王婉君， 馬 偉*， 孫登明

(淮北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子，它能與進(jìn)入體內(nèi)的藥物小分子迅速的結(jié)合并達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而發(fā)揮藥物的生物學(xué)功效[1,2]，因此研究具有藥理活性的小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，對(duì)于解析藥物發(fā)揮藥效的作用機(jī)理，揭示藥物藥效的實(shí)質(zhì)內(nèi)涵具有重要的意義，同時(shí)也是藥物動(dòng)力學(xué)及臨床藥理學(xué)的重要內(nèi)容。當(dāng)前藥物小分子和牛血清白蛋白相互作用的研究已見(jiàn)報(bào)道[3,4]，但用電化學(xué)方法和熒光光譜法同時(shí)研究小分子與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制和測(cè)定方法報(bào)道較少。

異煙肼(INH)又稱(chēng)4-吡啶甲酰肼，是異煙酸的酰肼，對(duì)結(jié)核桿菌有抑制和殺滅作用，其生物膜穿透性好，被列為首選抗結(jié)核藥物[5]。本文用自制的L-天冬氨酸修飾電極(PLA/GCE)，用循環(huán)伏安法研究了INH與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，測(cè)定了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，并與熒光光譜法進(jìn)行了比較。同時(shí)INH與BSA的作用具有定量關(guān)系，本文研究了測(cè)定的最佳條件，利用熒光光譜法和電化學(xué)方法對(duì)INH和BSA進(jìn)行了測(cè)定，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

BAS100/W電化學(xué)分析系統(tǒng)(美國(guó)，BAS公司)；FP-6500型熒光光譜儀(日本，島津公司)；pHS-3C型精密酸度計(jì)(上?？祪x儀器有限公司)。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：自制聚L-天冬氨酸修飾電極(PLA/GCE)[6]為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為輔助電極。

BSA(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)儲(chǔ)備液：2.0×10-4mol/L，按常規(guī)配制，在4 ℃左右保存，使用時(shí)再稀釋至所需濃度；INH儲(chǔ)備液：1.0×10-2mol/L，使用時(shí)再稀釋至所需濃度；L-天冬氨酸溶液：5.0×10-3mol/L；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；其它試劑均為分析純。水為二次石英亞沸蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1電化學(xué)法取pH=7.0的PBS 2.0 mL，1.0×10-3mol/L INH溶液5.0 mL，加入不同濃度的BSA溶液，以水定容于10 mL容量瓶中，搖勻，靜置10 s后倒入電解池。在溫度298 K條件下，測(cè)量INH溶液、INH和BSA混合溶液的循環(huán)掃描伏安(CV)圖。

1.2.2熒光光譜法在10 mL比色管中，加入pH=7.0的PBS 2.0 mL，濃度為2.0×10-4mol/L BSA溶液1.0 mL，再加入不同濃度的INH溶液，以水定容，搖勻，靜置30 min。于溫度298 K下，在熒光光度計(jì)上記錄286～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜(λex=285 nm，λem=343 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA與INH相互作用的CV圖和熒光猝滅光譜圖

INH和INH-BSA體系的循環(huán)伏安圖見(jiàn)圖1。INH在聚L-天冬氨酸修飾電極上產(chǎn)生一個(gè)靈敏的氧化峰，加入BSA后INH的峰電流明顯降低，峰電位左移，表明兩者之間發(fā)生了相互作用。

由于色氨酸和酪氨酸殘基等的存在使蛋白質(zhì)能發(fā)出較強(qiáng)的熒光。由BSA和INH相互作用的熒光光譜圖(圖2)可以看出，在343 nm處有熒光最大發(fā)射峰，固定BSA的濃度，BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨著INH濃度的增加逐漸降低，表明INH能猝滅BSA的內(nèi)源熒光，兩者之間發(fā)生了相互作用。

圖1 異煙肼與牛血清白蛋白相互作用的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of BSA in the presence of INH1.INH；2.INH-BSA；cINH=5.0×10-4 mol/L；cBSA=2.0×10-5 mol/L；t=5 s；v=0.12 V/s；pH=7.0.

圖2 異煙肼與牛血清白蛋白相互作用的熒光猝滅光譜圖Fig.2 Fluorescence quenching of BSA in the presence of INH cBSA=2.0×10-5 mol/L;cINH(1-10)=0，5.0×10-5，1.0×10-4，1.5×10-4，2.0×10-4，2.5×10-4，3.0×10-4，3.5×10-4，4.0×10-4，4.5×10-4 mol/L;pH=7.0.

2.2 INH與BSA相互作用的光電化學(xué)機(jī)理

2.2.1電化學(xué)機(jī)理采用循環(huán)伏安法，改變底液的酸度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。它表明，隨著pH值的增加，INH與INH-BSA體系中氧化峰和還原峰電位均逐漸負(fù)移，峰電位與pH呈良好的線性關(guān)系，INH：Epa(V)=0.6307-0.05075pH，R=0.9977，斜率為50.75 mV/pH，接近59 mV/pH，說(shuō)明INH在電極上發(fā)生了等電子等質(zhì)子反應(yīng)，氧化還原峰為INH分子苯環(huán)上的鄰羥基氧化所致；INH-BSA：Epa(V)=0.6341-0.05037pH，R=0.9986，斜率為50.37 mV/pH，比INH的斜率減小。

圖3 (A)異煙肼在修飾電極上隨pH的變化的CV曲線;(B)峰電位與pH的關(guān)系曲線；(C)異煙肼-牛血清白蛋白在修飾電極隨pH的變化的CV曲線;(D)峰電位與酸度的關(guān)系曲線Fig.3 (A)Cyclic voltammograms of INH at modified electrode at different solution pH;(B) The relationship between the peak potential and pH；(C) Cyclic voltammograms of INH-BSA at modified electrode at different solution pH;(D) The relationship between the peak potential and pH pH(from 1 to 17):2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0;scan rate:120 mV/s；cINH=5.0×10-4 mol/L，cBSA=2.0×10-5 mol/L，t=5 s.

假定INH與BSA只形成一種簡(jiǎn)單的化合物BSA-mINH，而結(jié)合常數(shù)(β)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(m)可根據(jù)下式[8]求得：

lg[△I/(△Imax-△I)]=lgβ+mlg[Q]

(1)

式中，△Imax表示加入BSA前后INH峰電流的最大差值。作lg[△I/(△Imax-△I)]～lg[Q]的關(guān)系圖，其線性方程為：lg[△I/(△Imax-△I)]=4.189+1.137lg[Q]，R=0.9970。求得m=1.137，β=1.544×104L/mol。

2.2.2熒光猝滅機(jī)理熒光猝滅過(guò)程分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[9]。靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的基態(tài)分子之間的相互作用，其猝滅過(guò)程遵循Stern-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτo[Q]=1+KSV[Q]

(2)

上式中，F(xiàn)o是未加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；F是加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度；Kq是雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，KSV是Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。而[Q]則是猝滅劑的濃度，τo是猝滅劑不存在的條件下生物大分子的平均壽命，通常生物大分子的熒光壽命大約為10-8s。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，INH與BSA相互作用的Stern-Volmer方程曲線是一條直線。它們顯示出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：F0/F=1+4.083×103[Q]，R=0.9966。方程對(duì)應(yīng)的斜率為Stern-Volmer方程曲線的猝滅常數(shù)KSV，即KSV=4.083×103L/mol。由KSV=Kqτo，可以求得猝滅過(guò)程的速率常數(shù)Kq=4.083×1011L/(mol·s)，遠(yuǎn)大于各類(lèi)淬滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散常數(shù)2.00×1010L/(mol·s)，因此INH對(duì)BSA的熒光淬滅以靜態(tài)猝滅為主。

因?yàn)镮NH對(duì)BSA是靜態(tài)猝滅過(guò)程，所以可用對(duì)數(shù)方程來(lái)計(jì)算二者的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[10]:

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(3)

式中，F(xiàn)0和F分別是不存在和存在猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度，K為蛋白質(zhì)和猝滅劑的結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，[Q]是猝滅劑的濃度。

以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖為一直線，其線性方程為：lg[(F0-F)/F]=4.170+1.177lg[Q]，R=0.9991；則K=1.479×104L/mol，n=1.177。與電化學(xué)方法基本一致。

2.2.3熱力學(xué)函數(shù)的變化及作用力類(lèi)型的確定小分子與生物大分子的相互作用力類(lèi)型包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力[11,12]，根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)焓變△H和熵變△S的相對(duì)大小，可以判斷出藥物與蛋白質(zhì)相結(jié)合的主要作用力類(lèi)型。根據(jù)298 K、308 K兩個(gè)溫度下的結(jié)合常數(shù)可以計(jì)算出INH和BSA相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值，結(jié)果列于表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果298 K、308 K時(shí)△H<0，且△S>0。因此可以推測(cè)在該溫度范圍內(nèi)，該體系中INH和BSA之間的作用力主要是靜電作用力和疏水作用力。

表1 不同溫度下INH與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.3 測(cè)定INH和BSA的最佳條件

實(shí)驗(yàn)表明，電化學(xué)線性掃描伏安法測(cè)定INH-BSA的最佳條件為：pH=3.0的PBS，用量為2.0 mL；掃描電位范圍為-0.3～0.7 V；掃描速率為0.12 V/s。熒光光譜法測(cè)定INH-BSA的最佳條件為：pH=7.0的PBS，用量為2.0 mL；激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm；發(fā)射波長(zhǎng)為343 nm；放置時(shí)間15 min。在最佳條件下，分別用熒光光譜法(固定BSA濃度為2.0×10-5mol/L)、電化學(xué)循環(huán)伏安法(固定INH濃度為5.0×10-4mol/L)對(duì)INH-BSA進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 工作曲線(n=8)

2.4 干擾試驗(yàn)

采用熒光光譜法對(duì)10 mL混合后濃度為5.0×10-4mol/L的INH，及2.0×10-5mol/L的BSA溶液進(jìn)行測(cè)定，允許誤差在±5%以?xún)?nèi)，共存物質(zhì)允許量(mg)為：K+、Na+(4.0),Ba2+、Pb2+(1.0),Fe3+(0.5),Mg2+、Mn2+(0.3),Ca2+、Zn2+、Al3+(0.2),Cu2+、葡萄糖(0.1)。

采用循環(huán)伏安法對(duì)混合后濃度為5.0×10-4mol/L的INH，及2.0×10-5mol/L的BSA進(jìn)行測(cè)定，共存物質(zhì)的允許量(mg)為：Na+、K+、Na+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、葡萄糖(≥1.0 mg，未做最高限)，F(xiàn)e3+(0.3)，Pb2+(0.5)，半胱氨酸、Cu2+(0.1)。

2.5 樣品分析

將一定量異煙肼片溶解于100 mL容量瓶中，配制一定濃度的溶液，取5 mL的異煙肼樣品溶液并加入2 mL BSA、3 mL PBS(pH=7.0)，采用電化學(xué)法進(jìn)行分析；另外，對(duì)BSA配制了不同濃度的合成樣品，取2 mL并加入5 mL INH、3 mL PBS(pH=7.0)，采用熒光光譜法進(jìn)行分析，結(jié)果如表3。

表3 INH和BSA合成樣品分析(n=5)

3 結(jié)論

采用電化學(xué)、熒光光譜兩種方法對(duì)INH與BSA的相互作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，INH與BSA之間結(jié)合作用較強(qiáng)，靜態(tài)猝滅導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光減弱，而運(yùn)用電化學(xué)方法，BSA的加入使INH氧化峰電流降低，峰電位基本不變，峰電流的降低值與所加入的BSA濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。研究了其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和線性范圍等。該研究對(duì)于闡明INH在體內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程和藥用機(jī)理，設(shè)計(jì)和合成新藥的研究有一定的指導(dǎo)意義。