王艷秋 劉向前

摘要[目的]建立四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的含量測(cè)定方法。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）～0.1% H3PO4溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～5 min，25%A；5～7 min，25%～90% A；7～15 min，90%A；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm。[結(jié)果]鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的線性范圍分別為0.25～2.50和0.32～3.20 μg，平均回收率分別為97.5%和96.8%，RSD分別為2.6%和2.8%。[結(jié)論]該方法準(zhǔn)確、可靠，可作為四妙丸的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞 四妙丸；鹽酸小檗堿；蒼術(shù)素；含量測(cè)定

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）09-157-03

Abstract[Objective]To establish a method for the content determination of berberine hydrochloride and atractylodin in Simiao pills.[Method]The HPLC method was adopted with Promosil C18 chromatography column（250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile （A）-0.1% H3PO4 solution （B） with gradient eluent， the elution program was 0-5 min， 25% A； 5-7 min， 25%-90% A； 7-15 min， 90% A. The detection wavelength was 340 nm.[Result]The linear ranges of berberine hydrochloride and atractylodin were 0.25-2.5 and 0.32-3.2 μg， respectively. The average recovery rates of the two components in Simiao pills were 97.5% and 96.8%， while RSD were 2.6% and 2.8%， respectively.[Conclusion]The method is accurate and reliable for the quality control of Simiao pills.

Key words Simiao pill； Berberine hydrochloride； Atractylodin； Content determination

四妙丸由蒼術(shù)、鹽黃柏、牛膝、薏苡仁四味中藥組成，是在二妙丸基礎(chǔ)上加味牛膝以及薏苡仁而來(lái)，方中黃柏作為君藥，行使清熱燥濕之功；蒼術(shù)輔助以燥濕健脾之效，為臣藥；牛膝的功效為補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)化筋骨、活血兼舒絡(luò)，并可引藥下行，作為輔藥，同時(shí)行使佐使藥之功；薏仁健脾祛濕、利水消腫，為佐藥；諸藥相輔相成，標(biāo)本皆可兼治[1]。四妙丸是治療下焦?jié)駸帷⒆阆ゼt腫熱痛之良方，經(jīng)過(guò)歷代醫(yī)家的臨床實(shí)踐及推演，再加上當(dāng)代醫(yī)學(xué)藥理學(xué)的試驗(yàn)研究，其應(yīng)用范圍已經(jīng)更加廣泛，是許多濕熱體質(zhì)患者的首選方劑[2-4]。

方中君藥黃柏中的主要成分為鹽酸小檗堿，臣藥蒼術(shù)的主要有效成分為蒼術(shù)素，測(cè)定二妙丸、三妙丸、四妙丸中鹽酸小檗堿含量的方法最常用的是高效液相色譜法[5-6]，用毛細(xì)管氣相色譜測(cè)定這3種復(fù)方中蒼術(shù)素含量[7]。該研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的含量，為四妙丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1100 series HPLC儀（真空脫氣機(jī)、柱溫箱、四元泵、VWD）（美國(guó)安捷倫公司）；UV3010型紫外分光光度儀（日本日立公司）；CP225D型十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)SARTORIUS公司）。

1.2 試材

四妙丸為自制，藥材均采購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授進(jìn)行鑒定，各藥材均符合藥典規(guī)定；對(duì)照品鹽酸小檗堿（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110713-200911）、蒼術(shù)素（上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，批號(hào)17-2001）；乙腈、甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。分別取蒼術(shù)素、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，在200～400 nm進(jìn)行掃描，鹽酸小檗堿的最大吸收波長(zhǎng)為265和349 nm，蒼術(shù)素在340 nm處有較大吸收，因此選擇340 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.2 色譜條件。Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）～0.1%H3PO4溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～5 min，25%A；5～7 min，25%～90%A；7～15 min，90%A；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 供試品溶液制備方法考察。按四妙丸處方比例取黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、牛膝四味藥材，粉碎過(guò)40目篩，備用。

1.3.3.1 提取方法的考察。按處方比例，分別精密稱取藥材粉末3份，每份1 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加入甲醇30 mL，稱重。分別考察加熱回流2 h、超聲提取30 min、索氏提取4 h這3種提取方式的提取效果，提取后放冷，并用甲醇補(bǔ)足重量，混合均勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素峰面積，計(jì)算其含量。

1.3.3.2 提取溶媒的考察。按處方比例，精密稱取藥材粉末4份，每份1 g，置50 mL圓底燒瓶中，分別精密加入30 mL甲醇、95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇，加熱回流2 h，提取后放冷，用相應(yīng)的提取溶媒補(bǔ)足重量，混勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素峰面積，計(jì)算其含量。

1.3.3.3 溶媒用量的考察。精密稱取藥材粉末3份，每份1 g，置250 mL圓底燒瓶中，分別精密加入75%乙醇50、100、150 mL，稱重，加熱回流2 h，提取后放冷，用溶媒補(bǔ)足重量，混勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素峰面積，計(jì)算其含量。

1.3.3.4 提取時(shí)間的考察。精密稱取藥材粉末3份，每份1 g，置250 mL圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，稱重，分別加熱回流0.5、1.0、2.0 h，提取后放冷，用溶媒補(bǔ)足重量，混勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素峰面積，計(jì)算其含量。

1.3.4 對(duì)照品溶液的制備。精密稱取鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇分別配制成濃度為1.00和0.64 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液12.5 mL、蒼術(shù)素對(duì)照品儲(chǔ)備液25 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照品混合溶液（鹽酸小檗堿濃度250 μg/mL，蒼術(shù)素濃度320 μg/mL），避光保存。精密量取鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，作為混合系列對(duì)照品溶液。

1.3.5 陰性樣品溶液的制備。按照藥典所載處方比例，分別制備無(wú)黃柏、蒼術(shù)的陰性樣品，按“1.3.3”方法制備陰性樣品溶液。

1.3.6 方法學(xué)考察。

1.3.6.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。取樣品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“1.3.2”色譜條件測(cè)定，繪制HPLC圖譜[10]，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.3.6.2 線性關(guān)系考察。取“1.3.4”系列混合對(duì)照品溶液，其中鹽酸小檗堿濃度分別為12.50、25.00、50.00、75.00、100.00、125.00 μg/mL，蒼術(shù)素濃度分別為16.00、32.00、64.00、96.00、128.00、160.00 μg/mL，分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液各20 μL，進(jìn)樣，按“1.3.2”色譜條件分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.3 精密度試驗(yàn)。精密吸取中間濃度（鹽酸小檗堿濃度75.00 μg/mL，蒼術(shù)素含量96.00 μg/mL）混合對(duì)照品溶液20 μL，按照“1.3.2”色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的峰面積。

1.3.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，通過(guò)HPLC分析并分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.3.6.5 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批樣品共6份，每份1 g，精密稱定，其余按“1.3.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的含量和RSD。

1.3.6.6 加樣回收率試驗(yàn)。取已知含量（鹽酸小檗堿6.26 mg/gL、蒼術(shù)素5.31 mg/g）的樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液4 mL（濃度為1.00 mg/mL）和蒼術(shù)素對(duì)照品溶液4 mL（濃度為0.64 mg/mL），按“1.3.3”制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算樣品的回收率和RSD。

1.3.7 樣品的含量測(cè)定。按“1.3.1”～“1.3.6.1”方法測(cè)定3個(gè)批次四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品溶液制備方法

2.1.1 提取方法的考察。從表1可以看出，采用加熱回流提取法進(jìn)行提取得到的2種成分含量較高，故該試驗(yàn)供試品的制備方法確定為加熱回流提取法。

2.1.2 提取溶媒的考察。從表2可以看出，采用甲醇提取蒼術(shù)素和鹽酸小檗堿含量最高，但液相圖譜中干擾色譜峰較多，而75%乙醇提取二者含量與甲醇提取相似，且干擾較少，故選擇75%乙醇為提取溶媒。

2.1.3 溶媒用量的考察。從表3可以看出，加溶媒量100和150 mL的這2種成分含量明顯高于加入50 mL，而加入100 mL與加入150 mL溶媒的二者含量變化不大，故選擇加入100 mL的75%乙醇提取。

2.1.4 提取時(shí)間的考察。由表4可見，提取1 h樣品已經(jīng)基本提取完全，增加時(shí)間二者含量變化不明顯，故選擇加熱回流時(shí)間為1 h。

綜上所述，確定供試品溶液的制備方法為：取四妙丸粉末1.0 g，精密稱定，加75%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得，避光保存。

2.2 方法學(xué)考察。

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1表明，蒼術(shù)素和鹽酸小檗堿

色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求，說(shuō)明蒼術(shù)素和鹽酸小檗堿與其他組分完全分離，陰性樣品溶液在鹽酸小檗堿與蒼術(shù)素的峰位置處無(wú)干擾。

2.2.2 線性關(guān)系考察。按“1.3.6.2”方法操作，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出蒼術(shù)素和鹽酸小檗堿的回歸方程分別為y=3.857× 104x-1.273×104（r=0.999 9）、y=1.763 66×105x-2.719 73×105（r=0.999 3），說(shuō)明鹽酸小檗堿、蒼術(shù)素分別在0.25～2.50、0.32～3.20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn)。按“1.3.6.3”方法操作，計(jì)算得出鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的峰面積的RSD均小于3.0%，符合有關(guān)規(guī)定，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.3.6.4”方法操作，計(jì)算得出鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的峰面積的RSD值均小于3.0%，符合有關(guān)規(guī)定，表明鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.3.6.5”方法操作，計(jì)算得鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的含量的平均值分別為6.26和5.31 mg/g，二者的RSD均小于3.0%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn)。按“1.3.6.6”方法操作，計(jì)算鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的平均回收率分別為97.5%和96.8%，RSD分別為2.6%和2.8%，符合有關(guān)規(guī)定。表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的含量測(cè)定。

2.3 含量測(cè)定

由表5可知，不同批號(hào)四妙丸中鹽酸小檗堿含量接近，蒼術(shù)素的含量也差別不大。

3 討論和結(jié)論

（1）四妙丸為二妙丸類方，以往文獻(xiàn)關(guān)于方中蒼術(shù)的含量測(cè)定多以茅術(shù)醇和β桉葉油醇為對(duì)照品，該研究采用2010版《中國(guó)藥典》中蒼術(shù)項(xiàng)下收載的對(duì)照品蒼術(shù)素作為指標(biāo)性成分建立含量測(cè)定方法，這為更好地控制四妙丸的質(zhì)量提供了基礎(chǔ)[8]。

（2）試驗(yàn)中流動(dòng)相的選擇曾嘗試用甲醇-磷酸系統(tǒng)、乙腈-甲酸系統(tǒng)等，經(jīng)反復(fù)摸索最終確定乙腈～0.1% H3PO4溶液梯度洗脫，并確定了最佳洗脫程序。

（3）蒼術(shù)素為聚乙烯炔類成分，對(duì)光不穩(wěn)定，試驗(yàn)過(guò)程中供試品和對(duì)照品溶液均應(yīng)放在棕色瓶中避光保存[9]。

（4）該研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的含量，結(jié)果表明，鹽酸小檗堿和蒼術(shù)素的線性范圍分別為0.25～2.50和0.32～3.20 μg，平均回收率分別為97.5%和96.8%，RSD分別為2.6%和2.8%。該方法準(zhǔn)確、可靠，可作為四妙丸的質(zhì)量控制方法。

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