莫秋燕，宋元達(dá)

(江南大學(xué)食品學(xué)院食品與健康研究中心，江蘇無(wú)錫 214122)

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過(guò)表達(dá)根瘤血紅蛋白基因?qū)钴S鏈霉菌那西肽產(chǎn)量的影響

莫秋燕，宋元達(dá)*

(江南大學(xué)食品學(xué)院食品與健康研究中心，江蘇無(wú)錫 214122)

[目的]采用過(guò)表達(dá)根瘤血紅蛋白基因改善活躍鏈霉菌的溶氧表達(dá)，以提高那西肽的產(chǎn)量。[方法]通過(guò)全基因組合成的方法得到根瘤菌血紅蛋白基因(sm)，連接到整合型質(zhì)粒pIB139上，構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-sm。通過(guò)大腸桿菌-鏈霉菌結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將sm基因整合到活躍鏈霉菌基因組上，通過(guò)PCR驗(yàn)證各轉(zhuǎn)化子目的片段已整合到活躍鏈霉菌基因組上，并進(jìn)行大量篩選得到重組菌株。[結(jié)果]經(jīng)SDS-PAGE和CO結(jié)合差示光譜分析，結(jié)果顯示，目的蛋白均已成功表達(dá)且具有相應(yīng)的蛋白活性。搖瓶培養(yǎng)結(jié)果顯示，SmfHb表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)和那西肽產(chǎn)量有明顯的促進(jìn)作用，過(guò)表達(dá)SmfHb的重組菌株那西肽產(chǎn)量達(dá)1 245.7 μg/mL，比原始菌株提高39.6%。[結(jié)論]過(guò)表達(dá)sm基因提高那西肽產(chǎn)量的作用優(yōu)于vhb。

根瘤菌血紅蛋白；活躍鏈霉菌；那西肽

那西肽是一種新型的動(dòng)物飼料添加劑，對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑菌作用[1]，能增加動(dòng)物的抗病能力，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[2-3]，提高飼料利用率，此外還具有水溶性差、在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)殘留的特點(diǎn)[4-6]。那西肽的主要產(chǎn)生菌為活躍鏈霉菌(Streptomycesactuosus)，其在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程常因菌絲內(nèi)的結(jié)球造成溶氧不足甚至發(fā)生自溶，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量的降低[7]。

細(xì)菌血紅蛋白屬于一類(lèi)特殊的血紅蛋白類(lèi)似蛋白。研究表明，細(xì)菌血紅蛋白參與改善氧在細(xì)菌體內(nèi)的輸送，以支持細(xì)胞在低氧環(huán)境下進(jìn)行有氧代謝[8-11]。根瘤菌血紅蛋白(SmfHb)是一種新發(fā)現(xiàn)的黃素血紅蛋白[12]。目前對(duì)根瘤菌血紅蛋白的研究較少，但研究表明在變鉛青鏈霉菌中表達(dá)SmfHb能有效地提高其次生代謝產(chǎn)物放線紫紅素的產(chǎn)量[13]。筆者構(gòu)建表達(dá)SmfHb基因的工程菌株，以透明顫菌血紅蛋白(VHb)的表達(dá)作為對(duì)照，用過(guò)SmfHb的表達(dá)改善活躍鏈霉菌的溶氧環(huán)境，以期提高那西肽的產(chǎn)量，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：葡萄糖 4 g/L，麥芽糖1.3 g/L，酵母4 g/L，KNO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，微量元素A 10 mL/L，CaCO30.1 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 6.8～7.0。種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，玉米淀粉30 g/L，牛肉膏3 g/L，(NH4)2SO43 g/L，MnSO40.5g/L，pH 6.8～7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉80 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物5 g/L，CaCO34 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MnSO40.5 g/L，KNO30.5 g/L，pH 6.8～7.0。

1.1.2儀器。EL3002型電子天平、EL204型分析天平、pH計(jì)購(gòu)自METTER TOLE DO,PCR儀(T100 Thermal Cycler)、Power pac核酸電泳儀、Geldoc 2000凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad；Nano Drop 2000分光光度計(jì)、Legend Micro17型離心機(jī)、Legend Micro 21R型冷凍離心機(jī)、ST40R型冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司；漩渦振蕩器、磁力攪拌器購(gòu)自IKA；真空冷凍干燥機(jī)購(gòu)自LABCONCO；UV-VIS液相色譜儀購(gòu)自島津公司。

1.1.3菌株、質(zhì)粒與引物。活躍鏈霉菌(Streptomycesactuosus)、E.colitop10、E.coliET12567(pUZ8002)、質(zhì)粒pIB139。試驗(yàn)所用引物vhb-F：GTCCCATATGATGTTAGACCAGCAAACCAT，vhb-R：GTCCTCTAGATTATTCAACCGCTTGAG CGT；sm-F：GTCCCATATGATGCTCACTCAGAAGACCAAGG，sm-R：GTCCTCTAGATCACTCGGCAAACAGATCGG。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pIB139-sm的構(gòu)建。根據(jù)NCBI中公布的sm和vhb核苷酸序列，采用全基因合成的方法得到基因sm，將合成的基因連入過(guò)度載體pUC57中，并進(jìn)行測(cè)序基因驗(yàn)證。將質(zhì)粒pIB139以XbaⅠ和NdeⅠ進(jìn)行雙酶切，純化后，與基因sm片段連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中，在含有安普霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒pIB139-sm。

1.2.2結(jié)合轉(zhuǎn)移及驗(yàn)證。吸取E.coliET12567(pUZ8002，pIB139-sm/pIB139-vhb)10 μL接種至5 mL LB(試管培養(yǎng)，加入25 ng/mL氯霉素，50 ng/mL卡那霉素，30 ng/mL安普霉素)中，37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。第2天按1∶100的比例接種至10 mL LB中，加入25 ng/mL氯霉素、50 ng/mL卡那霉素、30 ng/mL安普霉素，37 ℃培養(yǎng)至OD為0.4左右。收集菌體于4 ℃、5 000 r/min離心4 min，用預(yù)冷的10 mL LB洗滌2次，并用1 mL LB重懸，待用。

向產(chǎn)孢子的茄子瓶中加入6 mL滅菌蒸餾水，用接種環(huán)將孢子全部刮下，并將孢子懸液全部轉(zhuǎn)移至50 mL滅菌離心管，重復(fù)2次。將收集的全部孢子懸液充分振蕩，使孢子分散，經(jīng)過(guò)一層紗布過(guò)濾，離心，去掉上清，將孢子(108個(gè)/mL)重懸于500 μL 2×YT培養(yǎng)基中，50 ℃水浴10 min刺激孢子萌發(fā)，室溫自然冷卻。

將500 μL大腸桿菌懸液和500 μL鏈霉菌孢子懸液充分混合，每50 μL涂一塊MS平板，總共20塊，置于28 ℃培養(yǎng)18 h。將1 mL萘啶酮酸(25 μg/mL)和1 mL安普霉素(30 μg/mL)加入18 mL滅菌蒸餾水中，每個(gè)平板加入1 mL溶液，重新鋪板，使得液體覆蓋整個(gè)平板，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 d直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.2.3轉(zhuǎn)化子的篩選驗(yàn)證。隨機(jī)挑取選擇性平板上長(zhǎng)出的單菌落菌絲于新的MS平板傳代3次，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性。穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子菌絲在斜面培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5～7 d后收取孢子，調(diào)整孢子濃度為1×108個(gè)/mL，-20 ℃保存于20%甘油管中。保菌后將剩余菌體用接種棒收集并離心分離得到，并提取鏈霉菌基因組，以此為模板，以vhb-F/vhb-R和sm-F/sm-R為引物，PCR驗(yàn)證目的片段是否整合到基因組中。

1.2.4高效液相法檢測(cè)那西肽產(chǎn)量。色譜條件為色譜柱：Waters symmetry C18column，流速：乙腈-0.025%磷酸溶液(52/48)，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5轉(zhuǎn)化子的篩選驗(yàn)證。隨機(jī)挑取選擇性平板上長(zhǎng)出的單菌落菌絲于新的MS平板連續(xù)傳代3次，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性。穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子菌絲涂布于斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d后收取孢子，調(diào)整孢子濃度為1×108個(gè)/mL，-20 ℃保存于20%甘油管中。用接種棒收集剩余菌體用布氏漏斗真空抽濾分離，并以活躍鏈霉菌總DNA為模板，分別以sm-F/sm-R和vhb-F/vhb-R為引物，PCR驗(yàn)證目的片段是否整合到基因組中。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件基本相同，其中，退火溫度為58 ℃，延伸時(shí)間為2 min，取PCR產(chǎn)物2 μL進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6CO結(jié)合差示光譜。5 000 r/min離心10 min收集活躍鏈霉菌發(fā)酵液的菌絲體(如果菌絲體結(jié)團(tuán)，可將菌絲體用玻璃勻漿器研磨破碎菌體小球)，用蒸餾水離心洗滌數(shù)次，沉淀懸浮于10 mL pH 7.8磷酸緩沖液，將懸浮液置于冰上，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)超聲破碎30次(超聲處理10 s，停20 s，冰浴放置2 min，然后重復(fù)操作)。取樣在顯微鏡下觀察直至絲狀菌絲體消失、細(xì)胞碎片聚團(tuán)即可(如果菌絲體破碎效率低，可采取反復(fù)凍融結(jié)合超聲破碎處理)。將超聲破碎液體于5 000 r/min離心5 min，去除細(xì)胞碎片。取上層裂解液5 mL，分別加入少量連二亞硫酸鈉。

通入CO氣體10 min，以出發(fā)菌菌體破碎后的上層裂解液做參比，用分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定OD。

1.2.7活躍鏈霉菌生物量的測(cè)定。用10 mL移液管吸取發(fā)酵液10 mL，1 000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀用10 mL蒸餾水洗滌3遍后冷凍干燥，將得到的干菌體稱(chēng)重，1 L發(fā)酵液中干菌體的重量即為菌體生物量。

2　結(jié)果與分析

2.1重組活躍鏈霉菌的PCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒pIB139-sm通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化活躍鏈霉菌，挑取9個(gè)單菌落穿斜面，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。同時(shí)，將空質(zhì)粒pIB139轉(zhuǎn)入活躍鏈霉菌中作為對(duì)照菌株。PCR驗(yàn)證圖譜見(jiàn)圖1，由圖1可知，除泳道第1、5外其余均擴(kuò)增出大小約為1 000 bp的片段，為S.actuosus/pIB139-sm陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，說(shuō)明成功構(gòu)建重組菌株。且導(dǎo)入空質(zhì)粒的對(duì)照菌株能在安普霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明對(duì)照菌株已成功構(gòu)建。

注：M.DNA Marker；1～9：S.actuosus/pIB139-sm轉(zhuǎn)化子；10.對(duì)照菌株。Note：M.DNA Marker；1-9.S.actuosus/pIB139-sm transformant；10.Control strains.圖1　重組菌株S.actuosus/pIB139-sm的PCR驗(yàn)證Fig.1　Confirmation of strain S.actuosus/pIB139-sm by PCR

2.2轉(zhuǎn)化子的篩選經(jīng)2輪篩選后，選取整合sm基因的重組鏈霉菌轉(zhuǎn)化子各10株分別標(biāo)記為S1～S10。將所選轉(zhuǎn)化子傳斜面后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液HPLC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，大多數(shù)重組轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵效價(jià)升高，有約30%的菌株發(fā)酵效價(jià)與原始菌株的產(chǎn)量下降，各個(gè)轉(zhuǎn)化子之間那西肽產(chǎn)量差距較大。其原因：在接合轉(zhuǎn)移的熱激活過(guò)程、萌發(fā)過(guò)程以及多次的洗滌過(guò)程中對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生較為嚴(yán)重的損傷；質(zhì)粒上的整合位點(diǎn)是隨機(jī)的，這可能導(dǎo)致質(zhì)粒整合使得菌體的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成受到影響。過(guò)表達(dá)vhb基因的鏈霉菌重組轉(zhuǎn)化子中有6株那西肽產(chǎn)量有所提高，其中，菌株V7增加明顯，可達(dá)127.4%。過(guò)表達(dá)根瘤菌血紅蛋白基因(sm)的鏈霉菌重組轉(zhuǎn)化子中有7株產(chǎn)量增加，其中，菌株S5那西肽產(chǎn)量是原菌株的132.1%。各個(gè)轉(zhuǎn)化子在連續(xù)傳代3次后，綜合考慮那西肽產(chǎn)量及菌株穩(wěn)定性，選取轉(zhuǎn)化子V7、S5用于后續(xù)研究，并命名為MG-1、MG-2。

2.3重組菌株蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析將原始菌株及重組菌株S.actuosus/pIB139-vhb、S.actuosus/pIB139-sm在培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，離心收集菌體并用液氮破碎細(xì)胞，制備蛋白電泳樣品，每個(gè)泳道中上樣的蛋白含量相同。

表1　重組菌株轉(zhuǎn)化子篩選

透明顫菌血紅蛋白(VHb)和根瘤菌紅血蛋白(SmfHb)的理論分子量大小分別為15.724和44.673 ku。由圖2可知，目的蛋白均有表達(dá)且大小與理論值相符，而對(duì)照菌株未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的條帶。

圖2　重組活躍鏈霉菌蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.2　Protein expression of reconbinant S.actuosus

2.4重組菌株中細(xì)菌血紅蛋白活性分析SmfHb和VHb的蛋白活性采用一氧化碳結(jié)合差示光譜分析，CO與還原態(tài)的血紅蛋白結(jié)合后，在420 nm處有最大吸收值。將重組活躍鏈霉菌細(xì)胞破碎液的50%通入CO，以未通CO的破碎液為對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)在400～500 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌株在420 nm處有特征吸收峰，而對(duì)照菌株在此處未出現(xiàn)此吸收峰，表明sm和vhb基因已在活躍鏈霉菌中表達(dá)出有生物活性的SmfHb和VHb蛋白(圖3)。

圖3　活躍鏈霉菌細(xì)胞提取液的CO結(jié)合差示光譜Fig.3　CO binding difference spectrum of cell extracts from S.actuosus

2.5重組鏈霉菌的生長(zhǎng)及那西肽產(chǎn)量的分析重組菌株構(gòu)建成功后，在250 mL搖瓶中對(duì)原始菌株(WT)、對(duì)照菌株(CON)和重組菌株MG-1、MG-2于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)7 d，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，SmfHb和VHb均對(duì)菌體的生長(zhǎng)和那西肽的產(chǎn)量有明顯的促進(jìn)作用，其中，過(guò)表達(dá)SmfHb的重組菌株MG-2那西肽產(chǎn)量達(dá)1 245.7 μg/mL，比原始菌株提高39.6%。雖然過(guò)表達(dá)VHb的重組菌株MG-1的生物量高于MG-2，但其那西肽產(chǎn)量卻略低于MG-2，且菌株MG-2單位質(zhì)量那西肽的產(chǎn)量達(dá)303.8 μg/mg，比原始菌株提高32.8%，而MG-1僅比原始菌株高2%。由此可知，VHb是通過(guò)提高活躍鏈霉菌的生物量來(lái)增加那西肽的產(chǎn)量，從而提高單位質(zhì)量那西肽的產(chǎn)量。

導(dǎo)入空質(zhì)粒pIB139的對(duì)照菌株的那西肽產(chǎn)量與出發(fā)菌株無(wú)明顯差別，說(shuō)明空質(zhì)粒pIB139本身并不會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)量產(chǎn)生影響，故可在后期試驗(yàn)中排除質(zhì)粒pIB139對(duì)那西肽產(chǎn)量的影響。

圖4　重組菌株搖瓶培養(yǎng)的生物量(A)、那西肽產(chǎn)量(B)和生物量(C) Fig.4　Biomass(A)，nosiheptideyield(B)andnosiheptide/biomass(C)inrecombinantstrainsundershake-flaskculture

3　結(jié)論

該試驗(yàn)通過(guò)在活躍鏈霉菌中過(guò)表達(dá)vhb和sm細(xì)菌血紅蛋白基因，分別得到vhb、sm過(guò)表達(dá)菌株MG-1、MG-2以改善其在發(fā)酵過(guò)程中溶氧不足的問(wèn)題。過(guò)表達(dá)sm基因的重組菌株MG-2的那西肽產(chǎn)量達(dá)1 245.7 μg/mL，比原始菌株提高39.6%。雖然過(guò)表達(dá)vhb的重組菌株MG-1的生物量高于MG-2，但MG-1的那西肽產(chǎn)量略低于MG-2，且菌株MG-2單位質(zhì)量那西肽的產(chǎn)量達(dá)303.8 μg/mg，比原始菌株提高32.8%，而MG-1僅比原始菌株高2%，說(shuō)明過(guò)表達(dá)sm基因提高那西肽產(chǎn)量的作用優(yōu)于vhb。

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Effects of Overexpressing Hemoprotein Gene fromSinorhizobiummelilotion Nosiheptide Yield ofStreptomycesactuosus

MO Qiu-yan, SONG Yuan-da*

(Food and Health Research Center, School of Food and Health, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] To improve the dissolved oxygen expression ofStreptomycesactuosusby overexpressing hemoprotein Gene fromSinorhizobiummeliloti, and to enhance the yield of nosiheptide. [Method]Sinorhizobiummelilotihemoglobin gene (sm) was obtained through the whole gene synthesis method, which were cloned into the plasmid pIB139 to construct expression vectors pIB139-sm. The plasmid containingsmwas introduced intoStreptomycesactuosusthrough conjugal transfer betweenE.coliandStreptomces. The transformants were verified by PCR, and then were purified by several cycles of single-colony screen. [Result] The expression and activity of SmfHb was confirmed by SDS-PAGE and CO-difference spectrum analysis, respectively. Flask culture experiment results showed that the nosiheptide yield in SmfHb-overexpressing strain (1 245.7 μg/mL) was increased by 39.6% (P< 0.05) compared with the control strain (892.5 μg/mL). [Conclusion] Overexpressingsmgene is superior tovhbin enhancing the yield of nosiheptide yield.

Sinorhizobiummeliloti;Streptomycesactuosus; Nosiheptide

莫秋燕(1990- )，女，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事微生物功能脂質(zhì)研究。

2016-04-25

S 188

A

0517-6611(2016)24-157-03