羅 雯， 石路懷

(1.南昌師范學院生物系，江西南昌 330032；2.西安文理學院生物與環(huán)境工程學院，陜西西安 710065)

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具有解鉀活性假單胞菌的分離與鑒定

羅 雯1, 2， 石路懷1

(1.南昌師范學院生物系，江西南昌 330032；2.西安文理學院生物與環(huán)境工程學院，陜西西安 710065)

[目的]分離并鑒定具有解鉀活性假單胞菌。[方法]以農田土壤為樣本，在鉀長石粉為唯一鉀源的選擇性培養(yǎng)基上分離并純化解鉀菌，并通過形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析對分離到的細菌進行鑒定。[結果]經梯度稀釋涂布和平板劃線分離，經初篩獲得8株生長良好并具有解鉀透明圈的細菌。將初篩后獲得的細菌菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，利用原子吸收分光光度法測定發(fā)酵上清液中的速效鉀含量，從中篩選出解鉀能力較強的1株假單胞菌K3。通過形態(tài)觀察發(fā)現，該菌株為革蘭氏陰性桿菌。16S rDNA序列分析結果表明，該菌株與熒光假單胞菌F113親緣關系最近，初步確定該菌株屬假單胞菌屬。[結論]該研究為微生物鉀肥的開發(fā)提供了新的試材。

解鉀菌；分離；鑒定；假單胞菌

鉀在植物體內占干物質量的0.2%～4.1%，僅次于氮，是肥料三要素之一。據土壤普查資料可知，我國耕地缺鉀面積約占70%，其中嚴重缺鉀的耕地約占45%[1]。按照平均施肥的概念，根據中國土壤狀況，我國農業(yè)部門推薦的氮、磷、鉀施肥比例為1∶0.4∶0.3，但目前我國肥料中實際比例僅為1∶0.37∶0.17，遠小于發(fā)達國家的氮、磷、鉀施肥比例(1∶0.5∶0.4)，肥力不足已經成為限制作物產量和品質提高的重要因素之一[2-3]。

經過50多年的發(fā)展，我國鉀鹽鉀肥工業(yè)取得了巨大的成效，但鉀資源相對匱乏的狀況依然未能改變[4-6]。美國地質調查局數據表明，我國已探明的鉀鹽資源僅占世界總儲量的2.21%，且分布不均，這一狀況嚴重限制了我國鉀肥的開發(fā)與利用。2013年我國鉀肥總產量不到世界總產量的1/10，鉀肥消費量卻接近世界消費總量的1/6，鉀鹽已經成為我國7種大宗緊缺礦產之一[7-8]。探索鉀肥高效利用的措施和替代技術，對于解決我國鉀肥對外依賴度高的問題以及保證我國農業(yè)生產安全具有重要意義。

已有很多學者的研究表明，土壤中存在的大量解鉀菌可以將不溶性的鉀轉化為可溶性鉀，被植物吸收利用；同時，有些解鉀菌還能分泌不同的植物激素，起到促進植物生長與改善土壤微環(huán)境的作用[9-10]。由于微生物菌株具有無毒、無污染等優(yōu)點，所以能克服過量施用化肥對生態(tài)環(huán)境帶來的負面影響。因此，從土壤中分離獲得解鉀菌并進一步開發(fā)成微生物鉀肥，對于解決我國農田土壤缺鉀現狀并促進農業(yè)生產具有重要意義。筆者從陜西省西安市農田土壤采集土樣，分離并篩選到1株解鉀菌，并通過16S rDNA序列分析對其進行鑒定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基。

1.1.1.1篩選培養(yǎng)基。每100 g培養(yǎng)基中含有蔗糖0.5 g、Na2HPO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeCl30.000 5 g、CaCO30.01 g、鉀長石粉0.1 g(去離子水5次清洗)、瓊脂2.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌15 min后備用。

1.1.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基。每100 g培養(yǎng)基中含蔗糖1.5 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、CaSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.02 g、鉀長石粉0.5 g、pH 7.0～7.5、121 ℃下滅菌15 min，備用。

1.1.1.3斜面培養(yǎng)基。每100 g培養(yǎng)基中含牛肉膏0.4 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、瓊脂2.0 g、pH 7.2～7.5，121 ℃下滅菌15 min后備用。

1.1.2主要儀器。原子吸收分光光度計(AA-6300C型，日本島津公司)。

1.2方法

1.2.1解鉀菌的篩選。準確稱取土壤樣品1 g，放入裝有99 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中振蕩搖勻，梯度稀釋，取稀釋倍數為10-2和10-4的稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d。選擇生長旺盛并具有明顯溶鉀圈的菌株，采用平板劃線法進行3次純化。根據菌落形態(tài)和鏡檢觀察結果，將分離到的菌株編號并斜面擴大培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2解鉀菌解鉀能力的測定。將培養(yǎng)24 h的斜面菌種用6 mL無菌水沖洗后，移取菌液5 mL接種到裝有95 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中(含0.5 g鉀長石粉)，每個菌株做3個平行，同時以不接菌作為空白對照，28 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)液3 000 r/min離心10 min，并用孔徑0.22 μm濾膜過濾，除去菌體和殘渣，收集上清液，采用原子吸收分光光度法測定可溶性鉀含量，比較不同菌株的解鉀能力。

1.2.3解鉀菌16S rDNA基因序列分析。使用基因組DNA純化試劑盒(為Promega公司產品)提取菌體的DNA，將提取物溶于水中，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?6S rDNA基因序列分析采用細菌16S rDNA基因通用引物[11]，以基因組DNA為模板進行擴增，上游引物序列為5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，下游引物序列為5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR擴增體系(50 μL): 10×TaqBuffer(含Mg2+) 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 4.0 μL、引物( 25 pmol/μL) 各1 μL、模板DNA 0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O 38 μL。PCR反應條件: 95 ℃預變性5 min、94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次，72 ℃終末延伸10 min;反應結束后4 ℃下保存。PCR產物使用回收試劑盒(Promega產品)純化，送交上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結果在GenBank核酸數據庫中進行序列比對，選取同源性較高的序列，使用MEGA 6.06軟件，基于鄰接法(Neighbor-joining method)構建菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2　結果與分析

2.1菌落和菌體的基本特征將土壤懸液均勻涂布在篩選培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)，28 ℃下培養(yǎng)2～3 d，挑取菌落大、黏性強、長勢良好的菌株，采用平板劃線法進行純化，經初步篩選獲得有明顯解鉀透明圈的8個菌株。將初篩菌株劃線培養(yǎng)，28 ℃條件下在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征；同時，挑取菌體進行鏡檢觀察，結果見表1。

2.2速效鉀產生能力的檢測對初篩的8株菌進行搖瓶解鉀試驗，測定其釋鉀效率。取28 ℃下振蕩培養(yǎng)7 d的發(fā)酵培養(yǎng)液上清，以不接種為對照，采用原子吸收分光光度法測定各菌株發(fā)酵培養(yǎng)上清中速效鉀含量，結果見圖1。

注：NC為陰性對照。Note:NC stands for negative control.圖1　各菌株解鉀能力的比較Fig.1　Comparison of potassium-releasing abilities of strains

菌株編號Straincode菌落形態(tài)Colonymorphology菌體形態(tài)Microbialmorphology革蘭氏染色GramstainingK1菌落半透明,凸起,乳白色桿狀-K2菌落中央白色,邊緣透明,稍呈圓形圓形-K3菌落透明,油滴狀,中央凸起,圓形長桿狀-K4菌落光滑,乳白色,中央小凸起短桿狀-K5菌落半透明,邊緣光滑,乳白色串聯桿狀-K6菌落白色,邊緣清晰,中央凸起短桿狀-K7菌落半透明,中央略厚,邊緣不規(guī)則串聯桿狀+K8菌落土灰色,表面光滑,中央隆起長桿狀-

圖2　K3菌株平板菌落形態(tài)(A)及油鏡觀察結果(B) (100×) Fig.2　Colony morphology(A) and microscopic observation(B) of strain K3 (100×)

所選菌株中K3菌株產生速效鉀的能力最強，其培養(yǎng)液中速效鉀含量達到4.7 mg/L，與對照(1.1 mg/L)和其他7株菌相比，釋鉀能力較強。K3菌株的菌落形態(tài)及鏡檢結果見圖2。

2.3K3菌株16S rDNA基因序列分析將菌株K3 16S rDNA的測序結果輸入GenBank數據庫，利用BLAST程序，將測得到的基因序列與GenBank數據庫中核酸數據進行同源性分析，獲取同源性較高的相鄰的種、屬的16S rDNA序列，并利用MEGA 6.06軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可以看出，K3菌株與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)F113的親緣關系最近，序列相似性達到99%，因此可初步鑒定K3菌株屬假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

圖3　K3菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3　16S rDNA phylogenetic tree of strain K3

3　結論與討論

筆者從陜西西安農田土壤中利用硅酸鹽細菌培養(yǎng)基進行解鉀菌的分離與篩選，用是否產生解鉀透明圈作為初篩條件，初步分離到8個菌株。但是，對8菌株發(fā)酵培養(yǎng)液上清中速效鉀含量的變化進行檢測，結果卻只有K3菌株具有明顯的解鉀活性，其他菌株發(fā)酵液上清中速效鉀含量與對照相比沒有顯著變化。這說明解鉀透明圈不能作為判斷細菌解鉀能力的唯一指標。麻瑞陽[12]研究表明在鉀細菌培養(yǎng)基上不產生解鉀透明圈的細菌，也有可能具有較高的解鉀活性。因此，在解鉀菌篩選時應對所有菌落形態(tài)飽滿的菌株進行進一步解鉀活性復篩，以降低漏檢的概率。

通過16S rDNA基因序列分析，K3菌株與熒光假單胞菌 F113的序列相似性達到99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上親緣關系最近。目前，國際公認的硅酸鹽菌種主要包括膠質芽孢桿菌(Bacillusmucilagionsus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)[13]和土壤芽抱桿菌(Bacillusedaphicus)，均屬于芽孢桿菌屬。但是，近年來國內外學者已經報道的新分離硅酸鹽細菌的分類地位是多樣的[14-19]，如固氮菌屬(Azotobactersp.)、根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)、膠質類芽孢桿菌(Paenibacillusmucilaginosus)、伯克氏菌(Burkholderiasp.)等。這些具有較高解鉀活性的不同種類細菌充分證明自然界的解鉀資源是非常豐富的，該研究結果再次佐證了這個觀點。同時，熒光假單胞菌是目前國內外學者在植物病害生物防治領域的研究重點之一[20]。因此，該研究中分離獲得的具有較強解鉀能力的菌株K3，有待進一步研究。

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Isolation and Identification of a Potassium-releasing Strain ofPseudomonassp.

LUO Wen1, 2, SHI Lu-huai1

(1.Biology Department, Nanchang Normal University, Nanchang, Jiangxi 330032; 2.School of Biological and Environmental Engineering, Xi’an University of Arts and Science, Xi’an, Shaanxi 710065)

[Objective] To isolate and identify a potassium-releasing strain ofPseudomonassp..[Method] With farmland soil as the sample, potassium-releasing bacteria was isolated and purified on the selective medium in which potash feldspar powder was used as the only source of potassium.Morphologic observation and 16S rDNA gene sequence analysis were used to identify the isolated strains.[Result] By using the methods of gradient dilution coating and streaking inoculation, eight presumed potassium-releasing bacteria strains exhibiting clear zones were selected and inoculated into fermentation medium.The potassium contents in supernatant were determined with flame atomic absorption spectrophotometry method.Among them, a strain named K3 was verified to be with relatively high potassium-releasing ability cause the potassium contents in the supernatant of fermentation culture greatly increased comparing to the control sample.Through morphological observation it was verified to be Gram-negative rod bacteria.The 16S rDNA gene sequence analysis result showed that it had most close genetic relationship withPseudomonasfluorescensF113, thus tentatively identified asPseudomonassp..[Conclusion] This research provides new test materials for the development of microbial potash fertilizer.

Potassium bacteria; Isolation; Identification;Pseudomonassp.

南昌師范學院博士科研啟動基金資助項目(NSBSJJ2014020)。

羅雯(1974- )，女，江西南昌人，教授，博士，從事微生物學方面的研究。

2016-06-17

S 144;Q 93

A

0517-6611(2016)24-017-03