郝曄 施麗娟 閆曉榮 趙博昊 朱杰 陳陽 翁巧琴 吳信生

摘要[目的]探索獺兔酪氨酸相關(guān)蛋白1（Tyrp1）基因在毛色形成過程中的分子機(jī)制。[方法]對獺兔Tyrp1基因序列的核苷酸序列、編碼產(chǎn)物的基本理化性質(zhì)等進(jìn)行預(yù)測和分析，同時(shí)利用PCRSSCP（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products）技術(shù)檢測Tyrp1基因CDS序列的多態(tài)性分布狀況。[結(jié)果]信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TYRP1蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白，有信號肽，具有酪氨酸酶家族特征性功能結(jié)構(gòu)域。多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)僅在Tyrp1基因CDS的483 bp處存在1個(gè)C→T的同義突變，位于外顯子2上，該堿基的突變沒有造成氨基酸的改變（AUC→AUT，異亮氨酸）。HardyWeinberg 平衡檢驗(yàn)表明，青紫藍(lán)色獺兔群體處于非平衡狀態(tài)，白色獺兔群體處于平衡狀態(tài)。青紫藍(lán)兔群體為中度多態(tài)信息含量（0.25

關(guān)鍵詞 獺兔；Tyrp1；SNPs；序列分析

中圖分類號 S829.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-164-04

Abstract [Objective] To discuss the molecular mechanism of tyrosinaserelated protein 1 （Tyrp1） gene of Rex rabbit （Oryctolagus cuniculus） during the formation of hair color. [Method] The Tyrp1 gene sequence， the nucleotide sequence， and the basic physical and chemical properties of coding products were forecasted and analyzed. At the same time， PCRSSCP（singlestrand conformational polymorphism）was used to detect the distribution of CDS sequences of Tyrp1. [Result] Bioinformatics analysis found out that Tyrp1 protein was an unstable hydrophilic protein， which had a signal peptide and a functional domain of the tyrosinase family. The polymorphism detection result indicated that the exon 2 of Tyrp1 in 29 bp （the gene CDS 483 bp） had a C→T mutation， and the nucleotide mutation did not lead to the amino acid change （AUC→AUT， isoleucine）. HardyWeinberg equilibrium test showed that the Chinchilla Rex rabbit population was at HardyWeinberg disequilibrium， the white Rex rabbit population was at HardyWeinberg equilibrium. PIC of chinchilla Rex rabbit population was of medium polymorphism （0.25 < PIC < 0.50）， white Rex rabbit population was of low polymorphism （PIC < 0.25）. [Conclusion] Tyrp gene has certain effects on the hair color of Rex rabbit. This research provides certain references for the selection of hair color of Rex rabbit.

Key words Rex rabbit； Tyrp1； SNPs； Sequence analysis

Tyrp1基因是第1個(gè)克隆成功的色素基因，由于該基因編碼的蛋白與酪氨酸酶同源，因此被稱為酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（Tyrosinaserelated protein1，TYRP1）[1]。很多學(xué)者提出了黑色素生物合成的三酶理論，即酪氨酸酶、多巴色素互變酶和5，6二羥基吲哚羧酸氧化酶，它們對黑色素的形成都有十分重要的作用，其中Tyrp1基因編碼的5，6二羥基吲哚羧酸氧化酶是酪氨酸酶重要的協(xié)同因子，與酪氨酸（Tyrosine，TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2（Tyrosinaserelated protein2，TYRP2）一起組成酪氨酸酶相關(guān)蛋白家族[2]。也有研究表明，Tyrp1基因除了直接參與黑色素的生成反應(yīng)外，還可能幫助穩(wěn)定并調(diào)節(jié)酪氨酸酶的催化活性，參與維持黑色素小體的結(jié)構(gòu)，并影響著黑色素細(xì)胞的增殖和凋亡[3-4]。筆者通過PCR技術(shù)擴(kuò)增Tyrp1基因7個(gè)外顯子的序列，對Tyrp1基因氨基酸序列進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，并利用PCR-SSCP技術(shù)和直接測序的方法對每個(gè)外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測，分析Tyrp1基因在不同顏色獺兔（Oryctolagus cuniculus）群體的多態(tài)性，探索其與獺兔毛色形成的關(guān)系，旨在為獺兔毛色的選種選育提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物。

隨機(jī)抽取同批出生、健康的6月齡青紫藍(lán)色獺兔392只、白色獺兔174只，共566只獺兔作為試驗(yàn)對象，試驗(yàn)個(gè)體均來自浙江省余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑。蛋白酶K、10 × TBE、Tris、EDTA、丙烯酰胺等試劑均購自生物（上海）工程有限公司；10%過硫酸銨、TEMED、SDS、甘油、甲醛等試劑均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)。

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的兔Tyrp1基因全序列（登錄號：NC_013669.1），分別在7個(gè)外顯子區(qū)域外的鄰近內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)并合成特異性較好的引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息見表1。

1.1.4 Tyrp1基因序列分析軟件。

利用ExPASy工具對基因編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行分析，利用ProtParam分析蛋白的氨基酸序列組成、相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，利用網(wǎng)上在線工具SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/），分析TYRP1蛋白結(jié)構(gòu)域，并使用 NPS@服務(wù)器上的SCOPMA分析預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用TMPRED（http//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析；運(yùn)用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行氨基酸序列的親水性分析。利用SwissModel（http：//swissmodel.expasy.org/）對TYRP1編碼蛋白進(jìn)行高級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取。

采用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取獺兔耳組織樣基因組DNA，使用TE稀釋到100 ng/μL，使用NanoDrop ND1000核酸濃度測定儀測定DNA濃度，一般OD值的范圍為1.7～1.9，峰圖平滑的樣品可用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：10×PCR Buffer 2 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 pmol/L上、下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA 模板1 μL、ddH2O 12.8 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，適宜的溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min，10 ℃下保存。

1.2.3 PCRSSCP檢測。

在20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液，混合體系在98 ℃變性10 min后，置于-20 ℃冰箱中冷卻5 min，于10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳迅速點(diǎn)樣，先用250 V電泳，10 min后將電壓調(diào)至120 V，電泳12 h。銀染顯色后觀察是否有不同帶型。若有不同帶型出現(xiàn)，將其PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測序，以鑒定堿基突變的類型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 基因頻率和基因型頻率。

基因頻率（Gene frequency）是指群體中某一特定等位基因與其他等位基因的比率；基因型頻率（Genotypic frequency）是指群體中某特定基因型個(gè)體數(shù)占全部個(gè)體數(shù)的比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tyrp1基因各外顯子的擴(kuò)增結(jié)果

對該基因的7個(gè)外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測擴(kuò)增片段大小所用的Marker均為DL 500 Marker。從圖1可以看出，Tyrp1基因各外顯子的條帶特異性均較好，雜帶較少，特異條帶的片段大小與理論值一致。經(jīng)PCRSSCP檢測后，在Tyrp1基因外顯子1、3、4、5、6、7中均未檢測到多態(tài)位點(diǎn)，僅在外顯子2上檢測到2個(gè)等位基因、3種基因型（AA、BB、AB）。

2.2 Tyrp1基因多態(tài)序列分析

使用AlignIR V2.0軟件，將測序得到的DNA序列進(jìn)行對比。從圖2～3可以看出，Tyrp1基因外顯子2在29 bp（整個(gè)基因CDS的483 bp）處有1個(gè)C→T的突變，堿基的突變并沒有造成氨基酸的改變（AUC→AUT，異亮氨酸），為同義突變。

2.3 Tyrp1基因外顯子2的遺傳多樣性分析

白色和青紫藍(lán)色獺兔外顯子2各基因型和基因型頻率經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)，BB基因型頻率在青紫藍(lán)色獺兔中較高，在白色獺兔中較低，表明等位基因B是青紫藍(lán)色獺兔群體中的優(yōu)勢等位基因，而在白色獺兔中等位基因A是優(yōu)勢等位基因。HardyWeinberg 平衡檢驗(yàn)表明，青紫藍(lán)色獺兔群體處于非平衡狀態(tài)，白色獺兔群體處于平衡狀態(tài)。青紫藍(lán)兔群體為中度多態(tài)信息含量（0.25

2.4 Tyrp1基因序列分析

2.4.1 TYRP1氨基酸序列的理化性質(zhì)。

根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫上已發(fā)表的家兔的Tyrp1基因序列可知，家兔的Tyrp1基因位于1號染色體上，全長15 843 bp，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。編碼序列由1 683個(gè)堿基組成，編碼560個(gè)氨基酸殘基，是一個(gè)較為保守的基因。經(jīng)ProtParam在線軟件預(yù)測，分子式為C2802H4268N786O831S30，原子總數(shù)為8 717個(gè)，分子量為63 223.2 kD，理論等電點(diǎn)為6.06。在所有編碼氨基酸中，Leu（L）含量最高，為8.6%，Trp（W）只占1.8%（表3）。帶負(fù)電荷殘基的總數(shù)量（ASP + Glu）為56，帶正電荷殘基的總數(shù)量（Arg+Lys）為47，不穩(wěn)定指數(shù)是52.92，證明這個(gè)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。

從圖4可以看出，TYRP1蛋白疏水性最大值為3.711，最小值為-3.133。TYRP1的主要親水平均數(shù)（GRAVY）值是-0.381，由于 GRAVY 值的范圍介于-2與2之間，其為正值時(shí)表明此蛋白為疏水蛋白，而負(fù)值表明為親水蛋白，因此該蛋白是親水蛋白。同時(shí)，TYRP1氨基酸序列內(nèi)絕大多數(shù)為親水性殘基，表明Tyrp1基因編碼蛋白為水溶性蛋白。

2.4.2 TYRP1氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

通過NPS@服務(wù)器上的SOPMA對TYRP1進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如表4所示。其中，TYRP1蛋白二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，有利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲是TYRP1蛋白最大的結(jié)構(gòu)元件。這表明TYRP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)為混合型。

從圖5可以看出，三級結(jié)構(gòu)序列的相似度達(dá)到84.17%，Evalue值為0，說明模型與提交的預(yù)測蛋白序列匹配性較好。

2.4.3 TYRP1氨基酸序列的功能性結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

利用SMART（Simple Modular Architecture Research Tool，簡單模塊構(gòu)架搜索工具）分析結(jié)果顯示 TYRP1蛋白有3個(gè)功能性片段（圖 6）。紅色區(qū)（1～47）代表信號肽；灰色區(qū)（205～440）代表酪氨酸酶家族特征性區(qū)域；藍(lán)色區(qū)（502～524）代表跨膜區(qū)。

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，Tyrp1基因與動(dòng)物的毛發(fā)顏色和羽色相關(guān)，該基因編碼的5，6二羥基吲哚羧酸氧化酶，是酪氨酸酶重要的協(xié)同因子，在黑色素的形成中具有十分重要的作用。人類Tyrp1基因外顯子6上的1個(gè)堿基缺失，致使開放閱讀框截短，導(dǎo)致TYRP1蛋白喪失活性，使得其對酪氨酸羥化酶的催化作用減弱，引起眼皮膚白化病3（OCA3）[5]。Rieder等[6]研究發(fā)現(xiàn)灰色馬皮膚中Tyrp1基因的表達(dá)量較非灰色馬低，推測Tyrp1基因與馬的隱性灰毛色性狀相關(guān)。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鴨不同羽色中Tyrp1基因的表達(dá)存在差異，黑羽鴨中Tyrp1基因的表達(dá)量為白羽鴨的10 000倍以上。研究表明，Tyrp1基因編碼的TYRP1多巴色素互變異構(gòu)酶（DCT）一起催化多巴醌轉(zhuǎn)化為真黑色素，影響黑色素小體的成和黑色素細(xì)胞的增殖與凋亡，也可直接參與黑色素的生成[8]。

為了揭示Tyrp1基因在毛色形成過程中的作用機(jī)制，筆者獲取了獺兔Tyrp1基因序列，對Tyrp1氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，初步斷定該蛋白為親水不穩(wěn)定蛋白，加上二級結(jié)構(gòu)及模體分析，可以對該蛋白的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行初步推測。筆者對 TYRP1 蛋白氨基酸序列的分析結(jié)果與已有的報(bào)道[9]相吻合，該蛋白為 I 型跨膜糖蛋白，定位在黑色素體的囊膜上，相當(dāng)大部分區(qū)域溶于黑色素體囊內(nèi)的溶膠內(nèi)，單獨(dú)工作不穩(wěn)定，需要通過類表皮生長因子基序等同其他蛋白如酪氨酸酶結(jié)合的方式穩(wěn)定工作，α螺旋和無規(guī)則卷曲是TYRP1蛋白序列最大量的結(jié)構(gòu)元件，散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中；SMART分析顯示了該蛋白的3個(gè)功能性片段，即N端的信號肽，中間相當(dāng)大片段的酪氨酸酶相關(guān)家族特征性結(jié)構(gòu)域及C端的跨膜結(jié)構(gòu)域。

目前，很多國內(nèi)外學(xué)者研究Tyrp1基因的多態(tài)性在毛色形成過程中的作用。李蓓等[10]研究發(fā)現(xiàn)蒙古馬Tyrp1基因外顯子2的1個(gè)錯(cuò)義突變與深色毛色相關(guān)。Rieder 等[11]研究發(fā)現(xiàn)馬Tyrp1基因外顯子2的SNP（C189T）引起蘇氨酸到蛋氨酸的錯(cuò)義突變。Gratten等[12]對黑色和淺色索艾綿羊Tyrp1基因的研究發(fā)現(xiàn)，外顯子4的869 bp處存在錯(cuò)義突變（T869G），淺色索艾羊基因型全為TT，黑色索艾羊基因型為GG或GT，表明該位點(diǎn)的突變與索艾綿羊毛色相關(guān)。徐瑩[13]對3種羽色朝鮮鵪鶉Tyrp1基因PCRSSCP 分析發(fā)現(xiàn)在 Tyrp1基因存在2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（T367C 和C1153T），但是未發(fā)現(xiàn)這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與朝鮮鵪鶉羽色之間存在顯著相關(guān)性。該研究中對Tyrp1的CDS序列的多態(tài)性分布狀況進(jìn)行檢測，檢測了獺兔Tyrp1基因7個(gè)外顯子的多態(tài)性，在其基因外顯子1、3、4、5、6、7中未檢測到多態(tài)位點(diǎn)，僅在外顯子2的29 bp（整個(gè)基因CDS的483 bp）處有1個(gè)C→T的同義突變。遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，青紫藍(lán)獺兔群體的He值高于白色獺兔群體，說明它們具有更為豐富的遺傳多樣性，更好的選擇潛力。多態(tài)信息含量（PIC）是用來衡量基因片段多態(tài)性的重要指標(biāo)，在外顯子2的基因型中，青紫藍(lán)獺兔群體的PIC值介于0.25與0.50之間，外顯子2基因座呈中度多態(tài)，說明該群體對于外顯子2基因型的選擇具有一定的潛力，這些結(jié)果與基因雜合度的研究結(jié)果基本一致。此外，青紫藍(lán)色獺兔群體偏離了哈代-溫格平衡，可以初步斷定該位點(diǎn)的突變有利于真黑色素的合成?；蚣盎蛐驮谌后w中的分布情況也支持該推論，因此Tyrp1基因?qū)ΛH兔的毛色有一定影響。

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