喻靜蘭,孫建春,楊 曄

(上?；ぱ芯吭?上海 200062)

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三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控

喻靜蘭,孫建春,楊 曄

(上海化工研究院,上海 200062)

[目的]研究三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控途徑，為通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件來(lái)提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提供依據(jù)和參考。[方法]采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定β-胡蘿卜素的含量，優(yōu)化正負(fù)菌孢子接入種子培養(yǎng)基的接種比例，通過(guò)對(duì)三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控分析，確定最佳補(bǔ)液時(shí)間，優(yōu)化培養(yǎng)溫度和接種比例來(lái)提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。[結(jié)果]最佳孢子接種比例為正菌∶負(fù)菌=10∶1,最佳補(bǔ)液時(shí)間為52 h,最佳培養(yǎng)溫度為27 ℃,最佳種子液接種比例為8%。[結(jié)論]通過(guò)對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的分析優(yōu)化了培養(yǎng)條件，并將β-胡蘿卜素的產(chǎn)量從1.45 g/L提高到2.26 g/L，產(chǎn)量提高了55.9%，取得了較好的效果，為β-胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

三孢布拉霉; β-胡蘿卜素; 發(fā)酵; 代謝調(diào)控

β-胡蘿卜素是重要的維生素A前體[1]，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，在食品、保健品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要用途。目前，我國(guó)β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法3種[2-3]。其中，微生物發(fā)酵法由于產(chǎn)品天然且不受環(huán)境條件限制、培養(yǎng)周期短、易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到重視，已成為天然β-胡蘿卜素的主要生產(chǎn)方法。三孢布拉霉菌具有生長(zhǎng)迅速、生物量大和類胡蘿卜素合成產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的優(yōu)良菌種。研究表明，通過(guò)將該菌的正、負(fù)單性菌株混合發(fā)酵可獲得較高產(chǎn)量的β-胡蘿卜素[4]。筆者對(duì)菌株發(fā)酵種子液培養(yǎng)期的初級(jí)代謝結(jié)果進(jìn)行分析，并根據(jù)分析結(jié)果對(duì)初級(jí)代謝階段的發(fā)酵條件進(jìn)行一系列的優(yōu)化，從而提高最終產(chǎn)物β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

1　材料與方法

1.1菌種三孢布拉霉(Blakesleatrispora)：正菌H5-30，負(fù)菌H6-1，由上?；ぱ芯吭荷锘?shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器和試劑分光光度計(jì)UV755B；無(wú)水乙醇，石油醚。

1.3培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：土豆汁200 g/L，葡萄糖200 g/L，蛋白胨100 g/L，瓊脂200 g/L，VB15 mg/L；種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉80 g/L，玉米粉28 g/L，VB150 g/L，淀粉酶1滴；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉80 g/L，黃豆餅粉16 g/L，酵母膏2 g/L，異煙肼0.4 g/L，VB15 mg/L，KH2PO40.6 g/L，MnSO40.3 g/L，Triton 1.2 g/L，煤油24 g/L，豆油66 g/L。

1.4培養(yǎng)方法

1.4.1孢子懸浮液的制備。將甘油管保藏的正負(fù)菌菌株分別接種至PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)出，用25 mL無(wú)菌水洗滌孢子并用2層紗布過(guò)濾，分別得到正負(fù)菌孢子懸浮液。取1 mL孢子懸浮液稀釋至6 mL，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)650 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算懸浮液的孢子濃度。

1.4.2種子培養(yǎng)。按照正菌孢子懸浮液接種量為3，負(fù)菌孢子接種量為0.3的接種比例接入種子培養(yǎng)基，在27 ℃、230 r/min下培養(yǎng)24 h。

1.4.3發(fā)酵培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的種子液按10%的接種比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在27 ℃、230 r/min下培養(yǎng)120 h。1.5β-胡蘿卜素的提取和測(cè)定將培養(yǎng)好的菌絲分別用200目絲網(wǎng)抽濾，溫水沖洗至濾液無(wú)色，稱取濕重；在80～90 ℃下烘干至恒重，計(jì)算生物量。稱取適量菌體至10 mL離心管，加鋼珠和5 mL二甲基亞砜∶三氯甲烷=2∶3的混合液，振蕩打磨45 min后離心，浸出液用無(wú)水乙醇稀釋100倍后，在波長(zhǎng)455 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-胡蘿卜素的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1β-胡蘿卜素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線精確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品晶體，用石油醚溶解并稀釋成濃度梯度，在其最長(zhǎng)吸收波長(zhǎng)455 nm下[5]測(cè)定其吸光度，以β-胡蘿卜素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，最大吸收波長(zhǎng)為455 nm，其回歸方程為y=1.143 8x+0.007 3，R2=0.999 8?？梢?jiàn)在該波長(zhǎng)下β-胡蘿卜素的濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖1　β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of β-carotene

2.2正負(fù)菌孢子懸浮液接種量對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響將培養(yǎng)好的正負(fù)菌孢子以孢子懸浮液的形式按一定比例混合接入種子液培養(yǎng)基的方法[6-7]進(jìn)行種子液培養(yǎng)，并對(duì)正負(fù)菌孢子的接種量進(jìn)行梯度條件試驗(yàn)。

將正負(fù)菌孢子懸浮液按照表1的梯度交叉配對(duì)接入種子培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)全流程發(fā)酵培養(yǎng)，得到β-胡蘿卜素產(chǎn)量，并進(jìn)行等高線曲面繪圖分析。

表1　正負(fù)菌接種量

由圖2可知，最佳接種比例：正菌0.65～0.77，負(fù)菌0.055～0.085，正負(fù)菌最佳接種比例為8∶1～14∶1。在此接種比例區(qū)間，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量可達(dá)1.7～1.8 g/L。在此后的多次試驗(yàn)中，此接種范圍內(nèi)獲得的β-胡蘿卜素產(chǎn)量無(wú)顯著差異。為了試驗(yàn)過(guò)程中的可操作性，將正負(fù)菌接種比例固定為10∶1。

圖2　正負(fù)菌不同接種量下β-胡蘿卜素的產(chǎn)量Fig.2　The β-carotene production with different inoculation amount of plus(+) to minus(-) spores

2.3三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的初級(jí)代謝情況由圖3可知，三孢布拉霉菌株接種后立即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48～52 h到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，培養(yǎng)至52～60 h，由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)耗盡，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。而β-胡蘿卜素的生成遲于生物量的增長(zhǎng)，從16 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在生物量進(jìn)入平臺(tái)期后仍持續(xù)增長(zhǎng)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，生物量和β-胡蘿卜素不斷增加，發(fā)酵液中的糖源不斷消耗，殘?zhí)遣粩鄿p少，由于發(fā)酵液中糖濃度的降低使得糖的消耗趨緩，在52～60 h需要進(jìn)行一次補(bǔ)液。

圖3　三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的初級(jí)代謝情況Fig.3　Primary metabolism of fermentative production ofβ-carotene by Blakeslea trispora

2.4發(fā)酵溫度對(duì)代謝的影響為了進(jìn)一步確認(rèn)最佳補(bǔ)液時(shí)間，同時(shí)考察溫度的影響，選取菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間節(jié)點(diǎn)52和60 h，考察不同發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。由圖4可知，60 h的生物量均稍高于52 h的生物量，60 h的β-胡蘿卜素產(chǎn)量也稍高于52 h，說(shuō)明在52～60 h菌體仍緩慢生長(zhǎng)。因此，應(yīng)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，即52 h進(jìn)行接種較理想。52 和60 h的生物量與β-胡蘿卜素隨溫度的變化曲線呈高度的相似性，同時(shí)在24和27 ℃出現(xiàn)2個(gè)峰值，因此，在這2個(gè)溫度點(diǎn)分別接種至發(fā)酵液培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的跟蹤監(jiān)測(cè)。

圖4　生物量與β-胡蘿卜素產(chǎn)量隨溫度的變化Fig.4　The change of biomass and β-carotene production with temperature

圖5　不同溫度下的生物量Fig.5　Biomass under different temperature

由圖5可知，72 h前24 ℃的生物量高于27 ℃的生物量，而在72 h后，27 ℃的生物量高于24 ℃的生物量，并在發(fā)酵終點(diǎn)96 h重新吻合。其原因可能在于三孢布拉霉菌的發(fā)酵是由正菌和負(fù)菌共同完成，其正菌和負(fù)菌的生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)速度存在一定差異，導(dǎo)致在整體生長(zhǎng)情況下呈現(xiàn)2個(gè)交替上升的較優(yōu)發(fā)酵生長(zhǎng)溫度。其機(jī)理有待今后進(jìn)一步探究。根據(jù)在接近發(fā)酵終點(diǎn)92 h測(cè)定的生物量可以看出，27 ℃的發(fā)酵生長(zhǎng)情況優(yōu)于24 ℃，因此，確定27 ℃為最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

2.5接種量對(duì)代謝的影響種子培養(yǎng)結(jié)束后，分別考察將種子液以不同接種比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行全流程培養(yǎng)的發(fā)酵結(jié)果。由圖6可知，接種量為1%～8%，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量和接種量成正比例提高，接種量達(dá)10%時(shí)略有下降。

圖6　接種量對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.6　The influence of the inoculation amount on the β-carotene production

由圖7可知，盡管在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，即30 h左右，殘?zhí)怯捎谙难杆俣a(chǎn)生波動(dòng)，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期即52 h左右時(shí)，殘?zhí)菨舛劝凑?%～8%的接種比例依次遞減，與β-胡蘿卜素的產(chǎn)量呈較好的相關(guān)性，說(shuō)明接種比例從1%逐步增加到8%的過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)越來(lái)越旺盛，糖的消耗越來(lái)越多，目標(biāo)產(chǎn)物β-胡蘿卜素的產(chǎn)量也逐步提高。因此，將8%(V/V)的接種比例確定為最佳接種比例。

圖7　不同接種量的糖代謝情況Fig.7　The carbohydrate metabolism with different inoculation amount

3　結(jié)論

該研究利用三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素，研究了菌體相關(guān)生長(zhǎng)代謝曲線，并在此基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了一定優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳正負(fù)菌孢子接種比例為正菌∶負(fù)菌=10∶1；最佳補(bǔ)液時(shí)間為52 h，最佳培養(yǎng)溫度為27 ℃，最佳種子液接種比例為8%。

在進(jìn)行一系列的培養(yǎng)條件優(yōu)化后，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量從1.45 g/L提高到2.26 g/L，產(chǎn)量提高了55.9%，取得了較好的效果，為β-胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1] 曾強(qiáng)松,童海寶,徐靜安,等.三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素工藝研究[J].工業(yè)微生物,2002,32(4): 7-10.

[2] 廖春麗,郭瑞強(qiáng),陳蘭英,等.β-胡蘿卜素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,29(1): 60-64.

[3] 潘鵬,楊斯,蔡俊,等.三孢布拉霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(4): 36-40.

[4] 尹金鳳,王志軒,吳欣森,等.三孢布拉氏霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2014(13):316-325.

[5] 王海濱.類胡蘿卜素的紫外可見(jiàn)光譜特性及其應(yīng)用[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,23(4):11-13.

[6] KIM S W,SEO W T，PARK Y H．Enhanced synthesis of trisporic acid and β-carotene production inBlakesleatrisporaby addition of non-ionic surfactant,Span 20[J].Journal of fermentation and bioengineering,1997,84: 330-332.

[7] 張陽(yáng).三孢布拉霉大量產(chǎn)孢條件及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究[D].武漢: 華中科技大學(xué),2013: 13-25.

Metabolic Control of Fermentative Production of β-carotene byBlakesleatrispora

YU Jing-lan,SUN Jian-chun,YANG Ye

(Shanghai Research Institution of Chemical Industry,Shanghai 200062)

[Objective] The aim was to study the metabolic control of fermentative production of β-carotene byBlakesleatrispora,which provide a basis for increasing the production of β-carotene by optimized conditions.[Method] Through determiningβ-carotene content by ultraviolet spectrophotometer,the inoculation ratio of plus(+) and minus(-) spores were optimized.Through study on the metabolic control of efficient synthesis of β-carotene by matedBlakesleatrispora,the optimal medium supply time,culture temperature and inoculation amount was determined.[Result] After above,the optimum conditions were obtained,with the inoculation ratio of plus(+) and minus(-) spores was 10∶1,the time of medium supply was 52 hours,the culture temperature was 27 ℃,the inoculation amount was 8%.[Conclusion] Through study on the metabolic control of fermentation production of β-carotene byBlakesleatrispora, the optimum conditions were obtained.As a result,the production of β-carotene was increased from 1.45 to 2.26 g/L,the rate of increase was up to 55.9%,which lays a foundation for the industrial production of β-carotene.

Blakesleatrispora; β-carotene; Fermentation; Metabolic control

上?；ぱ芯吭嚎蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(1806A-1)。

喻靜蘭(1981- )，女，湖北武漢人，工程師，碩士,從事功能食品微生物發(fā)酵工程研究。

2016-06-30

TS 201.3

A

0517-6611(2016)24-085-03