尤亮亮，魏　巍，劉海燕，王欣璐，曾麗萍，張玲琳，聶遠洋

（1.新希望乳業(yè)控股有限公司技術中心，四川 成都 610016；2.哈爾濱工業(yè)大學化工學院，黑龍江 哈爾濱 150006）

固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質譜測定牛奶中9種性激素殘留

尤亮亮1，魏巍2，劉海燕1，王欣璐1，曾麗萍1，張玲琳1，聶遠洋1

（1.新希望乳業(yè)控股有限公司技術中心，四川 成都 610016；2.哈爾濱工業(yè)大學化工學院，黑龍江 哈爾濱 150006）

采用固相萃取-高效液相色譜質譜聯(lián)用法（SPE-HPLC/MS），建立牛奶中9種性激素（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、諾龍、甲睪酮、丙酸睪酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮）殘留的檢測方法。樣品經甲醇提取，過固相萃取柱凈化，氮氣吹干，殘留物甲醇溶解后測定。其中雌激素（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇）采用負模式；其余性激素為正模式，進行多反應監(jiān)測（MRM）模式定性定量分析。雌激素檢出限（LODs）為1.1～1.2μg/L，定量限（LOQs）為3.63～3.96 μg/L；其余性激素檢出限（LODs）為0.1～0.5 μg/L，定量限（LOQs）為0.33～1.65 μg/L；分別在20.0～500.0 μg/L及2.5～100.0μg/L范圍內線性關系良好（r2＞0.9944）。在50.0～100.0μg/L的添加水平上，9種性激素的平均回收率在82.7%～98.2%之間，變異系數（CV）為4.2%～11.2%。該法操作簡單、靈敏度高，可用于牛奶中9種性激素的測定。

性激素；牛奶；固相萃??；高效液相色譜-質譜法

0　引　言

性激素（sex hormones）是一類由動物體性腺所產生或人工合成的低分子量、親脂性、具有生物活性的類固醇類物質［1］。它是甾體同化激素中最主要組成部分，這些物質具有蛋白質同化作用，通過增強食欲、抑制發(fā)情和提高飼料轉化率，達到大幅度提高動物養(yǎng)殖經濟效益的目的［2］。畜牧業(yè)濫用這些類固醇類激素，導致這些激素殘留最終通過食物鏈進入人體，已成為全球性的食品安全問題［3］。有研究指出激素殘留人體有“三致”作用，主要是導致體內脂肪堆積、兒童性早熟以及自身激素分泌失調，長期攝入可造成內分泌系統(tǒng)相關腫瘤、生長發(fā)育障礙、出生缺陷、生育缺陷及不孕不育等，給人體健康帶來不良影響［4-5］。

關于牛奶中的性激素殘留測定方法有很多，目前國內外最普遍的檢測方法為儀器法和免疫法。儀器分析法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質譜法（LC/MS）［6］、超高效液相-質譜法（UPLC/MS）［7-8］和氣相色譜-質譜法（GC/MS）［9］，隨著酶聯(lián)免疫技術的迅速推廣，被企業(yè)等普遍采用。樣品前處理方式也較多，如固相萃取、分散固相萃取［9］、中空纖維棒液液萃取［10］等。要達到高靈敏度和檢出限，就需要采用液質聯(lián)用的方法；因此，近年來采用液質聯(lián)用法測定牛奶中激素含量成為了研究熱點。調查表明牛乳和初乳中有大量類固醇激素［11］，但目前關于牛奶奶源的激素情況普查較少。本文在這些研究基礎上，選取了固相萃取柱凈化的方法，建立了高效液相色譜-質譜法（HPLC/MS）測定牛奶中常見的9種性激素殘留的方法，并從奶源入手，應用所建立的方法檢測了四川某牧場的原料奶檢測了其性激素殘留狀況。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

標準品（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、諾龍、甲睪酮、丙酸睪酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮）均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于97.5%。甲酸（色譜級），天津市科密歐化學試劑有限公司；氨水（優(yōu)級純），成都市科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈（色譜級），美國Tedia公司；超純水；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

液相色譜儀（Agilent 1260）-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（Agilent 6410）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（500 mg 6 mL）；DIKMA ProElut C18固相萃取柱（500mg 6mL）；Agilent Bond Elut PLEXA固相萃取柱（500mg 6mL）；離心機（蜀科LG10-2.4A）；旋渦混勻器（Ika MS3）；電子天平（龍騰ESJ-200-4B）；12位水浴型氮吹儀（華盛譜信QF-3800）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器KQ-5200E）；旋轉蒸發(fā)器（亞榮生化儀器RE-52AA）。

1.3標準液配制

分別稱取每種性激素標準品10.0mg，用甲醇定容至10mL棕色容量瓶，配制成質量濃度為1000mg/L的母液，于-20℃冰箱避光保存，放置時間不宜超過半年。再用甲醇將其稀釋成質量濃度為1mg/L的中間儲備液。使用時，根據實際操作要求，用甲醇稀釋上述標準儲備溶液，配制成不同濃度的標準工作液。

1.4儀器參數

1.4.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1mm×150mm，5μm），柱溫：40℃，進樣體積：10 μL，流量：0.3 mL/min。按表1和表2進行梯度洗脫。

表1　雌激素梯度洗脫條件1）～2）

表2　其余6種性激素梯度洗脫條件1）～2）

1.4.2質譜條件

多反應監(jiān)測（MRM）模式，電噴霧離子源（ESI）；干燥氣流量：10 mL/min；干燥氣溫度：350℃；霧化器壓力：35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛細管電壓：正模式4000V，負模式3500V；其余質譜參數見表3。

表3　9種性激素質譜MRM采集參數

1.5樣品處理

1.5.1提取

稱取5.0g的牛奶試樣，置于50mL離心管中，加入25mL甲醇，旋渦混勻1 min，超聲振蕩15min，于7000r/min條件下離心15min，將上清液置于雞心瓶中，加入20mL正己烷萃取兩次，去掉正己烷層后于45℃水浴上旋轉蒸干，殘渣用5 mL甲醇和20mL水充分溶解，溶液用于固相萃取。

1.5.2凈化

Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化后，將試樣溶液過柱，再用5 mL水淋洗，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干，加入1mL甲醇，旋渦振蕩1min，過0.22μm濾膜，濾液置于進樣瓶中，待上機進行LC/MS分析。

2　結果與分析

2.1提取液的選擇

常用提取劑有水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等［12-13］，近年來研究以甲醇和乙腈為提取劑效果顯著［14］。本實驗分別對比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯提取后乳化現(xiàn)象比較嚴重，7 000 r/min離心15min后仍無明顯效果；乙腈和甲醇提取的峰面積無顯著差異，綜合考慮到試劑毒性等因素，最終選擇甲醇作為提取液。

2.2流動相的選擇

質譜測定性激素常用流動相為甲醇和水或者乙腈和水，本文中除雌激素外的其他性激素的流動相為甲醇和水，由于甲醇為流動相各激素的響應信號要高于乙腈，故選擇甲醇和水。其中添加甲酸的目的是有利于目標物質的離子化，本文對比了不同體積分數的甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%和0.3%），從各激素的響應值得出最適的甲酸溶液的體積分數。實驗發(fā)現(xiàn)，從0.05%～0.1%時，各激素的響應值逐漸增加，從0.1%～0.3%時，各激素的響應值不斷降低，所以當體積分數為0.1%時，目標化合物的響應值最適。檢測雌激素的流動相為乙腈和水（0.1%的氨水），實驗表明，0.1%氨水有效地提高了雌激素的質譜響應。

2.3固相萃取柱的選擇

本實驗選用固相萃?。⊿PE）方式凈化樣品，實驗中選擇了Waters Oasis HLB、DIKMA ProElut C18及Agilent Bond Elut PLEXA 3種SPE小柱，通過加標回收率來選擇合適的小柱，加標濃度為100μg/L，結果3種固相萃取柱對于9種性激素的加標回收率范圍分別為70.4%～96%，30%～60.2%和34.5%～71.8%。因此，最終選擇Waters Oasis HLB小柱。

2.4加標回收率和檢出限（LODs）線性關系、方法回收率與精密度

按上述處理方法，配制各激素系列的混標溶液，質量濃度為2.5～500μg/L，以定量離子的峰面積為縱坐標，以相對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得出線性回歸方程，相關系數均大于0.9944，表明各激素在質量濃度為2.5～500μg/L范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，如表4所示。

表4　線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限（LODs）和定量限（LOQs）

取牛奶樣品做回收率實驗，在5.0g牛奶中添加不同濃度的混合標準溶液，性激素添加水平為50，100μg/kg，每個添加水平平行檢測6次（n=6）。按上述實驗過程處理后，得出各激素的回收率和變異系數（CV），結果如表5所示。

表5　9種性激素回收率和變異系數（CV）

2.5樣品分析

用建立的方法對四川某牧場隨機采集的牛奶樣品進行檢測，隨機選取健康無抗生素使用、無激素類藥物使用且處在不同泌乳時期的荷斯坦奶牛90頭，每頭牛分別采集50mL，跟蹤采集10頭牛分娩后1～7d的初乳。采集到的牛奶樣品-20℃密封保存，檢測時，解凍即可。檢測結果如表6所示。

表6　牛初乳激素組成及含量的變化（xˉ±SD）

由表6可以看出，牛初乳中激素種類較多，且隨天數的增加有下降趨勢，其中3種內源性激素：17α-雌二醇、雌酮、雌三醇到第3天以后均未檢出，丙酸睪酮第4天后也未檢出。初乳中激素種類較多且含量較高，這主要來源于奶牛的人工授精以及自身妊娠期的分泌。

檢測發(fā)現(xiàn)常乳（共90頭：牛只胎次以1次為主，涵蓋1～4胎次；其中牛只泌乳期涵蓋1～10個月）中含有3種性激素，3種激素分別為醋酸甲羥孕酮、甲睪酮和諾龍。醋酸甲羥孕酮主要集中在泌乳初期的第1個月，其中該激素含量的變化范圍為0.25～1.55μg/kg。甲睪酮主要集中在泌乳初期第1～2月，該激素含量的變化范圍為0.22～3.43 μg/kg。諾龍集中在泌乳初期第1個月，該激素含量變化范圍是0.56～3.74μg/kg。由此可見，牛奶中這3種激素的降解速度較慢。

初乳測定結果與范志影等［15］關于內源性激素的報道一致，雌酮：3220 ng/kg，17α-雌二醇：727ng/kg，雌三醇：167ng/kg。對常乳的報道較少，曹勁松等［16］研究表明常乳中存在一定含量的雌激素，其中雌三醇為9～31pg/mL。目前測定均為市售牛奶樣品，張艷等［17］研究檢測出孕酮及17α-雌二醇，本研究中常乳經檢測并未檢出此類激素。

3　結束語

本實驗建立了固相萃取-液相色譜串聯(lián)質譜法測定牛奶中9種性激素多殘留的方法。其中3種雌激素和其余性激素分別采用不同離子模式均得到較好分離。應用建立的方法對四川某牧場牛初乳以及常乳進行檢測，檢測到3種性激素，并主要存在于泌乳期前2個月，結果表明并未檢測出常見的內源性雌激素，可能是方法檢出限略高的原因［18］。由于牛奶是激素攝入的主要來源之一，因此加強對牛奶中激素的檢測十分必要。經驗證該方法操作簡單、準確度高，可作為牛奶中性激素測定的檢測方法，也可為其他乳制品中性激素的檢測提供方法參考。

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（編輯：徐柳）

Solid-phase extraction followed by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the determination of 9 hormones residues in milk

YOU Liangliang1，WEI Wei2，LIU Haiyan1，WANG Xinlu1，ZENG Liping1，ZHANG Linglin1，NIE Yuanyang1
（1.Technology Center，New Hope Dairy Holdings Co.，Ltd.，Chengdu 610016，China；2.Institute of Chemical Industry，Harbin Institute of Technology，Harbin 150006，China）

A sensitive solid-phase extration/high-performance liquid chromatography-mass spectrometry method was established to determine 9 hormones residues（E1，E3，αE2，NT，MTS，PTS，CMA，MA，MPA）in milk.Milk samples were extracted first and then further purified on a solid-phase extraction column.After that，the purified solution was dried through nitrogen and the residues were dissolved in the mixture of methanol before LC-MS/MS analysis.Negative ion modes were adopted for 3 estrogens（E1，E3，αE2）while positive ion modes for all the other sex hormones. A multiple-reaction monitoring（MRM）mode was used for analysis.For the estrogens，the limits of detection（LODs）ranged from 1.1μg/L to 1.2 μg/L whereas the limits of quantification（LOQs）were between 3.63μg/L and 3.96μg/L.For the other sex hormones，the LODs ranged from 0.1μg/L to 0.5μg/L whilst the LOQs were between 0.33μg/L and 1.65μg/L.Regression equations of these hormones had a good linear relationship（r2greater than 0.9944）within 20.0-500.0μg/L and 2.5-100.0 μg/L.The average recoveries of 9 hormones were from 82.7%to 98.2%with the coefficients of variation（CV）between 4.2%and 11.2%（n=6）at the spiked levels of 50.0-100.0 μg/L.The method is simple，sensitive and therefore can be used to determine the residues of all the 9 hormones in cow milk.

sex hormone；milk；solid-phase extraction（SPE）；high-performance liquid chromatographymass spectrometry（HPLC/MS）

A

1674-5124（2016）05-0046-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.010

2015-12-29；

2016-02-02

國家科技支撐計劃課題（2012BAD12B04）

尤亮亮（1988-），男，黑龍江綏化市人，碩士，主要從事乳品科學方面的研究。

聶遠洋（1986-），男，重慶市人，博士，主要從事乳品微生物方面的研究。