徐 帆， 吳芳輝*， 程立春， 宋 超， 程源晟， 黃曉潔

(安徽工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽馬鞍山 243002)

到目前為止，有多種方法識別和檢測金屬陽離子，其中光學(xué)傳感法由于具有操作簡單、可在線分析、成本低廉、響應(yīng)快速等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注。Zn2+是生物體內(nèi)必需的微量元素之一，在人體中主要存在于大腦、胰腺及精細(xì)胞中，它在基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、酶的調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞等方面起著非常重要的生理作用[1]。缺少Zn2+將會導(dǎo)致很多疾病，如神經(jīng)損傷、癲癇癥、暫時性全腦缺血、老年癡呆癥等疾病[2]。同時，鋅礦開采、冶煉加工、機(jī)械制造以及鍍鋅等都會造成環(huán)境中Zn2+的污染[3]。因此，實現(xiàn)對Zn2+的有效檢測具有重要的意義。近年來，基于喹啉[4]、聯(lián)吡啶[5]、芘[6]等基團(tuán)分子探針的光學(xué)傳感器識別或檢測環(huán)境和食品中的微量Zn2+已有報道，但是這些分子探針結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、合成原料價格昂貴、合成步驟也較為復(fù)雜。

席夫堿是一類有著C=N結(jié)構(gòu)的化合物，自身含有N、O等供電子體以及生色團(tuán)，對金屬離子具有較好的親和性[7]。在席夫堿上修飾具有獨特光物理特性，如大的斯托克斯位移、可見區(qū)激發(fā)和發(fā)射的香豆素基團(tuán)后可以構(gòu)建出對Hg2+、Ni2+、Cu2+等具有選擇性響應(yīng)的分子探針[8 - 10]，但有關(guān)香豆素席夫堿分子探針檢測Zn2+的文獻(xiàn)并不多見[11]。本文使用廉價易得的原料，通過較簡單的合成反應(yīng)制備了一種新型的香豆素席夫堿3-[(5-氯-2-羥基-苯亞甲基)-氨基]-7-羥基香豆素(CHB)，并對其進(jìn)行了必要的表征。研究發(fā)現(xiàn)，該分子探針在結(jié)合Zn2+之后，顏色發(fā)生了明顯改變，紫外-可見吸收光譜發(fā)生紅移，熒光顯著增強(qiáng)，并且識別的選擇性較高，可用于裸眼識別和在線定量檢測Zn2+。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nicolet/Nexus-870 FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片，美國)；Bruker Avance III 400MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，德國布魯克公司)；Perkin-Elmer 2400型元素分析儀(美國,PE公司)；Perkin Elmer LS55型熒光光譜儀(美國,PE公司)；WinASPECT Plus 2000型紫外-可見吸收光譜儀(美國)。

2,4-二羥基苯甲醛、乙酰甘氨酸和5-氯水楊醛均購自阿拉丁公司；無水乙醇、無水NaAc購自南京化學(xué)試劑有限公司；濃HCl購自上海中試化工總公司；乙酸酐購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用化學(xué)試劑均為分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 3-氨基-7-羥基香豆素的合成

采用改進(jìn)的文獻(xiàn)方法[12]合成3-氨基-7-羥基香豆素：將2,4-二羥基苯甲醛2.76 g (20 mmol)、乙酰甘氨酸2.34 g(20 mmol)與無水NaAc 4.92 g(60 mmol)加入到裝有45 mL乙酸酐的燒瓶中，在溫度139 ℃條件下加熱回流8 h，然后加入10 mL冰水，生成大量沉淀，過濾，將產(chǎn)物在濃HCl和乙醇(2∶1)混合溶劑中于85 ℃條件下回流3 h，自然冷卻，并用30% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5～6，析出大量沉淀，抽濾干燥后用無水乙醇重結(jié)晶。產(chǎn)率：2.12 g，60%。

1H NMR(400 MHz,DMSO)δ(ppm):9.84(s,1H),7.24(d,J=8.00 Hz,1H),6.71～6.67(m,3H),5.23(s,2H)。

1.3 香豆素席夫堿化合物CHB的合成

將3-氨基-7-羥基香豆素1.77 g(10 mmol)與5-氯水楊醛1.56 g(10 mmol)溶于10 mL無水乙醇中，80 ℃條件下回流4 h，產(chǎn)生大量沉淀，冷卻至室溫后，抽濾、洗滌、真空干燥，最終產(chǎn)物用無水乙醇重結(jié)晶。產(chǎn)率：2.75 g，87%。

1H NMR(400 MHz,DMSO)δ(ppm):12.74(s,1H),10.69(s,1H),9.27(s,1H),8.07(s,1H),7.75(d,J=2.69 Hz,1H),7.59(d,J=8.58 Hz,1H),7.46(dd,J=2.70 Hz,8.83 Hz,1H),7.01(d,J=8.83 Hz,1H),6.87(dd,J=2.25 Hz,8.50 Hz,1H),6.79(d,J=6.79 Hz,1H)。

IR(KBr,cm-1):3 400(AR-OH),1 720(-COOR),1 610(C=N)。

元素分析計算值(%)C16H10ClNO4:C 60.87，H 3.19，Cl 11.23，N 4.44，O 20.27；測定值(%):C 60.96，H 3.11，Cl 11.65，N 4.30，O 19.97。

CHB具體合成路線如下：

1.4 紫外-可見吸收光譜和熒光光譜測定方法

所有實驗均在室溫下進(jìn)行，采用紫外-可見吸收光譜儀測量吸收光譜，采用熒光光譜儀并使用長度為1 cm，容積為3 mL的石英比色皿測量熒光光譜。將一定量的CHB溶于分析純的溶劑DMF中配制化合物CHB的儲備溶液。本文研究的Zn2+和其它金屬離子溶液均是采用它們的硝酸鹽或乙酸鹽配制。紫外-可見、熒光滴定以及選擇性實驗均是將Zn2+加入到含有其它離子的CHB的DMF中進(jìn)行測定。CHB與Zn2+之間的結(jié)合常數(shù)(Ka)采用Benesi-Hilderbrand方程[13]測定，Job圖分析[14]用于測定CHB與Zn2+之間的結(jié)合比。

2 結(jié)果與討論

2.1 香豆素席夫堿的合成

眾所周知，含有C=O和C=N基團(tuán)的化合物對過渡金屬離子的親和性比對堿金屬和堿土金屬強(qiáng)[15]，因此本文選擇具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移特征的香豆素作為發(fā)光體與含有C=N結(jié)構(gòu)的席夫堿鍵合形成了可對過渡金屬離子比色識別的分子探針。實驗先采用2,4-二羥基苯甲醛、乙酰甘氨酸和無水NaAc在乙酸酐中通過Pechmann縮合反應(yīng)制備3-氨基-7-羥基香豆素，該反應(yīng)對溫度要求極為嚴(yán)格，即在139 ℃條件下加熱回流8 h后，自然冷卻后加入10 mL冰水，使未反應(yīng)的的乙酸酐分解，在冰水浴中緩慢調(diào)節(jié)pH，否則會在加入NaOH后溶液表面迅速產(chǎn)生黑色漂浮物，產(chǎn)物最后用無水乙醇重結(jié)晶能得到純凈的3-氨基-7-羥基香豆素。合成的3-氨基-7-羥基香豆素與5-氯水楊醛在無水乙醇中進(jìn)一步縮合形成香豆素席夫堿CHB。CHB的結(jié)構(gòu)分別采用核磁共振譜、紅外光譜和元素分析進(jìn)行表征。

2.2 香豆素席夫堿CHB對Zn2+的識別研究

首先采用紫外-可見吸收光譜研究了CHB的DMF溶液(10 μmol/L)中不斷加入Zn2+(其濃度分別為0、20、40、60、80和100 μmol/L)前后的變化，如圖1所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，在CHB的DMF溶液中不斷加入Zn2+之后，CHB自身因為電荷轉(zhuǎn)移在380 nm處的最大吸收峰逐漸下降，而在480 nm處新生成的吸收峰逐漸增強(qiáng)，還可觀察到溶液顏色由無色迅速變?yōu)槌赛S色，表明CHB與Zn2+形成了新的配合物。424 nm處的等吸收點則證實CHB與Zn2+之間形成一定摩爾比的配合物。利用紫外-可見吸收光譜數(shù)據(jù)并根據(jù)Benesi-Hilderbrand方程可以計算出CHB與Zn2+之間的穩(wěn)定常數(shù)Ka= 3.96×104L/mol[13]。

采用熒光光譜進(jìn)一步研究了Zn2+(100 μmol/L)對CHB的DMF溶液(10 μmol/L)熒光(激發(fā)波長為475 nm)的影響，如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)在CHB的DMF溶液中加入Zn2+后熒光顯著增強(qiáng)，在365 nm紫外燈下也很容易觀測到CHB(50 μmol/L)與Zn2+(100 μmol/L)結(jié)合后的熒光現(xiàn)象。由于CHB分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移(ICT)[16]以及C=N雙鍵的順反異構(gòu)[17]，使得CHB在580 nm處的熒光非常微弱，而加入Zn2+后，CHB與Zn2+之間強(qiáng)烈的配位化作用，抑制了分子探針的C=N異構(gòu)化作用，減少了非輻射衰減，導(dǎo)致CHB的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。

圖1 CHB的DMF溶液中加入不同濃度Zn2+后的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of CHB in DMF with gradual addition of Zn2+cZn2+(1-6):0,20,40,60.80 and 100 μmol/L.

圖2 CHB的DMF溶液中加入Zn2+后的熒光光譜Fig.2 Fluorescence response of CHB to Zn2+ in DMF solution

2.3 其它離子的干擾研究

本文首先研究了100 μmol/L的Na+、 Ca2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Fe3+等常見離子與CHB的DMF溶液(10 μmol/L)作用后的紫外-可見吸收光譜，如圖3所示。由圖可見，Cu2+、Co2+、Ni2+與Zn2+一樣，分別在495、550、560 nm處形成了新的吸收峰，表明它們也與CHB形成了新的配合物。為此，本文進(jìn)一步采用熒光光譜法研究Na+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+、Hg2+、Ag+和Ru3+12種可能共存的離子對CHB的DMF溶液的熒光強(qiáng)度的影響(激發(fā)波長為475 nm)，從而驗證CHB的選擇性。由圖4可見，除了Zn2+之外，這12種共存離子對CHB的熒光基本沒有增強(qiáng)作用，而在含Zn2+的CHB的DMF溶液中加入其它共存離子也不會影響Zn2+對CHB熒光的增敏作用，表明CHB分子探針對Zn2+的識別選擇性較高。

2.4 CHB與Zn2+結(jié)合研究

使用熒光滴定的方法測定了580 nm處，CHB的DMF溶液(10 μmol/L)熒光強(qiáng)度在加入不同濃度Zn2+(分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 μmol/L)后的變化曲線，如圖5所示?？梢钥闯鲭SZn2+的加入，CHB在580 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)加入80 μmol/L Zn2+后，CHB的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。

采用Job圖[14]分析了CHB 與Zn2+之間的結(jié)合比，如圖6所示。當(dāng)Zn2+的摩爾分?jǐn)?shù)為0.5時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，證明CHB 與Zn2+之間以1∶1方式配位。

圖3 CHB的DMF溶液中分別加入其它金屬離子的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectra of CHB with different metal ion in DMF solution

圖4 各金屬離子對CHB的DMF溶液熒光的改變Fig.4 Selective fluorescence enhancement of CHB in DMF to Zn2+ over other 12 metal ions

圖5 CHB的DMF溶液中分別加入Zn2+后熒光強(qiáng)度的變化；內(nèi)插圖：CHB的熒光強(qiáng)度與Zn2+濃度的關(guān)系Fig.5 Fluorescence intensity of CHB in DMF in the presence of Zn2+;Inset:fluorescence intensity of CHB as a function of Zn2+ concentration

圖6 CHB與Zn2+之間的Job圖Fig.6 Job’s plot of CHB with Zn2+ in DMF solution

3 結(jié)論

本研究采用價廉易得的原料通過簡單的方法合成了一種新的香豆素席夫堿化合物3-[(5-氯-2-羥基-苯亞甲基)-氨基]-7-羥基香豆素(CHB)，該分子探針對Zn2+響應(yīng)靈敏，而且選擇性較高。在CHB的DMF溶液中加入Zn2+，其紫外-可見吸收光譜中380 nm處的吸收峰逐漸降低，而在480 nm處新形成的吸收峰逐漸增強(qiáng)，580 nm處的熒光峰強(qiáng)度顯著變大，根據(jù)Benesi-Hilderbrand方程計算出CHB與Zn2+之間的結(jié)合常數(shù)Ka為3.96×104L/mol。選擇性實驗證實其它的金屬離子對CHB以及CHB與Zn2+作用后的熒光強(qiáng)度影響不大，Job圖分析表明CHB與Zn2+以1∶1的方式配位。