張念琦，錢飛躍，2*，王曉祎，劉郭洵，王 琰，王建芳，2，3

(1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009；2.江蘇高校水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇蘇州 215009；3.蘇州科技大學(xué)天平學(xué)院，江蘇蘇州 215009)

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不同種污泥胞外聚合物的提取方法與組成特征

張念琦1，錢飛躍1，2*，王曉祎1，劉郭洵1，王 琰1，王建芳1，2，3

(1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009；2.江蘇高校水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇蘇州 215009；3.蘇州科技大學(xué)天平學(xué)院，江蘇蘇州 215009)

針對廢水生物處理系統(tǒng)中各類污泥的功能與結(jié)構(gòu)特點，比較了常用胞外聚合物(EPS)提取方法的效能優(yōu)劣，并從反應(yīng)器溶解氧條件、微生物營養(yǎng)類型和污泥空間形態(tài)等方面對不同種污泥的EPS組成特征進(jìn)行了分析，重點強調(diào)了EPS組分在培養(yǎng)全自養(yǎng)脫氮顆粒污泥等特殊微生物聚集體中的重要作用。

胞外聚合物；提取方法；污泥類型；蛋白質(zhì)；聚多糖

胞外聚合物是分布于細(xì)胞表面及周邊的重要結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，通常包括蛋白質(zhì)(PN)、聚多糖(PS)、腐殖質(zhì)(HA)和核酸(DNA)等多種高分子化合物，其主要來源于細(xì)胞的營養(yǎng)攝取、生長代謝和自溶衰減等過程[1-2]。在廢水生物處理系統(tǒng)中，EPS的組成分布不僅會直接影響污泥的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能活性，還能在外界環(huán)境發(fā)生變化時發(fā)揮響應(yīng)作用[3-6]。例如，EPS的分泌和積累是促進(jìn)菌膠團(tuán)、生物膜及顆粒污泥形成的重要條件。當(dāng)污泥進(jìn)入內(nèi)源呼吸階段時，作為儲備性碳源與能源的EPS組分會逐漸減少。當(dāng)環(huán)境中生存競爭日趨激烈時，EPS組分的增多將有助于抑制對手生長和抵擋外界壓力[7-8]。

為探究EPS組分在微生物聚集體中發(fā)揮的獨特功能，有必要針對污泥樣品特點，選擇相適宜的EPS提取方法。以往該領(lǐng)域的報道通常只針對某一類或某幾類污泥，從未對不同提取方法的優(yōu)缺點和適用范圍作出系統(tǒng)闡述[3-5]。鑒于此，筆者介紹了常用的EPS提取方法及其效能，并依據(jù)反應(yīng)器內(nèi)溶解氧條件(好氧與厭氧)、微生物營養(yǎng)類型(自養(yǎng)與異養(yǎng))和污泥空間形態(tài)(絮狀與顆粒)等條件，總結(jié)了不同種污泥EPS的組成特征，以期為建立EPS組分與污泥性能之間的響應(yīng)關(guān)系提供參考。

1　常用的EPS提取方法

根據(jù)提取的難易程度，EPS通?？煞譃榧?xì)胞壁周邊的緊密型(tightly-bound EPS)、細(xì)胞間隙的松散型(loosely-bound EPS)和懸浮液中的可溶型(Soluble EPS)三大類[9-10]。從相對含量上看，遵循緊密型>松散型>可溶型。由于反應(yīng)器運行條件和污泥結(jié)構(gòu)形態(tài)的巨大差異，目前，EPS的提取過程尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，較常用的方法如表1所示，其優(yōu)選依據(jù)是在有效抑制細(xì)胞質(zhì)溶出的前提下，盡可能多地提取EPS組分。

EPS的提取方法可分為物理法和化學(xué)法。一般認(rèn)為，化學(xué)法的提取效率要高于物理法，但前者對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度更大，提取液中DNA等胞內(nèi)物質(zhì)含量和胞漿酶(G6PDH)活性均更高[6，9]。有研究表明，預(yù)先使用甲醛或甲酰胺處理污泥樣品，可對細(xì)胞起到緩沖和固定作用，后續(xù)加入NaOH將使帶負(fù)電的EPS組分脫穩(wěn)并溶出[11-12，15]。該操作的廣譜性和可靠性要優(yōu)于酸堿法和加熱法，但也存在外加試劑殘留、干擾組分分析的弊端，如引起熒光峰紅移等。盡管都利用了組分間的絡(luò)合效應(yīng)，但EDTA法對蛋白質(zhì)和腐殖酸的直接提取效率較低，而陽離子交換樹脂(CER)法通過爭奪絡(luò)合態(tài)Ca2+和Mg2+等金屬離子，可實現(xiàn)EPS組分的自然釋放，后者通常適用于處理絮狀污泥[5，9，11]。此外，受制于顆粒污泥的內(nèi)部傳質(zhì)，采用單位功率(J/mL)優(yōu)化后的超聲波法可顯著提高后續(xù)工序?qū)PS的提取效率[14-15]。

2　不同種污泥的EPS組成特征

從反應(yīng)器內(nèi)溶解氧條件、微生物營養(yǎng)類型和污泥空間形態(tài)3個方面，對文獻(xiàn)報道中不同污泥的EPS組成情況(表2)進(jìn)行歸類分析。

盡管EPS組分與提取方法、負(fù)荷條件和泥齡(SRT)長短等密切相關(guān)，但好氧微生物的增殖速率(μ)遠(yuǎn)大于厭氧菌，因此，在表2中好氧污泥的EPS總量普遍更高，厭氧污泥中含有更多的腐殖酸類物質(zhì)。當(dāng)活性污泥由好氧轉(zhuǎn)至厭氧環(huán)境時，由于脂類載體的流失，EPS中的蛋白質(zhì)含量會有所降低，厭氧/好氧條件下的EPS比值為0.59～0.91[13，20]。對于好氧顆粒污泥而言，設(shè)置較高的曝氣速率(2.0～6.0 L/min)，可提供充足的DO和水力剪切條件，明顯增強微生物活性(SOUR值)和污泥表面疏水性，有效促進(jìn)EPS(尤其是PN和PS)的分泌，有利于維持密實的顆粒結(jié)構(gòu)和光滑的泥相界面[21]。然而，在低營養(yǎng)條件下的過度曝氣又會導(dǎo)致較強的內(nèi)源呼吸作用，使EPS中可用作能源的聚多糖含量明顯減少[22]。

表1　常用EPS提取方法的效能比較

表2　不同污泥樣品中EPS的組成

注：CSTR.連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器;SBR.序批次反應(yīng)器；UASB.上流式厭氧污泥床；EGSB.厭氧膨脹顆粒污泥床。

Note：CSTR was continuous stirred tank reactor；SBR was sequence batch reactor；UASB was upflow anaerobic sludge blanket digestion；EGSB was anaerobic expanded granular sludge bed.

出于維持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的需要，顆粒污泥中緊密型EPS的含量要明顯高于絮狀污泥[5，9]。在大多數(shù)情況下，以易降解有機物為生長基質(zhì)時，顆粒污泥EPS中強疏水性的蛋白質(zhì)要多于親水性的聚多糖，PN/PS比值在1～6[27]。但在實際廢水的處理過程中，兩者的比值可能出現(xiàn)顛倒。例如，Ni等[28]利用中試規(guī)模的SBR反應(yīng)器，以COD僅為170 mg/L的低濃度市政污水為基質(zhì)培養(yǎng)好氧顆粒污泥，運行300 d后平均粒徑穩(wěn)定在0.2～0.8 mm，其EPS的PN/PS比值僅為0.4～0.5。比較特別的是，由EPS與微生物共同構(gòu)成的層狀空間結(jié)構(gòu)是Canon顆粒污泥實現(xiàn)全自養(yǎng)脫氮功能的重要原因。其中，分布于顆粒表面的氨氧化菌可獲得充足的DO，通過完成亞硝化步驟為內(nèi)部的厭氧氨氧化菌提供生長基質(zhì)，而后者在被大量EPS包裹的情況下，才能在嚴(yán)格厭氧的環(huán)境中逐漸富集[9]。

注：a.對比圖；b.蛋白質(zhì)(藍(lán)色)；c.α-聚多糖(紅色)；d.β-聚多糖(藍(lán)色)；e.脂類(粉色)；f.b-e合成圖。Note：a.Contrast figure；b.Proteins(green)；c.α-polysaccharides(red)；d.β-polysaccharides(blue)；e.Lipids(pink)；f.b-e Composite image.圖1　厭氧顆粒污泥接觸納米ZnO顆粒前后胞外聚合物的FISH-CLSM視圖Fig.1　FISH-CLSM images of the EPS of anaerobic granule sludge with or without the exposure of nano-scale ZnO particles

注：a.所有細(xì)菌(藍(lán)色)；b.亞硝酸鹽氧化菌(綠色)；c.氨氧化菌(紅色)；d.異養(yǎng)菌(黃色)；e.合成圖。Note：a.All bacteria(blue)；b.Nitrite oxidizing bacteria(green)；c.Ammonia oxidizing bacteria(red)；d：Heterotrophic bacteria(yellow)；e.Merge image.圖2　好氧顆粒污泥中功能菌與EPS的FISH-CLSM視圖Fig.2　FISH-CLSM images of the EPS of aerobic granule sludge

作為傳統(tǒng)“先提取、后測定”研究方法的重要補充，利用熒光原位雜交-激光共聚焦掃描顯微鏡(FISH-CLSM)技術(shù)，可以更加直觀地表征功能菌與EPS組分的空間分布情況，為建立污泥結(jié)構(gòu)與性能之間的響應(yīng)關(guān)系提供了研究平臺[7，29]。Mu等[8]借助FISH-CLSM技術(shù)，比較了厭氧顆粒污泥在接觸納米ZnO顆粒前后，EPS組分分布的變化情況(圖1)。圖2給出了好氧顆粒污泥中各類功能菌與主要EPS組分的相對位置[30]。

3　結(jié)論與展望

綜上所述，在常用的EPS提取方法中，甲醛-NaOH法能在有效保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時獲得較高的提取效率，因而被普遍推薦。但對于顆粒污泥而言，設(shè)置超聲波預(yù)處理工序是值得借鑒的。作為對傳統(tǒng)方法的補充，F(xiàn)ISH-CLSM技術(shù)的應(yīng)用能更好地反映微生物與EPS組分的空間分布與潛在聯(lián)系，已成為今后研究EPS相關(guān)功能的重要手段。

實際上，不同種污泥的EPS組成特征與反應(yīng)器運行條件、微生物類型和污泥空間形態(tài)等條件都密切相關(guān)，很難做出準(zhǔn)確概括。但可以明確的是，EPS是微生物聚集體自適應(yīng)外界環(huán)境變化的自然產(chǎn)物。EPS的大量分泌在維持污泥結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、改善界面物化特性的同時，有助于截留生長周期較長的自養(yǎng)微生物，實現(xiàn)不同功能菌的分層分布，這對于培養(yǎng)全自養(yǎng)脫氮顆粒污泥至關(guān)重要。當(dāng)前，隨著生物處理技術(shù)的快速發(fā)展，有必要以污泥性能和結(jié)構(gòu)為出發(fā)點，建立EPS類型分布與微生物種群結(jié)構(gòu)之間的響應(yīng)關(guān)系，探明特定功能菌分泌EPS的調(diào)控機理，以期為工藝操作的優(yōu)化提供理論支撐。

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Extraction Method and Structural Characteristics of Extracellular Polymeric Substances in Different Sludge Samples

ZHANG Nian-qi1, QIAN Fei-yue1,2*, WANG Xiao-yi1et al

(1.College of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou, Jiangsu 215009; 2. Jiangsu High Education Collaborative Innovation Center of Water Treatment Technology and Material, Suzhou, Jiangsu 215009)

According to the functional and structural characteristics of sludge in wastewater biological treatment systems, the performance comparison among the extraction methods of extracellular polymeric substances (EPS) were conducted in this research. The EPS composition of different sludge samples were also analyzed, based on dissolved oxygen level in reactors, microbe nutritional types and spatial structure etc. In addition, the important role of EPS component on cultivation of some microbial aggregates, such as completely autotrophic nitrogen removal granular sludge, was emphasized.

Extracellular polymeric substances; Extraction method; Sludge type; Protein; Polysaccharide

國家自然科學(xué)基金項目(51308367)；江蘇省高校自然科學(xué)研究基金項目(15KJB610013)；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510332049X)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目。

張念琦(1994- )，女，河南焦作人，本科生，專業(yè)：環(huán)境工程。*通訊作者，講師，博士，從事水污染控制化學(xué)研究。

2016-06-13

X 703.1

A

0517-6611(2016)24-013-04