印雙紅 張俊波 羅靜 冉輝 李建新 陸安法 郭飛 陳創(chuàng)夫

摘要[目的]研究阻斷PI3K/Akt信號通路對布魯氏菌介導(dǎo)的細胞凋亡的影響。[方法]用抑制劑LY294002（LY）作用于細胞1 h，然后將布魯氏菌16 M侵染細胞，應(yīng)用實時定量PCR檢測16 M對巨噬細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Caspase3活性和Bax mRNA表達的影響。[結(jié)果]阻斷PI3K/Akt信號通路可顯著提高16 M介導(dǎo)的caspase3活性和Bax mRNA水平。[結(jié)論]PI3K/Akt信號通路可調(diào)控布魯氏菌介導(dǎo)的細胞凋亡。

關(guān)鍵詞 PI3K/Akt信號通路；布魯氏菌；細胞凋亡

中圖分類號 S188+.2 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-162-02

Abstract[Objective]To detect the changes of Brucella mediated apoptosis genes regulated by PI3K/Akt signal pathway.[Method]Inhibitor LY294002（LY） was applied on cells for 1 h.Brucella 16 M was applied to infect the cells.Real time quantitative PCR was used to detect the effects of 16M on macrophage apoptosis related gene Caspase3 activity and Bax mRNA expression.[Result]Blocking PI3K/Akt signal pathway could significantly enhance the Caspase3 activity and Bax mRNA level mediated by 16M.[Conclusion]PI3K/Akt signal pathway can regulate the Brucella mediated apoptosis.

Key words PI3K/Akt signal pathway； Brucella； Apoptosis

布魯氏菌病是一種嚴(yán)重危害人和家畜健康的人獸共患傳染病[1-2]。布魯氏菌為革蘭氏陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌，其急性期的臨床特點主要為惡寒、發(fā)熱、關(guān)節(jié)和肌肉痛等；人感染布魯氏菌后造成骨關(guān)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等損害，慢性期主要癥狀為骨關(guān)節(jié)病及包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)多器官的損害，患者一般會表現(xiàn)出神經(jīng)-精神癥狀，病程較長，容易復(fù)發(fā)并再感染，從而導(dǎo)致勞動力喪失。動物布魯氏菌病的特點是生殖器官、胎膜及其他多種器官組織發(fā)炎、壞死和肉芽腫的形成，引起流產(chǎn)、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀。布魯氏菌病給人類健康和畜牧業(yè)和諧發(fā)展帶來嚴(yán)重危害[3]。因此，研究布魯氏菌及對宿主細胞的致病機制，為布魯氏菌疫苗研發(fā)和和防控提供理論基礎(chǔ)，對于國民經(jīng)濟的發(fā)展和社會的安全具有重大意義。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是重要的細胞生存通路之一，Akt作為PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，在促進細胞生存、生長、增殖，促進細胞運動、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細胞凋亡方面起核心作用[4]。PI3K/Akt信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤組織有Akt的過度表達和活化。PI3K/Akt信號通路還與一些病毒的生存繁殖密切相關(guān)，然而，PI3K/Akt信號通路與布魯氏菌的生存關(guān)系如何，目前尚無相關(guān)報道。筆者研究阻斷PI3K/Akt信號通路對布魯氏菌介導(dǎo)細胞凋亡的影響，有助于揭示布魯氏菌的致病機制，為抗布魯氏菌藥物的研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞與質(zhì)粒。牛種布魯氏菌參考株2308和牛種布魯氏菌疫苗株RB51由石河子大學(xué)人畜共患病實驗室提供，大腸桿菌DH5a由銅仁學(xué)院生物與農(nóng)林工程學(xué)院細胞生物學(xué)實驗室保存。

1.1.2 主要試劑。胎牛血清購自GIBCO公司；酵母提取物（Yeast Extract）、蛋白胨（Tryptone）、NaCl購自O(shè)xoid公司；瓊脂糖購自上海生物工程技術(shù)有限公司；DMSO 購自索萊寶公司；LY 購自碧云天公司；Caspase3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；SYBR染料購于羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7。將16M用PBS洗脫菌體，利用細菌比濁法計算數(shù)量，按比例將菌懸液稀釋10倍，然后將菌懸液涂于固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃、10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每個稀釋濃度重復(fù)3次，取平均值確定布魯氏菌數(shù)目。以50∶1（細菌個數(shù)：細胞個數(shù)）的比例，用16M侵染RAW264.7細胞，并將侵染后的RAW264.7細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 Caspase3活性測定。先用抑制劑LY（20 μmol/L）與巨噬細胞作用1 h，然后將羊種布魯氏菌侵染RAW264.7巨噬細胞，按50∶1（細菌個數(shù)∶細胞個數(shù)）進行侵染細胞，并將侵染的RAW264.7細胞繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗滌3次。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中。4 ℃、1 000 r/min離心5 min收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量無細胞被吸除，PBS洗滌一次。吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。然后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照操作說明，測定其活性。

1.2.3 LY抑制試驗。取對數(shù)生長期細胞，在10% FBS培養(yǎng)基中取2 mL細胞以1×106個/mL密度接種于六孔培養(yǎng)板中。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，加入10、20、40 μmol/L LY，1 h后觀察pAkt（S473）和pAkt（T308）的抑制狀態(tài)。方法是將細胞混懸液立即置入液氮以終止作用，繼以冰凍PBS洗滌細胞3次。細胞收集后，采用1×106個/50 μL RIPA提取總蛋白質(zhì)，BCA法測定總蛋白濃度。

1.2.4 Bax基因引物設(shè)計。從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站GenBank上查找鼠的凋亡相關(guān)基因，設(shè)計引物。引物序列Bax上游5′GCCTTTTTGCTACAGGGTTTC 3′，Bax下游5′TTGCTGTCCAGTTCATCTCCA3′；βactin上游5′GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT3′，βactin下游5′CAGCACTGTGTTGGCATAGA3′。

1.2.5 Bax基因表達檢測。

實時定量PCR反應(yīng)體系20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每組細胞每個時間點的細胞做3個重復(fù)，采用2-ΔΔCt 法對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 阻斷PI3K/Akt信號通路對16M介導(dǎo)caspase3 活性的影響

先用抑制劑與細胞孵育1 h，然后， 用16M侵染細胞4、12和24 h， 用試劑盒分別檢測caspase3的活性。結(jié)果表明，在4、12和24 h，16M+LY組細胞caspase3的活性（OD405）均顯著高于對照組細胞（P<0.05）（圖1）。這表明抑制劑LY可提高16M介導(dǎo)的caspase3 活性，從而誘導(dǎo)16M介導(dǎo)的細胞凋亡，LY可提高16M介導(dǎo)的凋亡主要依賴caspase3的活性。同時，僅抑制劑LY作用于細胞并不改變caspase3的活性，表明抑制劑LY本身不誘導(dǎo)細胞凋亡。

2.2 阻斷PI3K/Akt信號通路對16M介導(dǎo)Bax mRNA表達量的影響

先用抑制劑LY與細胞孵育1 h，然后，用16M侵染細胞4、12和24 h后，Trizol法提取細胞總RNA，實時定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bax的mRNA相對表達量。結(jié)果表明，在4、12和24 h，16M+LY組細胞中Bax的 mRNA相對表達量顯著高于對照組細胞（P<0.01）（圖2）。而16M+LY組細胞中Bax的mRNA相對表達量顯著高于16M組細胞（P<0.01）；在4、12和24 h，16M組細胞和LY組細胞中Bax的mRNA相對表達量與對照組均無顯著差異（P>0.05）。這表明，在4、12和24 h，抑制劑LY提高了16M介導(dǎo)的促凋亡基因Bax的mRNA水平。

3 討論

PI3K/Akt信號通路與很多疾病有關(guān)[5]，在細胞內(nèi)參與調(diào)控物質(zhì)代謝、細胞增殖與存活等生物學(xué)行為。

細胞凋亡是近年來的研究熱點，細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為多種免疫疾病的研究提供了一個新的思路。細胞凋亡是一種由內(nèi)源性多基因控制的、主動的程序化細胞死亡過程。目前，許多細菌（立克次氏體、腦膜炎雙球菌、傷寒沙門菌）在宿主內(nèi)的持續(xù)感染都與細胞凋亡密切相關(guān)[6-8]。Akt是PI3K最主要的靶酶，與多種細胞活動、物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，尤其是與抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、介導(dǎo)細胞周期有密切關(guān)系[9]。LY （PI3 Kinase Inhibitor）是一個高度特異性的抑制劑，可以特異地抑制 PI3 kinase的活性，但不抑制其他脂質(zhì)和蛋白激酶活性。研究表明LY可以抑制 PI3K依賴的Akt磷酸化和激酶活性，它通過和ATP競爭PI3K催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點發(fā)揮作用[10]，從而有效抑制其下游蛋白Akt的磷酸化，已被廣泛應(yīng)用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用及靶向治療的研究。

布魯氏菌在宿主細胞中的復(fù)制和增殖受到多種因素的影響。為了在宿主細胞中復(fù)制和增殖，布魯氏菌通過激活宿主細胞內(nèi)信號通路控制宿主細胞的存活、凋亡和自噬，以逃避宿主免疫應(yīng)答。研究表明，某些病毒為了更加有效地進行復(fù)制，通過激活PI3K/Akt信號通路抑制宿主細胞的早期凋亡、促進細胞自噬和抑制細胞免疫以延長在胞內(nèi)的復(fù)制時間[11-13]，甲型流感病毒的NS1蛋白可與PI3K的p85β亞基結(jié)合而激活PI3K/Akt。但PI3K/Akt是否在布魯氏菌感染中起作用尚未見報道。該研究表明，由于凋亡相關(guān)基因caspase3和Bax的表達都發(fā)生變化，且這2個凋亡基因都屬于線粒體通路上的關(guān)鍵分子，因此，該研究推測PI3K/Akt信號通路主要通過線粒體通路發(fā)揮調(diào)控布魯氏菌16M介導(dǎo)的細胞凋亡，其具體機制還有待于進一步探索。

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