倪 榮,李紫嫣,鐘文文,張海娟,許俊杰

(臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276000)

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10億芽孢/g解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的研究

倪 榮,李紫嫣,鐘文文,張海娟,許俊杰*

(臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276000)

[目的]初步確定解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的制備工藝。以解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1為研究對(duì)象，對(duì)填料、潤(rùn)濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、UV保護(hù)劑進(jìn)行篩選。[結(jié)果]其工藝配方為：硅藻土10%為填料，PVA 7.2%為分散劑，D425 4.8%為潤(rùn)濕劑，CMC-Na 2.0%為穩(wěn)定劑，F(xiàn)WA 0.1%為保護(hù)劑。該粉劑的芽孢含量達(dá)1.2×109cfu/g，懸浮率為80%，潤(rùn)濕時(shí)間為47 s，熱貯分解率為23.2%。[結(jié)論]該制劑質(zhì)量符合相關(guān)要求，可進(jìn)一步研究。

解淀粉芽孢桿菌；可濕性粉劑；穩(wěn)定性；研制

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌[1-3]。芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一種非致病菌，容易形成對(duì)惡劣環(huán)境(物理的或化學(xué)的)具有較高耐性的芽孢，具有耐熱、耐旱、抗紫外線等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)溫度、pH等物理及化學(xué)因素的耐受性高于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，是用來研制可濕性粉劑的首選材料。微生物農(nóng)藥是指利用生物活體殺死或抑制植物病原微生物生長(zhǎng)的制劑，具有環(huán)境兼容性好、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，既可殺死或抑制病原微生物，又可保護(hù)生物多樣性，是當(dāng)今農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)。鑒于此，筆者以解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1菌株為研究對(duì)象，通過助劑選擇和配制工藝優(yōu)化，研制了符合國(guó)標(biāo)的10億芽孢/g解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑，以期為該菌的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1篩選材料。解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1菌株由臨沂大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1搖瓶發(fā)酵液，芽孢含量≥5.0×109cfu/mL，芽孢率≥90%。制劑加工材料：解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵液，芽孢含量≥1.0×1010cfu/mL，芽孢率≥90%。

1.1.2載體。白炭黑(28 μm)、高嶺土(10 μm)、硅藻土(18 μm)、滑石粉(18 μm)、膨潤(rùn)土(45 μm)、輕質(zhì)碳酸鈣(10 μm)購(gòu)于北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司。

1.1.3助劑?？s聚萘磺酸鹽(D110)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG 8000)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽(Morwet D-425)、吐溫-80等購(gòu)于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.1.4穩(wěn)定劑。CaCO3、K3PO4、K2HPO4、CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.1.5紫外保護(hù)劑?？箟难?VC)、羧甲基纖維素(CMC)、糊精和熒光增白劑(FWA)購(gòu)于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.1.6主要儀器。QS-50型氣流粉碎機(jī)(上海細(xì)創(chuàng)粉體裝備有限公司)、DS-1500型噴霧干燥機(jī)(上海沃迪科技有限公司)、臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代天誠(chéng)科技有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)、精密酸度計(jì)(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器廠)、恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)。

1.2方法

1.2.1制劑芽孢含量的測(cè)定。采用平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)定制劑的芽孢含量。

1.2.2制劑加工工藝與方法。

1.2.2.1篩選試驗(yàn)加工工藝。先將解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1搖瓶發(fā)酵液與填料按一定比例混合制成母液，置于鼓風(fēng)干燥機(jī)干燥制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散劑、潤(rùn)濕劑等，然后經(jīng)氣流粉碎機(jī)粉碎制得可濕性粉劑。

1.2.2.2制劑加工工藝。將解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1 50 L發(fā)酵液與填料按一定比例混合制成母液，經(jīng)噴霧干燥機(jī)干燥制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散劑、潤(rùn)濕劑等，然后經(jīng)氣流粉碎機(jī)粉碎制得各種不同的制劑。

1.2.2.3初始制劑成分配比。初始制劑成分質(zhì)量配比為發(fā)酵液70.0%，填料10.0%，助劑10.0%，穩(wěn)定劑2.0%，保護(hù)劑0.1%，白炭黑補(bǔ)足100%。

1.2.3 篩選試驗(yàn)。

1.2.3.1填料的篩選。選擇白炭黑、高嶺土、硅藻土、膨潤(rùn)土、滑石粉、輕質(zhì)碳酸鈣6種不同載體做填料，比較不同填料對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響。將制備的各制劑室溫貯藏14 d后測(cè)定芽孢含量，以此考察填料對(duì)芽孢桿菌的生物相容性。綜合考慮各制劑懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間、吸附容量、價(jià)格等因素，篩選出最適填料。

1.2.3.2潤(rùn)濕劑與分散劑的篩選。在母粉中分別添加一定量的PVA、D425等助劑，再按初始量添加K3PO4、VC后混合均勻，即制得不同的制劑。測(cè)定各制劑的懸浮率，比較各種分散劑的分散效果；懸浮率越高，分散性越好。測(cè)定潤(rùn)濕時(shí)間，比較潤(rùn)濕性能的好壞；潤(rùn)濕時(shí)間越短，潤(rùn)濕性越好。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳的分散劑、潤(rùn)濕劑。將從助劑中篩選出的分散劑與潤(rùn)濕劑，分別按質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1比例經(jīng)粉碎機(jī)混合均勻，測(cè)定其懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間，篩選出復(fù)配助劑的最佳配比。將復(fù)配助劑的用量按2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%和18%分別進(jìn)行試驗(yàn)，選出制劑懸浮率與潤(rùn)濕時(shí)間最好的一組，作為復(fù)配助劑的用量。

1.2.3.3穩(wěn)定劑的篩選。將不同的穩(wěn)定劑添加到母粉中，制得各種不同的制劑，將其分別進(jìn)行熱貯[(54±2)℃，14 d]試驗(yàn)，測(cè)定其芽孢含量的變化。以不加穩(wěn)定劑作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.4保護(hù)劑的篩選。將篩選出的填料、發(fā)酵液、濕潤(rùn)劑及分散劑分別與待選保護(hù)劑(0.1%)加工成可濕性粉劑，以不加保護(hù)劑為對(duì)照，稀釋后涂布在平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，在距離254 nm紫外燈(20W)40 cm處照射12、24 h后，計(jì)算芽孢存活率。

將保護(hù)劑添加到母粉中，制得各種不同的制劑，將其分別稀釋后涂布在平板上，置于距離(254 nm，20 W)紫外燈40 cm處照射12、24 h后，計(jì)算存活率。以不加保護(hù)劑作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4水分含量對(duì)制劑穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)。選擇不同含水量的解淀粉芽孢桿菌制劑100 g，37 ℃下鼓風(fēng)干燥，得到含水率分別為2%、5%、7%、9%和13%的樣品，將樣品分別密封后，進(jìn)行熱貯[(54±2) ℃，14 d]試驗(yàn)后測(cè)定芽孢含量，并計(jì)算芽孢存活率。

1.2.5制劑貯藏穩(wěn)定性測(cè)定。分別取100 g解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑置于冷藏[(4±2) ℃]和室溫(25 ℃)條件下貯存，每1個(gè)月測(cè)定1次樣品的芽孢含量，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)360 d，共測(cè)定11次，以此確定制劑貯存360 d期間芽孢含量的變化。

1.2.6制劑的指標(biāo)測(cè)定。采用平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)定制劑的芽孢含量。按照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑進(jìn)行測(cè)定[4]。

2　結(jié)果與分析

2.1填料的篩選可濕性粉劑中的填料對(duì)制劑的理化性質(zhì)影響很大。農(nóng)藥原藥為液態(tài)的制劑，選擇吸附容量高的填料對(duì)制劑加工非常重要；如果是固體原藥，則選擇吸附容量適宜的填料即可。

表1　填料對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響

由表1可知,白炭黑吸附容量最大，其次是硅藻土，但是白炭黑流動(dòng)性比硅藻土好，且解淀粉芽孢桿菌與白炭黑混合后的制劑芽孢含量在室溫下貯藏14 d后，發(fā)現(xiàn)芽孢含量明顯下降，說明白炭黑與芽孢桿菌的生物相容性較差，且白炭黑價(jià)格偏高，所以選擇硅藻土作為填料。

2.2助劑的篩選大部分分散劑具有一定程度的潤(rùn)濕作用，而大部分潤(rùn)濕劑又具有一定程度的分散作用，因此，該研究對(duì)助劑的懸浮作用和潤(rùn)濕作用同時(shí)考察。

由表2可知，雖然以表面活性劑CMC-Na為分散劑，制劑的懸浮率最高，達(dá)到87%，但其潤(rùn)濕時(shí)間卻高達(dá)300 s，故選擇PVA作分散劑。而以D425作潤(rùn)濕劑濕潤(rùn)時(shí)間為8 s，其懸浮率達(dá)73%，故選擇D425作潤(rùn)濕劑。因此，選擇PVA與D425復(fù)配。

由表3可知，采用PVA與D425復(fù)配質(zhì)量比為6∶4時(shí)，其制劑的懸浮率與潤(rùn)濕時(shí)間均較佳。由表4可知，隨助劑用量降低，懸浮率與潤(rùn)濕性均下降，為保證制劑成本和質(zhì)量，確定復(fù)配助劑用量為12%，由此確定PVA用量為7.2%，D425用量為4.8%。

表3助劑配比對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響

Table 3Effects of assistant ratio on physical and chemical properties of preparations

PVA-D425質(zhì)量比PVA-D425massratio細(xì)度Fineness(44μm)∥%懸浮率Suspensibility%潤(rùn)濕時(shí)間Wettingtime∥s1∶9987592∶89876113∶79877114∶69879125∶59880126∶49882147∶39883158∶29885169∶1988617

表4助劑用量對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響

Table 4Effects of assistant dosage on physical and chemical properties of preparations

助劑量Assistantdosage∥%細(xì)度Fineness(≤44μm)∥%懸浮率Suspensibility%潤(rùn)濕時(shí)間Wettingtime∥s29857454986337698682889875231098841412988612149888121698901018989111

2.3穩(wěn)定劑的篩選加入適量的穩(wěn)定劑，不但能提高制劑的穩(wěn)定性，還能提高其潤(rùn)濕性和滲透性。由表5可知，在4種穩(wěn)定劑中，加入CMC-Na作為穩(wěn)定劑，熱貯后解淀粉芽孢桿菌的存活率最高。此外，CMC-Na具有分散劑的作用，所以選擇CMC-Na作為穩(wěn)定劑，制劑的懸浮率也較高。

表5　熱穩(wěn)定劑對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響

2.4UV保護(hù)劑的選擇由于解淀粉芽孢桿菌施用到大田中，陽(yáng)光中的紫外線直接對(duì)活菌體構(gòu)成了威脅，因此，有必要在可濕性粉劑中加入U(xiǎn)V保護(hù)劑。UV保護(hù)劑能將陽(yáng)光中的大部分紫外輻射吸收掉，將吸收的能量轉(zhuǎn)化為無害的熱能散發(fā)到空氣中。

由表6可知，制劑添加FWA作UV保護(hù)劑，UV照射處理24 h后芽孢存活率最高，達(dá)57.6%，因此，選擇FWA作為UV保護(hù)劑。

表6　UV保護(hù)劑對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響

2.5 水分含量對(duì)制劑穩(wěn)定性的影響解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑在不同的貯藏條件下放置一定時(shí)間后，芽孢數(shù)量會(huì)發(fā)生不同程度的變化，其數(shù)量和耐貯藏時(shí)間的長(zhǎng)短直接決定產(chǎn)品的優(yōu)劣。水分含量與菌體生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)。水分含量過高，菌體代謝活躍，貯藏期間死亡率高，此外還造成制劑的流動(dòng)性差、黏結(jié)成團(tuán)，影響到制劑的質(zhì)量和使用效果；水分含量較低，菌體處于休眠狀態(tài)，能夠延長(zhǎng)制劑的貯藏時(shí)間。

由圖1可知，水分含量對(duì)熱貯后芽孢存活率有顯著影響。水分含量高于6.5%時(shí)，制劑熱貯后芽孢存活率低于70.5%，制劑質(zhì)量較差。 因此，制備解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑，水分含量不宜超過6.5%。

圖1　解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的水分含量對(duì)存活率的影響Fig.1　Effects of water content in Bacillus amyloliquefaciens wetable powder on survival rate

2.6制劑貯藏穩(wěn)定性測(cè)定由表7可知，解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑在室溫下貯藏芽孢存活率明顯比冷藏條件下低。解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑在室溫環(huán)境下貯藏360 d后，其芽孢存活率為56.5%，而在(4±2) ℃低溫下保存360 d，其存活率高達(dá)80.2%，主要由于較低溫度下芽孢桿菌幾乎全部處于休眠狀態(tài)，代謝緩慢。因此，解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑應(yīng)在盡可能低溫度的環(huán)境下保存，有利于延長(zhǎng)其貯藏期。

表7解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的貯藏期菌量變化

Table 7Changes of bacterial biomass in the storage period of Bacillus amyloliquefaciens wetable powder

儲(chǔ)存時(shí)間Storagetime∥d存活率Survivalrate∥%25℃室溫下Under25℃roomtemperature(4±2)℃冷藏(4±2)℃coldstorage098.098.05096.598.010090.096.215085.694.320076.992.825068.190.230063.489.135058.686.336056.580.2

2.7可濕性粉劑的指標(biāo)測(cè)定測(cè)定結(jié)果表明，該粉劑的芽孢含量達(dá)1.2×109cfu/g，懸浮率為80%，潤(rùn)濕時(shí)間為47 s，熱貯分解率為23.2%。制劑質(zhì)量符合相關(guān)要求。

3　結(jié)論與討論

通過對(duì)填料、潤(rùn)濕劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑的篩選，確定解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑最佳配方為硅藻土10%、PVA 7.2%、D425 4.8%、CMC-Na 2%、FWA 0.1%，在該條件下制備的解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑芽孢含量高達(dá)2.0×109cfu/g，懸浮率為80%，潤(rùn)濕時(shí)間為47 s，熱貯分解率為23.2%。水分含量不宜超過6.5%，復(fù)配助劑用量為12%。制劑質(zhì)量符合相關(guān)要求，其他方面有待于進(jìn)一步研究。

該研究所制備的解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑芽孢含量與目前大多數(shù)市售產(chǎn)品相比，其芽孢含量較高，為我國(guó)解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑產(chǎn)品質(zhì)量的提升奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛，同時(shí)能夠?qū)Χ喾N真菌與細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，并且具有豐富的自身代謝產(chǎn)物，因此，在生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可以適當(dāng)?shù)卮鎮(zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥。注冊(cè)主要成分為解淀粉芽孢桿菌的生物農(nóng)藥將被廣泛應(yīng)用[5-6]。

[1] CRANE J M，GIBSON D M，VAUGHAN R H,et al.Iturin levels on wheat spikes linked to biological control of fusarium head blight byBacillusamyloliquefaciens[J].Phytopathology,2013,103(2):146-155.

[2] 劉京蘭,薛雅蓉,劉常宏.內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09產(chǎn)Iturin A搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào),2014,41(1):75-82.

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Research on Wetable Powder ofBacillusamyloliquefacienswith Each Gram 1 Billion Spores

NI Rong,LI Zi-yan,ZHONG Wen-wen,XU Jun-jie*et al

(School of Pharmacy,Linyi University,Linyi,Shandong 276000)

[Objective] The aim was to determine the preparation technique ofBacillusamyloliquefacienswetable powder.[Method] WithBacillusamyloliquefacienslyxjj-1 as study object,filler,wetting agent,dispersing agent,stabilizer,UV protective agent were selected.[Result] The optimal formulation were confirmed as follows:the content filler diatomite,dispersing agent PVA,wetting agent D425,stabilizer CMC-Na,UV protection agents FWA were 10%,7.2%,4.8%,2.0% and 0.1% respectively.The quality detection showed that the spores content ofB.amyloliquefacienslyxjj-1 wetting powder could come up to 1.2×109cfu/g,and suspension rate of the production was 80%,and the dispersion time was 47 s and thermal decomposition rate of storage was 23.2%.[Conclusion] The quality of the preparation is in accordance with the relevant requirements,which can be further studied.

Bacillusamyloliquefaciens; Wetable powder; Stability; Research

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410452017，201510452017)。

倪榮(1992- )，女，山東郯城人，本科生，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，副教授，博士，從事微生物分離與鑒定及生物農(nóng)藥研究。

2016-06-06

TQ 450.6

A

0517-6611(2016)24-111-04