菌劑。實驗優(yōu)化了UPLC與MS的采集參數(shù)，確定了吸附劑的種類及用量，并考察了四種殺菌劑的基質(zhì)效應(yīng)。方法學(xué)考察及實際樣品測定證明該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確度高、成本較固相萃取低廉等優(yōu)點，可用于蓮霧中氟硅唑等四種殺菌劑的檢測，具備一定的推廣價值。