樊永軍，趙艷玲，陳秀莉，閆 偉

(1 包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014030；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，呼和浩特 010018)

?

2種塊菌的物種分子鑒定與系統(tǒng)地位分析

樊永軍1，趙艷玲1，陳秀莉1，閆 偉2*

(1 包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014030；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，呼和浩特 010018)

以采自內(nèi)蒙古賀蘭山地區(qū)的2種塊菌為實(shí)驗(yàn)材料，分別運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行物種鑒定，并通過與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)信息比對(duì)，利用Mega5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系并確定2種塊菌的進(jìn)化地位。結(jié)果表明：兩菌株子囊果都為地下生；其中，菌株order-a為灰黃色，近球形到不規(guī)則形，較硬，表面被覆微絨毛；菌株tuber-b呈黃褐色，質(zhì)地均勻，表面有疣狀物，頂端呈凹陷狀，全株帶有干果般特殊的香氣。經(jīng)分子生物學(xué)方法分析認(rèn)為菌株order-a為塊菌屬的一種，tuber-b為冬塊菌(Tuberbrumale)， 并初步確定為內(nèi)蒙古新記錄種。

塊菌；ITS；物種鑒定；系統(tǒng)地位

塊菌(truffles)屬于子囊菌亞門(Ascamycotina)塊菌科(Tuberaceae)塊菌屬(Tuber)，是與樹木共生的外生菌根真菌[1]。迄今為止，已知的塊菌種屬呈現(xiàn)世界性分布，全球范圍內(nèi)所描述的塊菌屬真菌估計(jì)在60種以上，據(jù)《菌物詞典》(第9版)記載，一共確定了63個(gè)種，主要產(chǎn)自西班牙、意大利、法國(guó)等歐洲國(guó)家，分布于南溫帶的森林地區(qū)和北溫帶的森林地區(qū)，只有極少數(shù)分布于干旱的荒漠、半荒漠地帶和亞熱帶的林區(qū)[2]。塊菌在中國(guó)的分布地區(qū)主要是西南地區(qū)的云南和四川，海拔在 1 600～2 600 m的針葉林或針闊混交林下，西北的新疆和西藏等地。此外在河北、山西、湖南、吉林、甘肅、遼寧、北京、福建、湖北和臺(tái)灣等地均有分布。到目前為止，不同文獻(xiàn)報(bào)道在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的塊菌種類有28種之多。由于塊菌的研究在中國(guó)起步比西方國(guó)家晚，所以不同文獻(xiàn)對(duì)于中國(guó)塊菌名錄記載的數(shù)量和種類也有所不同。如：徐阿生等[3]報(bào)道了21個(gè)種，Zhuang等[4-5]報(bào)道了13個(gè)種，陳毅堅(jiān)等[6]報(bào)道了25個(gè)種，陳應(yīng)龍等[7]報(bào)道了28個(gè)種，陳娟等[8]報(bào)道了16個(gè)種，任德軍等[9]報(bào)道了20個(gè)種，方明[10]報(bào)道則認(rèn)為在中國(guó)確認(rèn)分布的種有15個(gè)，郭尚等[11]報(bào)道了26種。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法常常因?yàn)榈乩砗铜h(huán)境條件等因素的影響而發(fā)生分歧，在國(guó)際上分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)被引入到塊菌鑒定等研究中，如Percudani 等[12]利用18S rDNA研究了Terfeziaceae和Tuberaceae在Pezizales中的系統(tǒng)發(fā)育位置；Urbanelli 等[13]利用同工酶分析對(duì)塊菌的系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行了研究；Rubini 等[14]利用核糖體DNA的不同區(qū)段特異性差異來區(qū)別T.brumale、T.melanosporum和T.indicum；Mello等[15]利用18S rDNA的區(qū)段將T.borchii和T.maculatum進(jìn)行了區(qū)分等。本研究旨在形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)分類的基礎(chǔ)上，利用ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因核酸序列分析對(duì)2株未知塊菌進(jìn)行分類鑒定，并利用相關(guān)軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其分類演化地位。

1 研究地概況

賀蘭山自然保護(hù)區(qū)位于N38°20′50″～39°12′13″，E105°41′54″～106°05′03″。山體大體呈南北走向，南北長(zhǎng)86 km，東西寬8 km，屬陰山山系?？偯娣e為67 709.9 hm2。氣候具有明顯的垂直分布規(guī)律，山麓與山頂氣候差異大，山麓年降水量250～300 mm，年平均氣溫8.5 ℃，≥10 ℃年積溫3 370 ℃，而山頂2 910 m處，年降水量438 mm，年平均氣溫4 ℃，≥10 ℃年積溫在3 000 ℃以下，降水主要集中在7～8月份。同時(shí)，土壤垂直分異明顯，隨海拔高度和植被類型的變化有規(guī)律地分布，灰鈣土是在荒漠草原形成的一類地帶性土壤，分布于海拔1 900 m以下為山區(qū)及山前洪積扇地帶，這一地段環(huán)境干旱，地層瘠薄，植被稀疏，其間真菌的分布較少，只有少數(shù)耐干旱的腹菌類生長(zhǎng)；山地灰褐土分布于海拔1 900～3 100 m，含有機(jī)質(zhì)較多，結(jié)構(gòu)良好，是賀蘭山高等真菌最繁盛的地帶，其中海拔1 900～2 350 m的油松林、山楊林及虎棒子灌叢下為山地普通灰褐土，呈微堿性，含水量略低；海拔2 350～3 100 m為青海云杉純林，其下為山地淋溶灰褐土，表面有數(shù)厘米厚的苔鮮層，呈中性，比較濕潤(rùn)，此段適宜高等真菌的生長(zhǎng)發(fā)育；海拔3 100 m以上是亞高山灌叢與草甸植被，為山地草甸土，其間有少量大型真菌分布[16]。

2 材料和方法

2.1 材 料

實(shí)驗(yàn)樣品于2015年2月采自內(nèi)蒙古賀蘭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，生境為青海云杉林+苔蘚(表1)。

2.2 方 法

2.2.1 形態(tài)學(xué)分類鑒定 (1) 外部形態(tài)觀察 觀察指標(biāo)：子實(shí)體的外部形態(tài)、顏色；菌體表面是否具疣狀突起、基部是否凹陷；菌脈的密集程度、粗細(xì)，以及孢子囊、孢子的形態(tài)等。

(2) 顯微結(jié)構(gòu)觀察 采用徒手切片法和石蠟切片法，觀察孢子囊的形狀、大小、壁厚，以及孢子的數(shù)目、大小、形狀及表面的紋飾(網(wǎng)格狀、刺狀或網(wǎng)格-刺狀)等。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定與分析 (1) PCR擴(kuò)增 取少量經(jīng)形態(tài)、解剖學(xué)方法分類的2種供試子實(shí)體約50～100 mg，采用傳統(tǒng)CTAB法進(jìn)行總DNA提取。

本實(shí)驗(yàn)中PCR反應(yīng)所需試劑為一管便攜式2×Master Mixture。rDNA的擴(kuò)增引物為ITS1F和ITS4[17-18]，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI(PE)-2700 PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并記錄擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的圖譜。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)后，運(yùn)用天根生化科技有限公司的離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒從含有擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的瓊脂糖凝膠上回收、純化，具體操作依試劑盒的操作手冊(cè)。

用純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和引物直接測(cè)序。測(cè)序均由上海生工生物工程公司完成。

(2) DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 對(duì)測(cè)得的供試菌株rDNA ITS區(qū)段DNA序列運(yùn)用Blast軟件在DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源序列并進(jìn)行比較，在此基礎(chǔ)上利用Mega5.1軟件，采用Neighbor-Joining相鄰比對(duì)法對(duì)order-a、tuber-b的同源性及相似性進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其分類地位。

表1 樣品采集信息

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)特征

菌株order-a如圖1，A、B所示，子囊果地下生；灰黃色；近球形到不規(guī)則形；較硬；表面被覆微絨毛。包被分2層：外層淡黃色到淡黃褐色，內(nèi)層透明到淡黃色，為交織組織至薄壁組織，少見表皮組織。包被內(nèi)子實(shí)層具迷走狀脈紋和褐色菌肉組織。子實(shí)層致密，呈乳黃色大理石狀，菌脈團(tuán)狀，封閉，迷走狀，在多處可到達(dá)包被邊緣處。子囊近球形、闊橢圓形到不規(guī)則形；無柄或少見有柄，內(nèi)含1～3(4)個(gè)子囊孢子；在產(chǎn)孢組織內(nèi)自由排列。

菌株tuber-b如圖1,C、D所示，其特征為子囊果地下生；呈黃褐色，質(zhì)地均勻，表面有疣狀物，頂端呈凹陷狀，全株帶有干果般特殊的香氣。子實(shí)層較松散，在子實(shí)層內(nèi)肉眼可見黑色顆粒狀子囊，菌脈封閉，呈迷走狀。切面呈現(xiàn)褐色，具色澤較淺的大理石狀紋理。產(chǎn)孢組織顏色為灰黑色，子囊呈近球形或不規(guī)則形，無柄，內(nèi)含幼嫩孢子1～5(6)、成熟孢子12～14個(gè)，孢子圓球形、橢圓形至長(zhǎng)橢圓形，黃褐色，表面有密集的刺，于產(chǎn)孢組織內(nèi)自由排列。

3.2 PCR擴(kuò)增

從供試菌株中均提取到基因組DNA，經(jīng)電泳和凝膠分析儀檢測(cè)，提取的DNA在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后均表現(xiàn)為單一清晰條帶。經(jīng)用紫外分光光度法檢測(cè)，OD260/OD280>1.7，提取的DNA樣品溶液濃度為100 μg/mL左右，其提取質(zhì)量可滿足進(jìn)一步研究分析。以所獲得基因組DNA為模板，選取2個(gè)特有引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增ITS的部分序列，結(jié)果如圖2所示，所得產(chǎn)物片段大小700 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相一致，表明該方法提取獲得的基因組DNA質(zhì)量較好，能夠滿足基于PCR反應(yīng)的后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)。

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與分析

3.3.1 Neighbor-Joining tree的構(gòu)建 運(yùn)用GenBank 的序列局部相似性查詢系統(tǒng)(BLAST)，引用不同學(xué)者輸入基因庫(kù)中的隸屬于塊菌屬(Tuber)的ITS區(qū)段序列，即冬塊菌(Tuberbrumale)、勃氏塊菌(T.borchii)、夏塊菌(T.aestivum)、加洲塊菌(T.californicum)，每一種塊菌引用3個(gè)序列；以及引用中甸塊菌(T.zhongdianense)序列2個(gè)、劉氏塊菌(T.liui)序列1個(gè)(表2)[19]。通過對(duì)所獲得序列進(jìn)行規(guī)范性修改及外類群的確定，然后運(yùn)用Mega5.1軟件采用Neighbor-Joining(相鄰比對(duì)法)對(duì)order-a、tuber-b的同源性及相似性進(jìn)行分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。并設(shè)置隸屬于塊菌科(Tuberaceae)的Choiromycesvenosus為外類群。

A. order-a外部形態(tài)結(jié)構(gòu)(×45)； B. order-a孢子顯微結(jié)構(gòu)圖(×400) C. tuber-b外部形態(tài)結(jié)構(gòu)(×45)；D. tuber-b孢子顯微結(jié)構(gòu)圖(×400)圖1 2種塊菌形態(tài)結(jié)構(gòu)和孢子顯微結(jié)構(gòu)A. Morphological feature of order-a (×45); B. Microstructure feature of order-a spores(×400) C. Morphological feature of tuber-b (×45); D. Microstructure feature of tuber-b spores(×400)Fig.1 Morphological feature and microstructure feature of two truffles

A.樣品PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果；B.樣品純化回收后檢測(cè)結(jié)果；a.樣品order-a的DNA跑膠結(jié)果；b.樣品tuber-b的DNA跑膠結(jié)果圖2 樣品PCR產(chǎn)物及純化回收后的電泳檢測(cè)結(jié)果A. Amplification products of the samples; B. Purification of amplification products of the samples; a is results of gel electrophoresis of order-a； b is results of Gel electrophoresis of tuber-bFig.2 The check results of PCR products and purification products of the samples

編號(hào)Number名稱NameGenBank編號(hào)GenBanknumber1冬塊菌TuberbrumaleFM205639.12FM205699.13FM205552.14勃氏塊菌TuberborchiiJN392229.15JN392228.16AF003920.17夏塊菌TuberaestivumAY226036.18HQ706000.19HQ705997.110加洲塊菌TubercalifornicumDQ478657.111DQ478659.112DQ478658.113劉氏塊菌TuberliuiDQ898182.114中甸塊菌TuberzhongdianenseDQ898186.115DQ898187.116外類群種ChoiromycesvenosusJF300146.1

3.3.2 菌株order-a系統(tǒng)進(jìn)化分析 如圖3所示，由進(jìn)化樹上可以看出，冬塊菌、勃氏塊菌、夏塊菌、加洲塊菌分別聚為一枝，支持率都高于96%。其中，中甸塊菌、劉氏塊菌另聚一枝，支持率為86%?？梢钥闯鲋械閴K菌、劉氏塊菌的親緣關(guān)系較近。而order-a與冬塊菌、勃氏塊菌聚為一大枝，支持率為95%；相比冬塊菌而言，order-a與勃氏塊菌親緣關(guān)系更近，支持率為61%；距外類群Choiromycesvenosus較遠(yuǎn)。由于支持率較低，初步確定為塊菌屬的一個(gè)種，還需進(jìn)一步采樣鑒定(圖3)。

數(shù)值表示支持率，圖4同圖3 order-a系統(tǒng)進(jìn)化樹The value representing the support rate，the same asFig.3 The phylogenetic tree of order-a

圖4 tuber-b系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree of tuber-b

3.3.3 菌株tuber-b系統(tǒng)進(jìn)化分析 如圖4，此進(jìn)化樹可分為4大枝。其中，本研究樣品為一枝；夏塊菌(T.aestivum)、加洲塊菌(T.californicum)各為一枝；中甸塊菌(T.zhongdianense)、劉氏塊菌(T.liui)聚為另一枝，其支持率為92%，說明其親緣關(guān)系較近；另一枝則為外類群(outgroup)。本實(shí)驗(yàn)樣品與所選3株冬塊菌(T.brumale)聚為一枝，支持率較高，達(dá)87%，說明其親緣關(guān)系較近。因此結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征初步確定此種為冬塊菌(圖4)。

4 討 論

本研究中經(jīng)對(duì)樣品order-a進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析，暫定order-a為塊菌屬的一種，與其他塊菌進(jìn)化分支支持率比較，order-a與勃氏塊菌親緣關(guān)系支持率為61%；但在形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)方面，二者有許多相似之處，如：勃氏塊菌子囊果地下生；灰黃色、淡黃褐色到灰褐色；近球形到不規(guī)則形；較硬；表面被毛或無。包被分2層：外層淡黃色到淡黃褐色，角胞組織，細(xì)胞多為近角形、近球形，少數(shù)角形、不規(guī)則形，表層細(xì)胞上生有毛，內(nèi)層透明到淡黃色，為交織組織至薄壁組織，少見表皮組織。產(chǎn)孢組織褐色到黑褐色，多由交織組織構(gòu)成，少有角胞組織、表皮組織；菌脈白色，較細(xì)，具分支，起源于基部。子囊近球形、闊橢圓形到不規(guī)則形；無柄或少見有柄，內(nèi)含1～3(4)個(gè)子囊孢子；在產(chǎn)孢組織內(nèi)自由排列[9]；而樣品order-a子囊果同樣地下生，黃褐色，近球形到不規(guī)則形；較硬；表面被覆微絨毛，質(zhì)地均勻。產(chǎn)孢組織顏色為黑色，孢子在未成熟時(shí)呈現(xiàn)圓筒形，成熟時(shí)則呈橢圓形，大多數(shù)含有8～12個(gè)子囊孢子，于產(chǎn)孢組織內(nèi)自由排列。二者在子囊果的形態(tài)結(jié)構(gòu)、顏色、質(zhì)地、產(chǎn)孢組織顏色等方面非常相近，只是子囊孢子數(shù)量與形狀略有差別，分析其可能與采集時(shí)間有關(guān)，但需要分子證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)。

供試菌株tuber-b經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析，其與冬塊菌親緣關(guān)系較近，支持率達(dá)87%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征定名此種為冬塊菌(T.brumale)。劉培貴等在塊菌名實(shí)考證及其資源保護(hù)一文中對(duì)冬塊菌的描述為成熟的子實(shí)體顏色為黑褐色，有特殊香味，表面也有明顯的瘤突，瘤突呈多邊形扁平的金字塔狀。產(chǎn)孢組織幼嫩時(shí)白色，成熟后變成褐色，有白色的迷宮狀的脈紋，脈紋較粗而且稀疏。子囊孢子橢圓形，長(zhǎng)橢圓形，黃褐色，表面有密集的刺，和黑孢塊菌相似。每個(gè)子囊含有子囊孢子的數(shù)目也多，可達(dá)6個(gè)孢子。冬塊菌主要分布在歐州大陸，主產(chǎn)區(qū)在法國(guó)、意大利和西班牙。冬塊菌的生境和黑孢塊菌的生境十分相似，常常發(fā)生在同一菌塘內(nèi)。土壤是石灰?guī)r發(fā)育形成的石灰土，多石質(zhì)，排水良好，pH值在7.5～8.0或以上[20]。與本研究中所采集塊菌形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，有香味，且生境為海拔2 350～3 100 m青海云杉純林下，土壤為山地淋溶灰褐土，表面有數(shù)厘米厚的苔鮮層，呈中性，所以，結(jié)合進(jìn)化樹分析結(jié)果，初步定該種為冬塊菌。但對(duì)于內(nèi)蒙古地區(qū)而言，目前尚無此名稱的相關(guān)報(bào)道。因此就本研究而言，暫認(rèn)定此種為內(nèi)蒙古地區(qū)新紀(jì)錄種。

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(編輯:宋亞珍)

Molecular Identification and Analysis of Phylogenetic Position for Two Truffles

FAN Yongjun1, ZHAO Yanling1, CHEN Xiuli1, YAN Wei2*

(1 Department of Biology Science and Technological, Baotou Teachers’ College, Baotou, Inner Mongolia 014030, China; 2 Forest College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Two truffles were taken as experimental materials which were from Helan mountain area in Inner Mongolia, and they were identified basing on the morphological and molecular methods. In the process of experiment, the DNA sequences were blasted using the GenBank, and phylogenetic trees were constructed by using Mega5.1 software. The results show that two strains of ascoma are hypogeous. Thereinto, order-a is sallow, subsphaeroidal, to irregular shape, and with microvilli on surface. And tuber-b is yellowish-brown, uniform texture, with a wart on surface, and there is a special aroma of dried fruit. Through the analysis of molecular biological methods, order-a was identified as a species ofTubergenus, tuber-b isTuberbrumale, and the tuber-b is identified as a new record species in Inner Mongolia.

Tuber; ITS; species identification; phylogenetic position

1000-4025(2016)08-1560-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1560

2016-04-20;修改稿收到日期:2016-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260132，31460188)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2014MS0302，2016MS0301)

樊永軍(1975-)，博士，教授，主要從事菌根應(yīng)用技術(shù)研究。E-mail:fanyj1975@163.com

*通信作者:閆 偉，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事菌根應(yīng)用技術(shù)研究。E-mail:weiyan@imau.edu.cn

Q949.3

A