黃秀敏， 張宜靖， 李學(xué)優(yōu)， 曹 丁， 夏楓耿， 黃魁英， 林盛華

(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

?

植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

黃秀敏， 張宜靖， 李學(xué)優(yōu)， 曹 丁， 夏楓耿， 黃魁英， 林盛華

(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

[目的]在成功篩選出1株有強產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌的基礎(chǔ)上，優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，以提高其生物量。[方法]使用單因素試驗和正交試驗法對培養(yǎng)基的成分進行優(yōu)化。[結(jié)果]優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖30.00 g/L，酵母浸膏50.00 g/L，無水乙酸鈉5.00 g/L，磷酸氫二鉀2.00 g/L，檸檬酸氫二銨2.00 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，吐溫-80 1 mL/L，碳酸鈣2.00 g/L。經(jīng)優(yōu)化后植物乳桿菌發(fā)酵液的OD值從5.701增長到15.021，活菌數(shù)達7.1×109cfu/mL。[結(jié)論]優(yōu)化后的植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基降低了生產(chǎn)成本，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的研究提供了參考。

植物乳桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；發(fā)酵

乳酸菌細胞為桿狀或球狀，革蘭氏染色陽性，不產(chǎn)生過氧化氫酶，消耗葡萄糖且50%以上產(chǎn)生乳酸，不形成內(nèi)生孢子，無運動性，或僅少數(shù)有運動性[1]。乳酸菌在自然界分布廣泛，種類繁多，是動物胃腸道的優(yōu)勢菌群，具有調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群平衡、改善腸道內(nèi)環(huán)境、增強免疫力和抵抗力等多種功能[2-7]。而植物乳桿菌在酸奶、發(fā)酵香腸、面包、泡菜等發(fā)酵食品中常被用于改善食品分類，改進食品營養(yǎng)狀況，延長制品的保藏時間。植物乳桿菌也被大量用于養(yǎng)殖業(yè)中，是最常見的青貯發(fā)酵乳酸菌，還被用作微生態(tài)飼料添加劑。此外，植物乳桿菌也被用作生物防腐劑[8]。筆者對1株具有強產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以期加快植物乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)進程。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。植物乳桿菌由廣州市微生物研究所提供。

1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基?；罨陀嫈?shù)培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，牛肉浸膏10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，無水乙酸鈉5.00 g/L，磷酸氫二鉀2.00 g/L，檸檬酸氫二銨2.00 g/L，硫酸鎂 0.58 g/L，硫酸錳 0.25 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH6.8，固體培養(yǎng)基加20.00 g/L的瓊脂粉。胰蛋白胨：英國Oxoid 公司； 瓊脂粉： 廣東廣州環(huán)凱生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器。生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司；752N 型紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；pHS-25 數(shù)顯酸度計：上海雷磁儀器廠。

1.2方法

1.2.1植物乳桿菌搖瓶發(fā)酵。從新鮮種子斜面挑取1環(huán)菌體接入種子搖瓶，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，然后以3%的接種量將活化好的種子液接入發(fā)酵搖瓶，37 ℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)18 h后取樣測定OD值。

1.2.2發(fā)酵過程參數(shù)測量。

1.2.2.1菌體生物量測定。測量經(jīng)適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵液在600 nm波長處的OD值。

1.2.2.2pH的測定。用pHS-25數(shù)顯酸度計測定。

1.2.2.3菌落計數(shù)。采用平板菌落計數(shù)法。

1.2.3植物乳桿菌生長曲線的繪制。將活化好的植物乳桿菌接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，每間隔2 h取樣測定發(fā)酵液pH和OD值，以同一批次滅菌而未接入菌種的MRS液體培養(yǎng)基為參照，繪制菌體生長曲線。

1.2.4最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定。

1.2.4.1最佳碳源的確定。分別用20.00 g/L的葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖替代MRS培養(yǎng)基中的碳源，其余配方同MRS發(fā)酵培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵試驗。

1.2.4.2最佳氮源的確定。在篩選出最佳碳源的基礎(chǔ)上分別用25.00 g/L的酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、脫脂奶粉、大豆蛋白胨、硫酸銨、胰蛋白胨替代MRS培養(yǎng)基中的氮源，其余配方同MRS發(fā)酵培養(yǎng)基，做搖瓶發(fā)酵試驗。

1.2.4.3不同無機鹽、刺激因子對植物乳桿菌OD值的影響。在最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上，分別將無水乙酸鈉5.00 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、檸檬酸氫二銨2.00 g/L、硫酸鎂 0.58 g/L、硫酸錳 0.25 g/L、吐溫-80 1 mL/L、碳酸鈣2.00 g/L單一加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖瓶水平進行發(fā)酵試驗。

1.2.4.4正交試驗。采用3因素3水平L9(33)正交表進行優(yōu)化試驗，對影響菌體生物量的主要因素蔗糖、酵母浸膏和碳酸鈣進行正交試驗，以得到最佳配比。正交試驗因素與水平見表1。

表1　正交試驗因素與水平

2　 結(jié)果與分析

圖1　植物乳桿菌的生長曲線和pH變化曲線Fig.1　Change curves of pH value and growth curve of L.plantarum

2.1植物乳桿菌生長曲線由圖1可知，植物乳桿菌在MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h進入穩(wěn)定期，此時OD值最高，生物量最大，之后略有下降，因此，18 h為最佳發(fā)酵終點。由于植物乳桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸，所以隨著培養(yǎng)時間的增加，pH急劇下降，當(dāng)培養(yǎng)到18 h，pH下降幅度減小，逐漸趨于穩(wěn)定，pH的變化和植物乳桿菌的生物量變化是相符合的。

2.2最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1 最佳碳源。由圖2可知，植物乳桿菌的最佳碳源為蔗糖，其次是葡萄糖，最差是可溶性淀粉。這可能跟可溶性淀粉是多糖，不易于被植物乳桿菌利用有關(guān)。因此，選用蔗糖為最佳碳源。

圖2　不同碳源對植物乳桿菌OD值的影響Fig.2　Effects of carbon sources on the OD value of L.plantarum

2.2.2最佳氮源。由圖3可知，培養(yǎng)基中使用酵母粉和使用酵母浸膏時植物乳桿菌的OD值最高，而且差異不顯著。而使用牛肉浸膏和硫酸銨時，生物量顯著低于其他組別。酵母浸膏和酵母粉都富含蛋白質(zhì)，均衡的必需氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等在發(fā)酵過程中給植物乳桿菌提供了充足的氮源之外，還提供大量的微量元素和氨基酸，促進發(fā)酵。但是由于市面上酵母浸膏的價格遠低于酵母粉，考慮到成本問題，所以選擇酵母浸膏作為最佳氮源。

圖3　不同氮源對植物乳桿菌OD值的影響Fig.3　Effects of nitrogen source on the OD value of L.plantarum

2.2.3不同無機鹽、刺激因子對植物乳桿菌OD值的影響。無機鹽也是細菌生長不可缺少的物質(zhì)，無機鹽的主要作用是維持菌體的滲透壓，另一方面一些離子對細菌體內(nèi)的酶有激活作用。乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳酸使pH下降，故培養(yǎng)基中需要加入一些緩沖鹽來調(diào)節(jié)pH，維持滲透壓，從而使乳酸菌更好地生長。而筆者考慮到該株植物乳桿菌產(chǎn)酸能力很強，同時也使用碳酸鈣作為對照。由圖4可知，不同的無機鹽對植物乳桿菌生物量的增值有不同的影響，其中碳酸鈣最顯著，這可能是由于碳酸鈣在發(fā)酵中后期由于乳酸急劇增加而起到中和劑的作用，游離的碳酸根離子不穩(wěn)定，在水中很容易水解產(chǎn)生碳酸氫根離子和氫氧根離子。這在一定程度上為植物乳桿菌菌體增值創(chuàng)造了較適宜的培養(yǎng)環(huán)境。

圖4　不同無機鹽對植物乳桿菌OD值的影響Fig.4　Effects of inorganic salt on the OD value of L.plantarum

2.2.4正交試驗結(jié)果。由表2可知，最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A2B2C1，即3%蔗糖、5%酵母浸膏、2%碳酸鈣。根據(jù)極差大小可以得出對植物乳桿菌生物量影響的顯著性順序為酵母浸膏>蔗糖>碳酸鈣，即培養(yǎng)基中初始的酵母浸膏含量對植物乳桿菌生物量的影響最大。

表2　正交試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3驗證試驗結(jié)果在搖瓶中使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行驗證試驗，植物乳桿菌OD值達15.021，活菌數(shù)達7.1×109cfu/mL，與初始OD值5.701、活菌數(shù)1.4×109cfu/mL相比，活菌數(shù)提高了407%。

3　結(jié)論與討論

試驗以1株具有強產(chǎn)酸能力的植物乳桿菌為研究對象，通過單因素和正交試驗設(shè)計確定了優(yōu)化后的培養(yǎng)基為蔗糖30.00 g/L，酵母浸膏50.00 g/L，無水乙酸鈉5.00 g/L，磷酸氫二鉀2.00 g/L，檸檬酸氫二銨2.00 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，吐溫-80 1 mL/L，碳酸鈣2.00 g/L，優(yōu)化后發(fā)酵搖瓶的OD值為15.021，活菌數(shù)達7.1×109cfu/mL，與初始OD值5.701、活菌數(shù)1.4×109cfu/mL相比，發(fā)酵液活菌數(shù)是原來的5倍，顯著增加了植物乳桿菌的菌體生物量。此外，優(yōu)化后的培養(yǎng)基用廉價易得的國產(chǎn)組分代替昂貴的進口成分，生產(chǎn)成本為原配方的2/3，大大降低了生產(chǎn)成本，為今后工業(yè)化生產(chǎn)植物乳桿菌奠定了基礎(chǔ)，具有較好的經(jīng)濟效益、社會效益和發(fā)展前景。

[1] 金世琳.乳酸菌的科學(xué)與技術(shù)[J].中國乳品工業(yè)，1998，26(4)：14-16.

[2] 劉丹，潘道東.直投式乳酸菌發(fā)酵劑增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2005，26(9)：204-206.

[3] 羅予，李金陵，蔡訪勤.口服乳酸桿菌對大鼠糞便正常菌群的影響[J].微生物學(xué)報，1992，27(3)：295-297.

[4] 郭維烈.實用微生物技術(shù)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社，1991:60-70.

[5] HLEMING H P.Fermented vegetables[M]//ROSE A. Economic microbiolgy: Fermented food. New York: Academic Press,1982: 227.

[6] DAESCHEL S A.Selection of lactic acid bacteria for use in vegetable fermentations[J].Food microbiology, 1984,1:303-313.

[7] 顧瑞霞，謝繼志.乳酸菌與人體保健[M].北京：科學(xué)出版社，1995:1-5.

[8] SENOK A C,LSMAEEL A Y,BOTTA G A.Probiotics:Facts and myths[J].Clin Microbiol Infect,2005,11:958-966.

Optimization of Fermentation Medium forLactobacillusplantarum

HUANG Xiu-min, ZHANG Yi-jing, LI Xue-you et al

(Guangzhou Institute of Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510663)

[Objective] To optimize the fermentation medium, and to enhance the biomass ofLactobacillusplantarumbased on successful screening of aL.plantarumwith strong acid production. [Method] The single factor test and orthogonal test were used to optimize the composition of the culture medium. [Result] The optimized fermentation medium was as follows: 30.00 g/L sucrose, 50.00 g/L yeast extract, 5.00 g/L anhydrous sodium acetate, 2.00 g/L dipotassium hydrogen phosphate, 2.00 g/L diammonium hydrogen citrate, 0.58 g/L magnesium sulfate, 0.25 g/L manganese sulfate, 1 mL/L Tween-80, and 2.00 g/L calcium carbonate.ODvalue ofL.plantarumbroth after optimization increased from 5.701 to 15.021, viable count reached 7.1 × 109cfu/mL.[Conclusion] The production cost was reduced by the optimized fermentation medium, which provided reference for the study of the subsequent industrial production.

L.plantarum; Optimization of culture medium; Fermentation

廣東省省級科技計劃項目(2015B040403004)；廣東省廣州市科技計劃項目(201605040004)。

黃秀敏(1990- )，女，廣東梅州人，助理工程師，從事微生物研究。

2016-06-30

S 182

A

0517-6611(2016)24-006-02