景亞運(yùn)， 張 正， 王印庚， 于永翔， 廖梅杰， 李 彬

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071)

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養(yǎng)殖大菱鲆腹水病病原菌的分離與鑒定

景亞運(yùn)1,2， 張 正2*， 王印庚2， 于永翔2， 廖梅杰2， 李 彬2

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071)

[目的]從養(yǎng)殖大菱鲆中分離腹水病病原菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。[方法]從山東半島2個(gè)不同的養(yǎng)殖場(chǎng)腹水病發(fā)病大菱鲆體內(nèi)分離病原菌，并通過(guò)常規(guī)生理生化試驗(yàn)和16S rDNA基因序列對(duì)比對(duì)其進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]共分離到2株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。常規(guī)生理生化特征分析表明，這2株菌分別與鯊魚(yú)弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)表性特征非常相似。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明這2株菌與鯊魚(yú)弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的親緣關(guān)系最近。[結(jié)論]這2株細(xì)菌被鑒定為鯊魚(yú)弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)。

大菱鲆；腹水??；病原；鯊魚(yú)弧菌；大菱鲆弧菌

大菱鲆(ScophthalmusmaximusL)隸屬鲆科菱鲆屬，是水產(chǎn)品市場(chǎng)廣受歡迎的一種名貴魚(yú)種，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高[1]。我國(guó)從1992年開(kāi)始進(jìn)行大菱鲆的引種工作，并于2001年開(kāi)始進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)養(yǎng)殖。但是，近幾年隨著大菱鲆養(yǎng)殖熱潮的興起，養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，疾病的暴發(fā)也越來(lái)越頻繁[2-4]。通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖大菱鲆進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)腹水病是養(yǎng)殖大菱鲆最為常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一。筆者從3個(gè)分布于山東半島不同區(qū)域的養(yǎng)殖場(chǎng)采集了病魚(yú)的樣品，進(jìn)行了細(xì)菌分離和病原的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究。

1　材料與方法

1.1菌種的采集、分離和培養(yǎng)基從位于青島和榮成2個(gè)不同的養(yǎng)殖場(chǎng)采集到2個(gè)患腹水病的大菱鲆樣品，這2個(gè)樣品病魚(yú)外觀胸腔鼓脹、腹部隆起，解剖后發(fā)現(xiàn)胸腔內(nèi)部充滿無(wú)色或淡黃色液體，腹水病的病變癥狀非常明顯。

在無(wú)菌條件下，將發(fā)病魚(yú)的肝臟組織剪碎后用接種環(huán)直接挑取并接種于鹽度為3%的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24～30 h后，挑取優(yōu)勢(shì)菌的單個(gè)菌落純化2遍后，用20%甘油置于-80 ℃冰箱中保存。腹水中的細(xì)菌則是使用一次性無(wú)菌醫(yī)用注射器吸取少量腹水直接接種于鹽度為3%的TSB平板培養(yǎng)基上，采用相同的方法分離和保存。TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)基的成分為：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，NaCl 30 g，磷酸氫二鉀25 g，葡萄糖25 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃下高壓滅菌15 min。

1.2形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)使用Nikon E800光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌個(gè)體形態(tài)、大小和鞭毛，用半固體培養(yǎng)基(TSB)穿刺接種培養(yǎng)結(jié)合水浸片觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第9版)》對(duì)細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)分類，用法國(guó)生物梅里埃公司API 20E試劑條和北京陸橋公司的菌種鑒定管進(jìn)行常見(jiàn)碳、氮源利用和酶反應(yīng)的測(cè)定，對(duì)于一些特征性反應(yīng)則手工配制相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行。

1.316S rDNA序列測(cè)定分析

1.3.1PCR模板的制備。將細(xì)菌分別接種于TSB平板上，28 ℃下培養(yǎng)24 h后取單一菌落懸浮于無(wú)菌去離子水中，100 ℃水浴5～10 min后，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，上清液即為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

1.3.216S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定。16S rDNA基因擴(kuò)增的正向引物(P27f)為5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTC AG-3’，反向引物(P1429r)為5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(此引物為細(xì)菌16S rDNA基因序列擴(kuò)增的通用引物)。PCR擴(kuò)增體系(100 μL)：1×PCR緩沖液、1.5 mmol/L MgCl2、4×dNTP混合物125 μmol/mL、引物各7.5 nmol/mL、TaqDNA聚合酶1 μL (5 U/μL)、1 μL DNA原液。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃溫育15 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳確定特異條帶后，直接交由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化和序列測(cè)定。

1.3.3序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。將所獲得的16S rDNA基因序列使用BIOEDIT軟件進(jìn)行對(duì)比分析，確定其相似性。從GenBank中選取與其相似率最高的細(xì)菌16S rDNA基因序列，使用BIOEDIT軟件中集成的Clustal W軟件進(jìn)行多序列匹配排列，使用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包PHYLIP3.6a3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類分析。采用鄰位相連法(Neighbor-joining)獲得系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)自舉分析(Bootstraping)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的評(píng)估，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.3.4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的16S rDNA基因序列來(lái)源。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取25株與分析細(xì)菌的16S rDNA基因序列相似性較高的已鑒定至種的菌株，與分離到的菌株共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。選取菌株的相關(guān)數(shù)據(jù)和存取號(hào)見(jiàn)表1。

表1　構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的16S rDNA基因序列及其數(shù)據(jù)庫(kù)存取號(hào)

2　結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征和運(yùn)動(dòng)性從這2個(gè)病魚(yú)樣品中分離到2株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，分別編號(hào)為菌株Ⅶ和菌株Ⅸ。這2株菌在鹽度3%的TSB培養(yǎng)基上28 ℃下培養(yǎng)24～30 h后，形成的單個(gè)菌落均較小、透明、接近無(wú)色。水浸片顯微檢查和半固體瓊脂穿刺接種培養(yǎng)都發(fā)現(xiàn)菌株Ⅶ有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性，菌株Ⅸ沒(méi)有明顯的運(yùn)動(dòng)性。在TCBS瓊脂平板培養(yǎng)基上，菌株Ⅶ和菌株Ⅸ都呈明顯黃色的菌落。

2.2生長(zhǎng)特性這2株菌的溫度生長(zhǎng)范圍存在差異，菌株Ⅶ在10～40 ℃范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，并且在此范圍內(nèi)沒(méi)有表現(xiàn)太大的生長(zhǎng)速度差異。菌株Ⅸ在10～30 ℃范圍內(nèi)能良好地生長(zhǎng)，在30～40 ℃范圍內(nèi)可以微弱生長(zhǎng)。

在鹽度1%～5%的范圍內(nèi)，這2株細(xì)菌生長(zhǎng)非常良好，在此范圍外表現(xiàn)出一定的鹽度生長(zhǎng)差異性。當(dāng)pH高于6.5時(shí)，它們都能夠良好生長(zhǎng)，說(shuō)明這2株細(xì)菌都是嗜堿性的。

2.3生理生化特征由表2可知，這2株細(xì)菌明顯不是同一種細(xì)菌。它們?cè)?TCBS平板生長(zhǎng)旺盛，且菌落都呈明顯黃色，對(duì)O/129特征性抑制劑敏感，據(jù)此可將它們歸為弧菌屬細(xì)菌。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，菌株Ⅶ在一些主要指標(biāo)上與鯊魚(yú)弧菌(Vibriocarchariae)非常相近，菌株Ⅸ與大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的生理生化特征非常相似。

表2　分離菌株的主要生理生化特征

注：+ 表示陽(yáng)性；- 表示陰性；(+)表示弱陽(yáng)性生長(zhǎng)[5]。

Note：+ indicated positive; - indicated negative; and (+) indicated the growth of weak positive[5].

2.416S rDNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將獲得的16S rDNA序列使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的相似率為93.98%。綜合上述生理生化試驗(yàn)結(jié)果，可以確定這2株細(xì)菌同屬不同種。將這2株細(xì)菌的16S rDNA基因序列分別輸入NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與菌株Ⅶ相似性最高的前100個(gè)序列中65%為弧菌屬細(xì)菌，與其最相近的已鑒定的細(xì)菌16S rDNA序列是鯊魚(yú)弧菌(Vibriocarchiariae)的16S rDNA序列，相似率為99.71%。與菌株Ⅸ相似性最高的前100個(gè)序列中84%為弧菌屬細(xì)菌，與其相似率最高的已鑒定的細(xì)16S rDNA序列是大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的16S rDNA序列，相似率為99.37%。

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與菌株Ⅶ和菌株Ⅸ的16S rDNA序列相似性較高的13株細(xì)菌的16S rDNA序列(表1)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從圖1可以看出，B7(菌株Ⅶ)與V.carchiariae自然聚類成一個(gè)分支，B9(菌株Ⅸ)與V.scophthalmi自然聚類成一個(gè)分支[6]。綜合生理生化試驗(yàn)結(jié)果和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，可初步鑒定這2株從患腹水病的大菱鲆體分離到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中1株為鯊魚(yú)弧菌(Vibriocarchiariae)，另1株為大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)。

注：基于16S rDNA基因序列用鄰位相連法完成，分枝上的數(shù)字是1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)的Bootstrap值。　Note: Based on 16S rDNA sequence with Neighbor-joining method, the digit on the ramification was bootstrap valuation of 1 000 replications of sampling detection.圖1　16S rDNA基因序列的聚類分析結(jié)果Fig.1　Cluster analysis result of 16S rDNA gene sequence

3　討論

流行病調(diào)查表明，腹水病是養(yǎng)成期大菱鲆的常見(jiàn)疾病，流行面積較廣，在環(huán)渤海沿岸和山東半島以及江蘇省等大菱鲆的主要養(yǎng)殖區(qū)都發(fā)生過(guò)。對(duì)腹水病的病原學(xué)初步研究表明，細(xì)菌是導(dǎo)致腹水病發(fā)病的主要原因。腹水病發(fā)病初期屬于內(nèi)臟器官的病變，發(fā)病中后期則會(huì)導(dǎo)致全身感染，并可導(dǎo)致大規(guī)模的死亡，發(fā)病后具有非常典型的外觀病變特征，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中若注意觀察是比較容易發(fā)現(xiàn)和識(shí)別的[7]。

腹水病屬于內(nèi)臟器官的病變，其發(fā)病機(jī)理是比較復(fù)雜的[8]。針對(duì)來(lái)源不同的樣品，對(duì)腹水病進(jìn)行的細(xì)菌分離也證實(shí)了這一點(diǎn)。從腹水病發(fā)病病魚(yú)的內(nèi)臟組織和腹腔積水中分離到鯊魚(yú)弧菌和大菱鲆弧菌，此外還有1株待鑒定的細(xì)菌。從病原學(xué)研究來(lái)看，推測(cè)腹水病可能是多種病原都能致病。

鯊魚(yú)弧菌是國(guó)外的一些相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)大菱鲆致病的常見(jiàn)病害細(xì)菌之一[9]，國(guó)內(nèi)莫照蘭等[10]也報(bào)道了鯊魚(yú)弧菌可對(duì)養(yǎng)殖牙鲆致病。目前在我國(guó)對(duì)養(yǎng)殖大菱鲆的病害研究還相對(duì)較少，盡管已經(jīng)從發(fā)病的大菱鲆體內(nèi)檢測(cè)到鯊魚(yú)弧菌，并已證實(shí)在腹水病患病狀態(tài)下這種弧菌屬于優(yōu)勢(shì)菌群，但對(duì)于這2種弧菌的入侵方式、致病力以及是原發(fā)病原還是繼發(fā)病原都尚需深入研究。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，大菱鲆弧菌是大菱鲆幼苗期腸道中占優(yōu)勢(shì)數(shù)量的一種細(xì)菌，正常情況下并無(wú)致病性[11]。在來(lái)自不同地理區(qū)域的大菱鲆樣品腸道中都可檢出大菱鲆弧菌；在一些育苗場(chǎng)的水體中和活餌體內(nèi)，也曾檢出大菱鲆弧菌，但在養(yǎng)殖池底的沉積物中并不常見(jiàn)[12]。因此，推斷大菱鲆弧菌可能是健康大菱鲆腸道中的正常優(yōu)勢(shì)菌群，但在大菱鲆內(nèi)臟器官被感染或其他病原細(xì)菌入侵后可能轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件致病菌，應(yīng)屬于繼發(fā)性病原。但是對(duì)于該菌一些病原學(xué)方面的具體特性還有待進(jìn)一步研究。此外，在來(lái)自其他地區(qū)的患腹水病的大菱鲆樣品中還分離到1株已證實(shí)為非弧菌屬的細(xì)菌，通過(guò)對(duì)其生理生化特征和16S rDNA基因序列的研究，并未找到相似性很高的已知菌種，今后對(duì)這株細(xì)菌的鑒定和相關(guān)病原學(xué)方面的研究也將逐漸開(kāi)展。

由于試驗(yàn)成本和試驗(yàn)條件的限制以及腹水病的發(fā)病機(jī)理本身具有復(fù)雜性，尚未完成對(duì)腹水病的人工回接感染試驗(yàn)。該試驗(yàn)中所分離的這些細(xì)菌來(lái)自不同的養(yǎng)殖場(chǎng)，具有一定的代表性，它們極有可能是這2種疾病的第一致病原或繼發(fā)性病原。根據(jù)這些細(xì)菌的多樣性推測(cè)，它們也存在聯(lián)合致病的可能性。腹水病是大菱鲆養(yǎng)殖過(guò)程中極為常見(jiàn)的一種細(xì)菌性疾病，由于是內(nèi)部器官的感染，發(fā)病前期沒(méi)有明顯的癥狀，給生產(chǎn)上及時(shí)發(fā)現(xiàn)和預(yù)防該病造成了一定的困難[13]。因此，選購(gòu)健康的苗種、規(guī)范健康養(yǎng)殖工藝和加強(qiáng)衛(wèi)生操作管理防治腹水病的有效措施。

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Isolation and Identification of Pathogenic Bacterium Associate with Ascites Disease of CulturedScophthalmusmaximus

JING Ya-yun1,2, ZHANG Zheng2*,WANG Yin-geng2et al

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao, Shandong 266071)

[Objective] To isolate and identify pathogenic bacterium associate with ascites disease of culturedScophthalmusmaximus. [Method] Pathogenic strains were isolated from three diseased-turbot samples associate with ascites syndrome in three different aquatic plants on Shandong Peninsula. The traditional physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequencing analysis were performed on the two strains. [Result] A total of two dominant bacterium were isolated. Analysis of traditional physiological and biochemical test showed that the two strains wereVibriocarchiariaeandVibrioscophthalmi. Analysis of phylogenetic dendrogram showed that the two strains had close genetic relationship withVibriocarchiariaeandVibrioscophthalmi. [Conclusion] The two strains were identified asVibrioalginolyticusandVibrioscophthalmi.

Scophthalmusmaximus; Enteritis diseases; Pathogeny;Vibrioalginolyticus;Vibrioscophthalmi

山東省自主創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)(2014ZZCX06205)。

景亞運(yùn)(1990- )，男，河北任丘人，碩士研究生，研究方向：海水養(yǎng)殖病害研究。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事海水養(yǎng)殖病害研究。

2016-06-29

S 94

A

0517-6611(2016)24-106-03