● 陽泉市質量技術監(jiān)督檢驗測試所　余志明

超高效液相色譜儀測定乳粉中三聚氰胺的能力驗證

● 陽泉市質量技術監(jiān)督檢驗測試所余志明

超高效液相色譜儀分析是20世紀60年代中期提出并發(fā)展起來的新型光譜分析技術，它具有超強分離能力、超高分離速度、超高靈敏度、選擇性高、簡單方便的方法轉換等優(yōu)點。

超高效液相色譜儀 三聚氰胺 能力驗證

前言

隨著科學技術的進步，液相色譜用戶對液相色譜技術的要求也不斷提高，他們需要“更快地得到更好的結果”。因此，超高效液相色譜（UltraPerformance LC）概念的提出也就十分自然；簡單的說：UPLC（超高效液相色譜）是用HPLC（高效液相色譜）的極限作為自己的起點，把分離科學推向一個新領域。

超高效液相色譜應用范圍廣泛，主要應用類型為高沸點中分子，高分子有機化合物，離子性無機化合物，熱不穩(wěn)定具有生物活性的生物分子。

三聚氰胺（分子式C3N6H6）是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，具有腎毒性。三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而普通的凱氏定氮法測定乳粉及食品中的蛋白質含量時無法區(qū)分氮元素來源于蛋白分子還是三聚氰胺的氮雜環(huán)，因而一些廠商為了降低成本而添加這種化工原料，以提高產品中蛋白質含量檢測值。因此，才衍生了乳制品中三聚氰胺的檢測方法。三聚氰胺是一種有機化合物，因此采用超高效液相色譜法檢測。

檢驗依據(jù)

參照GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》第一法

檢驗原理

樣品用三氯乙酸溶液和乙腈提取，經陽離子交換固相萃取柱凈化后，用超高效液相色譜儀測定，外標法定量。

相關儀器及試劑

1.儀器和設備

超高效液相色譜儀：美國沃特世Waters Acquity UPLC

檢測器：光電二極管陣列（PDA） ，此檢測器屬于固定波長紫外檢測器

色譜條件：色譜柱Acquity UPLC BEH HⅠLⅠC 1.7μm柱溫35℃

流動相：乙腈-乙酸銨溶液（0.02 mol/L），體積比為97：3

流速：0.5 mL/min

進樣量：2 μL

進樣器為自動進樣器，波長：210 nm。

電子天平：精確度為0.0 001 g，上海精密儀器儀表有限公司

離心機：高速冷凍離心機，最高轉速16 000 r/min

真空過濾裝置：300 mL

具塞塑料離心管：50 mL

超聲波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超聲波儀器有限公司

固相萃取裝置：天津奧特賽恩斯儀器有限公司

氮氣吹干儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司

真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司

漩渦混合器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司

超純水機：重慶摩爾水處理設備有限公司

2.試劑與材料

甲醇：色譜純

乙腈：色譜純

乙酸銨：分析純

氨水：含量為25%～28%

三氯乙酸：分析純

三聚氰胺標準品：CAS108-78-01，純度大于99.0%，來源于中國計量科學研究院

陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL

氮氣：純度≥99.999%

微孔濾膜：0.2μm，有機相、無機相。定性濾紙。

實驗用水為超純水，阻值在18 MΩ以上。

3.試劑的配制

（1）標準溶液的配制（表1）

三聚氰胺標準儲備溶液（濃度為1 mg/mL）：準確稱取100 mg（精確至0.1 mg） 三聚氰胺標準品于100 mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，混勻，即配制成濃度為1 mg/mL的三聚氰胺標準儲備溶液，于4℃避光保存。

三聚氰胺標準工作液：分別吸取三聚氰胺標準儲備溶液（1 mg/mL）0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，放入50 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，相當于濃度為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的三聚氰胺標準工作液，標準工作液經0.2 μm有機相濾膜過濾。

（2）流動相的配制

乙腈：色譜純。

乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水定容至1 000 mL，溶解，經0.2 μm水系濾膜過濾（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

（3）其它試劑的配制

氨化甲醇溶液（5%）：準確量取5 mL氨水和95 mL甲醇，混勻后備用。

三氯乙酸溶液（1%）：準確稱取10 g三氯乙酸于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

甲醇水溶液：準確量取50 mL甲醇和50 mL水，混勻后備用。

陽離子交換固相萃取柱：使用前依次用3 mL甲醇、5 mL水活化。

表1　標準溶液的配制

樣品的處理

稱取樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，用超聲波提取10 min，再振蕩提取10 min后，以10 000 r/min轉速、溫度5℃、離心10 min，離心沉淀后，取上清液經三氯乙酸溶液濕潤的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL超純水混勻后，轉移至固相萃取柱中，依次用3 mL超純水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1 mL /min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干，殘留物用1 mL流動相定容，漩渦混合1 min，經0.2 μm有機相濾膜過濾，供UPLC測定。

空白實驗

除了不稱取樣品外，均按照樣品的處理方式進行前處理。

儀器測定

1.標準曲線的繪制

將濃度為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/ mL、80 μg/mL、100 μg/mL的三聚氰胺標準工作液在選定的色譜條件下濃度由低到高進行檢測分析，以峰面積A對濃度C繪制標準工作曲線。峰面積與濃度呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)r=0.999 743，具體數(shù)值見表2。

表2　標準曲線的數(shù)值

2.樣品檢測

依次將處理好的空白、樣品在與三聚氰胺標準工作液同樣的色譜條件下進行檢測分析，即可得出空白、樣品的濃度值，然后進行結果計算。

3.結果計算

計算公式：已具備乳制品中三聚氰胺的檢測能力。

注意事項

1.流動相使用前要經過脫氣和過濾處理。

2.使用前后都要清洗柱子，以防柱壓升高。

3.三聚氰胺標準工作液配制的準確度直接影響標準工作曲線的線性關系，從而影響樣品的檢測結果。

4.實驗用水為超純水，阻值在18 MΩ以上。

5.三聚氰胺標準儲備溶液要求4℃避光保存，以保證標液的穩(wěn)定性。

6.所有三聚氰胺標準工作液和樣品進儀器前都要經過0.2 μm有機相微孔濾膜過濾。

7.色譜柱Acquity UPLC BEH HⅠLⅠC 1.7 μm在不工作時，要用100%甲醇注滿。

8.整個固相萃取過程流速不超過1 mL /min。

9.三聚氰胺標準工作液要用流動相定容，并用0.2 μm有機相微孔濾膜過濾。

10.乙酸銨溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配?！?/p>

X——樣品中三聚氰胺的含量，單位是毫克每千克（mg/kg）

C——進樣中的三聚氰胺的濃度，單位是微克每毫升（μg/mL）

C0——空白實驗三聚氰胺的濃度，單位是微克每毫升（μg/mL）

m——樣品的質量，單位是克（g）

V1——樣品的定容體積，單位是毫升（mL）

V2——取樣體積，單位是毫升（mL）

V3——稀釋定容體積，單位是毫升（mL）

V1=25 mL V2=5 mL V3=1 mL

檢測結果與結論

經計算，檢測結果為54.91 mg/kg ，在全省實驗室能力驗證的允差范圍內。結論是陽泉市質量技術監(jiān)督檢驗測試所