張李云，郭小峰，王 紅*

(1.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072；2.中國科學(xué)院武漢植物園，湖北武漢 430074)

1 引言

小分子巰基化合物(RSH)是生物體內(nèi)主要的還原性物質(zhì)，可清除活性氧和自由基，進(jìn)而維持機(jī)體的氧化還原平衡；生物體內(nèi)的RSH水平通常在某一范圍波動，出現(xiàn)異常時(shí)，將會導(dǎo)致肝損傷、阿爾茨海默病、帕金森病、心血管疾病、腫瘤及人免疫缺陷病毒感染等疾病。因此，檢測生物體內(nèi)RSH的含量、含量變化及實(shí)時(shí)分布對深入研究其生理作用和相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展及診斷治療意義重大。

熒光分析法因其靈敏度高、選擇性好、直觀、可視化等優(yōu)勢，在RSH分析中應(yīng)用廣泛。RSH本身無熒光或熒光很弱，通常需采用熒光試劑對其衍生后再進(jìn)行分析，因而對巰基熒光試劑的研究是RSH熒光分析的重點(diǎn)。在近紅外光區(qū)，生物分子的光吸收小、自發(fā)熒光低、拉曼及瑞利散射幾乎可以忽略，生物樣品中的背景信號較紫外-可見光區(qū)大大降低；同時(shí)，近紅外光激發(fā)輻射能量低且組織穿透力強(qiáng)，對細(xì)胞及生物體的光損傷小，易獲得生物樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息[1,2]。因此，對近紅外巰基熒光試劑的開發(fā)、應(yīng)用與日俱增。

有機(jī)小分子熒光試劑具有純度高、保存簡單、反應(yīng)產(chǎn)物單一、重現(xiàn)性好、生物毒性小、生物相容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，在當(dāng)前生物樣品巰基化合物的熒光分析研究中占主導(dǎo)地位；而熒光團(tuán)是構(gòu)成有機(jī)小分子熒光染料的核心，能實(shí)現(xiàn)近紅外激發(fā)/發(fā)射的熒光團(tuán)主要有花菁、羅丹明及其類似物、方酸和BODIPY四大類。本文將以此分類，就2010年以來近紅外有機(jī)小分子巰基熒光試劑的發(fā)展進(jìn)行詳細(xì)論述。

2 巰基近紅外熒光試劑

2.1 花菁類

19世紀(jì)50年代，Williams首次合成了花菁染料[3]，這是一類含有奇數(shù)碳原子的有機(jī)染料，其母體熒光團(tuán)由雜環(huán)聚甲炔共軛體組成，其中雜環(huán)并不僅限于吲哚環(huán)，還包括喹啉、異喹啉、苯并噻唑及苯并噁唑等?；ㄝ碱惾玖系奈辗寮狻⒛栁庀禂?shù)大。母體每增加一個(gè)亞乙烯基(-CH=CH-，也稱次甲基)，發(fā)射波長將紅移約100 nm；每增加一個(gè)含氮雜環(huán)，發(fā)射波長紅移約20 nm[4]。一般而言，含單個(gè)或三個(gè)次甲基的花菁染料激發(fā)/發(fā)射波長在可見光區(qū)，而五次甲基花菁(Cy5)和七次甲基花菁(Cy7)的激發(fā)/發(fā)射波長則進(jìn)入近紅外光區(qū)。近紅外花菁類染料的設(shè)計(jì)比較簡單，基本遵循上述原則。

花菁染料的熒光量子產(chǎn)率低、光熱穩(wěn)定性差，且隨著聚甲炔鏈的增加容易發(fā)生聚合。為此還可采取以下方法對花菁染料的性質(zhì)進(jìn)行改良：(1)在次甲基鏈上引入剛性氯環(huán)己烯環(huán)，增強(qiáng)花菁染料的穩(wěn)定性并提高其熒光量子產(chǎn)率[5 - 7]；(2)通過一個(gè)或幾個(gè)亞甲基(-CH2-)使兩個(gè)花菁染料相連得到BHmC，降低背景熒光干擾，提高檢測靈敏度[8,9]；(3)改變聚甲炔基兩端的雜環(huán)結(jié)構(gòu)得到非對稱的花菁染料，如DY-681、DY-731和DY-751等，提高熒光量子產(chǎn)率、增加穩(wěn)定性且降低細(xì)胞毒性[10]；(4)通過偶聯(lián)吡咯環(huán)的方式得到并吡咯花菁染料(PPCy)，延長熒光壽命[11 - 13]；(5)在三羰基花菁中引入乙?；铣傻玫揭阴Ｈ驶ㄝ?CyNA)，使穩(wěn)定性增加[14]。另外，還可通過引入羧基(-COOH)和磺酸基(-SO3H)等親水基團(tuán)[15,16]或與樹枝狀化合物結(jié)合制備樹枝狀近紅外熒光材料[17 - 19]，提高試劑的水溶性和生物相容性，以適于生物樣品分析。

2012年，Chen等[20]基于Se-N鍵斷裂的反應(yīng)特性設(shè)計(jì)了近紅外巰基熒光試劑Cy-NiSe和Cy-TfSe(圖1)。由于吸電子基團(tuán)2-硝基苯基硒或3-(三氟甲基)苯基硒對花菁熒光團(tuán)的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)作用，Cy-NiSe和Cy-TfSe的熒光微弱(PBS，pH=7.4)，加入RSH如谷胱甘肽(GSH)后，Se-N鍵斷裂，PET受到抑制，熒光增強(qiáng)(λem=750 nm)。Cy-NiSe和Cy-TfSe對RSH具有選擇性響應(yīng)，可用于細(xì)胞或組織中RSH的實(shí)時(shí)成像分析。

同年，Han等[21]還通過在花菁熒光團(tuán)上引入多巴胺(Dopamine)，構(gòu)建了對RSH和H2O2均有響應(yīng)的“開-關(guān)-開”型近紅外花菁熒光試劑DA-Cy。DA-Cy在755 nm處有強(qiáng)熒光(PBS,Φ=0.13)，與H2O2反應(yīng)后，熒光猝滅，生成無熒光的多巴醌化合物O-DA-Cy(Φ=0.002)，O-DA-Cy與GSH發(fā)生加成反應(yīng)生成GSH-DA-Cy(Φ=0.13)，熒光重現(xiàn)，如圖2A所示。該課題組將DA-Cy用于如人體肝細(xì)胞(HL-7702)等細(xì)胞的共聚焦成像(圖2B)，對細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)(H2O2/RSH)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測；他們還利用該試劑對小鼠海馬組織成像，直觀地展現(xiàn)了H2O2對組織的氧化損傷和RSH對組織的還原修復(fù)(圖2C)。

2013年，Govindaraju等[22]報(bào)道了檢測RSH的“turn-on”兼比色型近紅外熒光試劑2,4-二硝基苯磺?；ㄝ?DNBSCy)(圖3A)。由于2,4-二硝基苯磺?；拟缱饔茫珼NBSCy本身熒光極低，與RSH反應(yīng)后，2,4-二硝基磺酰酯基斷裂產(chǎn)生七次甲基花菁醌(Cy-quinone)，溶液由淺綠色變成藍(lán)色，在476和581 nm波長處產(chǎn)生新的吸收峰，并在波長700 nm處發(fā)射強(qiáng)熒光。DNBSCy已用于監(jiān)測牛血清白蛋白中RSH的含量，并在谷胱甘肽還原酶和NADPH還原酶存在下監(jiān)測[GSSG]/[GSH]的動態(tài)變化(圖3B)。

2014年，Zhang等[23]合成了一個(gè)新的檢測RSH的NIR花菁試劑CyDNS，該試劑最大的特點(diǎn)即含有一個(gè)“氨基甲酸酯”基團(tuán)，因此，2,4-二硝基苯磺酰酯基團(tuán)的“S-O”鍵更易斷裂，與RSH的反應(yīng)速率更快，靈敏度更高；同時(shí)，該試劑具有很好的生物相容性，已被用于細(xì)胞及活體中RSH的動態(tài)監(jiān)測。

2016年，基于一種新的設(shè)計(jì)思路，Lin等[24]合成了對目標(biāo)分析物具有濃度依賴關(guān)系的NIR熒光染料CHMC，該染料通過氯取代的花菁和NIR HD染料反應(yīng)而得(圖4A)。CHMC含有兩個(gè)關(guān)鍵的活性官能團(tuán)：Cl-和-OH，基于此，通過-OH與2,4-二硝基苯磺酸反應(yīng)，得到對RSH不同濃度相應(yīng)的NIR熒光試劑CHMC-thiol(圖4B)：2,4-二硝基苯磺酰酯對RSH的高靈敏相應(yīng)及Cl-基團(tuán)對RSH的低靈敏相應(yīng)。

除了以上檢測RSH總量的近紅外花菁試劑以外，檢測單一RSH的試劑也開始出現(xiàn)。2014年Yang等[25]設(shè)計(jì)合成了選擇性檢測半胱氨酸(Cys)的近紅外花菁試劑Cy-NO2。因p-硝基苯硫酚基團(tuán)的PET作用，Cy-NO2的熒光受到抑制，當(dāng)Cys取代p-硝基苯硫酚基團(tuán)后，熒光生成。由于Cys獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)使其與GSH、Hcy相區(qū)分(圖5A)；該試劑被用于監(jiān)測細(xì)胞中的Cys，Cy-NO2與Cys的反應(yīng)機(jī)理及對HeLa細(xì)胞的熒光成像見圖5B。

2015年，Zhang等[26]報(bào)道了一個(gè)檢測半胱氨酸(Cys)的近紅外花菁熒光試劑CyA(如圖6A)，該試劑能夠?qū)ys特異性地相應(yīng)而不受Hcy和GSH的干擾，反應(yīng)機(jī)理如圖6A所示，丙烯酸酯作為識別-SH的活性基團(tuán)，與其發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，生成不穩(wěn)定的中間體，然后內(nèi)環(huán)化為最終產(chǎn)物2，CyA與Cys的反應(yīng)動力學(xué)速率最高，可對細(xì)胞中的Cys實(shí)時(shí)監(jiān)測(圖6B)。

2.2 羅丹明類

自20世紀(jì)初Dziewonsky等[27]制備羅丹明染料以來，該類染料在染料激光器、生物標(biāo)記等方面得到廣泛應(yīng)用。羅丹明染料的摩爾吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、激發(fā)/發(fā)射波長在500 nm以上，是合成熒光試劑的理想熒光團(tuán)。經(jīng)典的羅丹明染料如羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明19、羅丹明110及羅丹明101等已成為商品化的熒光試劑。為使羅丹明及其衍生物的波長紅移，可在羅丹明染料9-位置處連接上吸電子基-CF2和-CN[28,29]、在其母體熒光環(huán)上融入雜芳環(huán)[30]、用與O原子同一族的S、Se等原子取代羅丹明呫噸環(huán)的O原子[31,32]等。但據(jù)此得到的羅丹明及其衍生物熒光量子產(chǎn)率較低，難以滿足痕量分析的需要。

2008年Qian等[33]首次合成了紅色熒光染料Si-焦寧(TMDHS)，其發(fā)射波長可達(dá)650 nm，熒光量子產(chǎn)率高達(dá)0.39(CH2Cl2)、0.18(H2O)，這是因?yàn)镺原子被Si原子取代后，羅丹明染料的HOMO、LUMO軌道能級改變，能隙差減小、波長紅移。受此啟發(fā)，Nagano等[34,35]以Si等第14族過渡金屬原子取代羅丹明呫噸環(huán)10-位的O原子，合成了一系列含Si的羅丹明衍生物。這些Si-羅丹明染料不僅保留了母體熒光團(tuán)的上述優(yōu)點(diǎn)，而且其激發(fā)/發(fā)射波長紅移至近紅外光區(qū)。

雖然用于RSH檢測的可見光區(qū)羅丹明熒光試劑較多[36]，但近紅外光區(qū)的熒光試劑還鮮有報(bào)道。2012年Nagano等[37]以Te-羅丹明為熒光團(tuán)，合成了近紅外熒光試劑2-Me TeR，該試劑利用Te原子的氧化還原特性對活性氧組分(ROS)進(jìn)行響應(yīng)。2-Me TeR的熒光量子產(chǎn)率小于0.001，受ROS氧化后，生成強(qiáng)熒光物質(zhì)2-Me TeOR，其熒光量子產(chǎn)率約0.18；GSH存在時(shí)，氧化性的2-Me TeOR又被快速還原為2-Me TeR。2-Me TeR、2-Me TeOR可相互轉(zhuǎn)化并反復(fù)可逆地進(jìn)行，因此已用于監(jiān)測過氧化氫刺激人體肝細(xì)胞(HL-60)產(chǎn)生內(nèi)源性的ROS和隨之生成的恢復(fù)細(xì)胞平衡的還原性物質(zhì)如GSH。

2014年Yang等[38]利用呫噸環(huán)的螺環(huán)化，以2-(7-二乙胺基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-)-4-(2-羰酰苯基)-7-二乙胺基-1-苯并吡喃鎓(CB)為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)了檢測Cys/Hcy的比率型近紅外類羅丹明熒光試劑，如圖7所示。該試劑本身具有強(qiáng)熒光(λex/λem=650/694 nm)，與Cys或Hcy反應(yīng)后，Cys或Hcy的氨基使其發(fā)生關(guān)環(huán)內(nèi)酯化，整個(gè)熒光團(tuán)的 “π共軛體系”減小，于λem=474 nm(λex=430 nm)發(fā)射強(qiáng)熒光。

2.3 方酸類

1965年，Treibs等[39,40]首次報(bào)道了方酸染料，它是具有“供體-π-受體- π -供體”穩(wěn)定共振結(jié)構(gòu)的兩性分子，以方酸環(huán)為電子受體、二甲基苯胺為供體。由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，方酸染料在近紅外光區(qū)具有尖而強(qiáng)的吸收峰(ε≥ 105L mol-1cm-1)，在雙光子材料、光電晶體管、太陽能電池、非線性光學(xué)器件、化學(xué)傳感器、生物成像、光動力治療等方面應(yīng)用較多[41,42]。帶有供電子基團(tuán)的芳香環(huán)或雜環(huán)原則上都可作為方酸染料的“供體”，如N,N-二烷基苯胺、苯并噻唑、苯酚、甘藍(lán)菊、吡咯、吲哚、喹諾酮等，方酸染料數(shù)量較多，詳見綜述文獻(xiàn)[43]。由于方酸染料存在穩(wěn)定性差、熒光量子產(chǎn)率低(約0.1)等缺點(diǎn)，Smith等[44 - 48]發(fā)展了改善方酸染料性質(zhì)的新方法，即將方酸染料包裹在含有氨基的大環(huán)中，有效提高了方酸染料的穩(wěn)定性。Beverina等對各類方酸染料包括對稱方酸染料、不對稱方酸染料、大環(huán)包裹的方酸染料、方酸聚合物的合成及應(yīng)用做了詳細(xì)的總結(jié)，具體參見文獻(xiàn)[49]。

方酸自出現(xiàn)以來，其近紅外激發(fā)/發(fā)射的特性使其成為構(gòu)建熒光試劑的理想熒光團(tuán)之一，檢測金屬離子、陰離子、H+、小分子、酶、DNA等不同分析物的近紅外方酸試劑多有報(bào)道，下面僅對近幾年來新合成的方酸巰基試劑及其應(yīng)用展開論述。Wang等[50]合成了含有Hg2+絡(luò)合基團(tuán)二-乙硫基-二-乙胺基的不對稱方酸試劑(圖8)，它與β-環(huán)糊精(β-CD)以摩爾比1∶2的比例結(jié)合形成復(fù)合物，熒光不斷增強(qiáng)；該復(fù)合物與Hg2+反應(yīng)后，熒光猝滅?；趲€基化合物與Hg2+的強(qiáng)相互作用，弱熒光的SQ-Hg2+-β-CD作為一個(gè)整體可高靈敏地響應(yīng)水溶液中含巰基的氨基酸，而不受包括組氨酸在內(nèi)的其它氨基酸干擾。同年，Guang等[51]制備了一種簡單快速分析Cys的比色型方酸試劑，二-N-甲基-N-羥基乙基方酸(圖9)。該試劑在生理?xiàng)l件下與Cys的反應(yīng)僅需6 s即可完成?；谠撛噭┙⒌姆治龇椒ň€性范圍在10～700 nmol/L之間，其檢出限為3.9 nmol/L，可用于合成氨基酸樣品和人血清樣品中Cys的測定。

2013年，Pang等[52]利用鄰苯二甲醛(OPA)和GSH反應(yīng)生成的Isoindole -GSH，與方酸染料SQ1構(gòu)成一個(gè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)體系。Isoindole -GSH在631 nm 和727 nm處分別有兩個(gè)大的吸收峰，而SQ1在630 nm處發(fā)強(qiáng)熒光，兩者光譜重疊，組成了一個(gè)有效的FRET體系。該FRET體系對GSH有很好的特異性響應(yīng)，不受Cys、Hcy及常見氨基酸干擾。

2.4 氟硼熒類

1968年，Treibs等[53]首先合成了氟硼熒(二氟化硼-二吡咯甲烷，BODIPY)染料，但直到上世紀(jì)90年代中期，這類染料的化學(xué)與光學(xué)性質(zhì)才得以彰顯。BODIPY的摩爾吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好，其熒光對溶劑和pH不敏感，母體熒光團(tuán)的激發(fā)/發(fā)射波長為490/505 nm[54 - 56]。BODIPY易于化學(xué)修飾，通過適當(dāng)修飾，其衍生物的激發(fā)/發(fā)射波長可紅移至近紅外光區(qū)。

從2007年以來，關(guān)于BODIPY及其衍生物的合成方法和性質(zhì)研究的報(bào)道層出不窮，參見綜述文獻(xiàn)[54,55,57]。值得一提的是，Shen等[58]從量子化學(xué)角度對BODIPY修飾的可能性及不同方法修飾得到BODIPY衍生物的波長變化規(guī)律做了詳細(xì)的探討。概括而言，使BODIPY衍生物激發(fā)/發(fā)射波長進(jìn)入近紅外光區(qū)的化學(xué)修飾手段有：在BODIPY的3-和(或)5-位引入苯乙烯基[54,59-62]、芳基[63]或炔基[64]等共軛基團(tuán)；合成BODIPY聚合物[65 - 69]；引入構(gòu)象約束或融合的芳香環(huán)[70 - 73]；在BODIPY的meso-位(8)以氮原子取代次甲基[74,75]等。2012年，Jiang等[76]合成了“turn-on”型雜原子BODIPY巰基近紅外熒光試劑。該試劑本身熒光很弱(λem=734,Φ=0.03)，與RSH發(fā)生親核取代反應(yīng)后，2,4-二硝基苯磺酸基團(tuán)(DNBS)從母體熒光團(tuán)脫離，熒光增強(qiáng)，對RSH的檢出限為5.0×10-7mol·L-1。由于該試劑與Cys的反應(yīng)迅速，可選擇性響應(yīng)Cys而不受其它巰基化合物尤其是含量最多的GSH的干擾。

2014年，Zhao等[77]設(shè)計(jì)了meso-位有一甲醛基團(tuán)(-CHO)、可與Hcy或Cys反應(yīng)生成穩(wěn)定的六元環(huán)或五元環(huán)的BODIPY近紅外熒光試劑。在MeCN-H2O(8∶2,V/V)體系中，該試劑的熒光量子產(chǎn)率僅0.06，與Hcy或Cys反應(yīng)后，熒光顯著增強(qiáng)(Hcy:Φf=0.92;Cys:Φf=0.39)。該試劑能快速響應(yīng)Hcy，而與Cys反應(yīng)緩慢；因此可通過控制反應(yīng)時(shí)間，對Hcy進(jìn)行選擇性測定。同年，本課題組以苯乙烯基擴(kuò)大BODIPY母體熒光團(tuán)的共軛體系，并以碘乙酰胺基作為巰基化合物的識別基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了熒光標(biāo)記試劑1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(4′-碘乙酰胺基)-二氟化硼-二吡咯甲烷(DMDSPAB-I，圖10)。該試劑本身具有強(qiáng)熒光(Φ=0.557)，巰基衍生產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率也高達(dá)0.560；兩者的激發(fā)/發(fā)射波長均為620/630 nm。同時(shí)，試劑和衍生產(chǎn)物還具有光穩(wěn)定性好、pH耐受范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。以此為基礎(chǔ)，建立了同時(shí)測定生物樣品中多種巰基化合物的HPLC[78]和CE[79]等分析方法，檢出限分別低至0.24 nmol·L-1和0.11 nmol·L-1。

3 量子點(diǎn)近紅外巰基熒光試劑

量子點(diǎn)(Quantum Dots)又叫納米晶體，它是一種具有表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)的特殊半導(dǎo)體材料，其光電性能優(yōu)異[80,81]：光穩(wěn)定性好、熒光壽命長(30～100 ns)、激發(fā)光譜寬、發(fā)射熒光顏色多變、半峰寬窄、Stokes位移大(>100 nm)、熒光量子產(chǎn)率高。作為光學(xué)材料，適當(dāng)調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的尺寸、形狀或組成，其發(fā)射波長將隨之發(fā)生改變[82,83]。近紅外量子點(diǎn)不僅保留了可見光區(qū)量子點(diǎn)的所有優(yōu)點(diǎn)，而且還具有樣品干擾少、生物基質(zhì)穿透力強(qiáng)等光學(xué)優(yōu)勢。因此，近紅外量子點(diǎn)的研究、開發(fā)逐漸成為熱點(diǎn)。2014年，Veggel等[84]對近紅外熒光量子點(diǎn)的制備、修飾及表征進(jìn)行了總結(jié)闡述。同年，Chen等[85]在概述近紅外量子點(diǎn)的合成及表面修飾的基礎(chǔ)上，著重對其應(yīng)用進(jìn)行了討論，詳細(xì)列舉了此前應(yīng)用于生物成像、熒光檢測、光伏太陽能電池和電致發(fā)光等方面的近紅外量子點(diǎn)。

目前，近紅外量子點(diǎn)多被用于細(xì)胞、組織及生物活體成像，且在腫瘤成像上表現(xiàn)突出[86 - 88]。與此同時(shí)，基于熒光猝滅、熒光增強(qiáng)或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)等機(jī)理，用于離子、小分子、DNA、蛋白質(zhì)和酶等多種分析物檢測的近紅外量子點(diǎn)也有報(bào)道[89 - 92]。盡管如此，檢測巰基化合物的近紅外量子點(diǎn)仍然十分有限。2014年，Wu等[93]通過降低反應(yīng)物中L-半胱氨酸(L-Cys)的比例，在水相快速合成了近紅外CdTe QDs，使之對巰基化合物產(chǎn)生熒光響應(yīng)，并以此構(gòu)建了一種基于表面配體缺失的CdTe近紅外熒光量子點(diǎn)，為生物樣品中的硫醇檢測提供了簡便經(jīng)濟(jì)、高靈敏度和高選擇性的新方法。在其它多種氨基酸和生物液體中主要離子、分子共存的情況下，量子點(diǎn)在L-Cys、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的熒光檢測中顯示了良好的選擇性和靈敏度，檢出限(3s)分別為43、 46 和63 nmol·L-1。以此對血清和細(xì)胞提取液中的硫醇進(jìn)行分析,回收率在90%～109%。

盡管近紅外量子點(diǎn)的應(yīng)用日益增長，但其自身存在的缺陷仍不容忽視[94]。首先，量子點(diǎn)多由重金屬元素組成，雖然采用表面修飾的方式可降低其生物毒性，但對生物體的影響仍不容忽視；其次，納米尺寸的量子點(diǎn)較有機(jī)小分子而言，空間位阻較大，尤其是近紅外量子點(diǎn)，在一定程度上限制了其應(yīng)用。如結(jié)合了抗體的量子點(diǎn)會掩蓋一些識別位點(diǎn)，削弱抗原與抗體之間的親和力，甚至有可能導(dǎo)致抗原與抗體不能結(jié)合等。

5 總結(jié)與展望

近紅外熒光在增加穿透性、降低背景熒光干擾、減少激發(fā)光對生物體損傷等方面具有突出的優(yōu)勢，應(yīng)用越來越廣。本綜述針對“巰基化合物”這一分析對象，詳述了近五年來近紅外巰基熒光試劑的發(fā)展?fàn)顩r。目前，近紅外巰基熒光試劑多用于細(xì)胞、組織等樣品中巰基化合物的生物成像，且有從選擇性較差的總巰基化合物觀測向特異性觀測某個(gè)巰基化合物發(fā)展的趨勢，這為生物體內(nèi)巰基化合物的實(shí)時(shí)檢測提供了有效的工具。然而，某些小分子巰基化合物的特異性熒光探針依然欠缺，如輔酶A、半胱氨酰甘氨酸、谷氨酰半胱氨酸等。此外，近五年報(bào)道的近紅外巰基熒光探針，可與高效液相色譜或毛細(xì)管電泳等分離技術(shù)相結(jié)合的仍然很少，生物樣品中多種巰基化合物低背景同時(shí)準(zhǔn)確定量分析方法選擇余地十分有限，同樣存在較大發(fā)展空間。