徐旭張恒斌鐘麗梅

白細(xì)胞介素-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性研究*

徐旭①?gòu)埡惚螈夔婝惷发?/p>

目的：探討白細(xì)胞介素-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）相關(guān)性。方法：采用序列特異性引物配合聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP）技術(shù)對(duì)125例炎癥性腸病患者（研究組：UC組78例，CD組47例）與120例健康體檢者（對(duì)照組）IL-23R基因非同義單核苷酸多態(tài)性（IL-23R Arg381Gln）進(jìn)行分析，計(jì)算等位基因的表現(xiàn)頻率，評(píng)估IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性。結(jié)果：UC組、CD組、對(duì)照組A等位基因的表現(xiàn)頻率分別為5.13%、2.13%、5.83%，三者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但CD組A等位基因的表現(xiàn)頻率稍低于UC組與對(duì)照組。UC組、CD組、對(duì)照組G等位基因的表現(xiàn)頻率分別為6.41%、6.38%、5.83%，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：白細(xì)胞介素-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病無(wú)顯著的關(guān)系，個(gè)體遺傳差異性可能決定炎癥性腸病的易感性。

白細(xì)胞介素-23R； Arg381Gln； 基因多態(tài)性； 炎癥性腸病

炎 癥 性 腸 ?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是指機(jī)體腸道非特異性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的自身免疫性疾病。本病的疾病類(lèi)型主要有潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）與克羅恩?。–rohn’s Disease，CD）。文獻(xiàn)［1-2］證實(shí)，IBD與遺傳因素具有緊密的關(guān)系。IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性可能對(duì)IBD發(fā)生發(fā)展具有重要的作用［3］。本研究通過(guò)分析IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與IBD的關(guān)系，以探討IL-23R Arg381Gln對(duì)IBD患者發(fā)病機(jī)制的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月-2015年1月本院確診為IBD漢族患者125例作為研究組，男60例，女65例，年齡12～87歲，平均（45.62±15.23）歲，其中潰瘍性結(jié)腸炎78例作為UC組，克羅恩病47例作為CD組。同期選取健康體檢者120例作為對(duì)照組，男58例，女62例，年齡11～85歲，平均（45.59±15.17）歲。各組患者在性別、年齡等一般資料方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。全部研究對(duì)象臨床資料完整，自愿參加本研究試驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) （1）納入標(biāo)準(zhǔn)：IBD的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)IBD診治共識(shí)意見(jiàn)［4］。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與哮喘等自身免疫性疾病，合并肝腎功能障礙，心肺功能不全與精神性疾病患者。

1.3方法 （1）制備基因組DNA：全部研究對(duì)象收集外周血樣本5 mL，置于二乙胺四乙酸二鉀（Ethylenediaminetetraacetic Acid-K2，EDTA-K2）抗凝試管內(nèi)，采用基因組DNA提取試劑盒 （Tiangen BioTech Beijing Co.LTD公司，中國(guó)）提取基因組DNA，根據(jù)吸光度明確DNA產(chǎn)物純度與濃度，采用去離子稀釋基因組DNA樣品至50 ng/μL。（2）IL-23R基因PCR反應(yīng)：序列特異性引物配合聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP）技術(shù)，參照基因庫(kù)（GenBank）中IL-23R基 因 序 列（NC_000001.10）， 采 用primer5.0設(shè)計(jì)引物以包含目標(biāo)位點(diǎn)（rsl 1209026）：正義：5’-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3’，反義：5’-TGGGCTGAGGACTTAGCCTCTTTAAGC CTC-3’（中國(guó)上海Sangon公司合成），PCR總體系10 μL（水2 μL+PCR主要混合物5 μL+正義反義引物2 μL+模板DNA 1 μL），反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；33個(gè)循環(huán)（95 ℃ 10 s，60 ℃30 s）；72 ℃ 15 s；4 ℃ 30 min，目標(biāo)基因片段長(zhǎng)約461 bp。（3）PCR測(cè)序反應(yīng)：PCR測(cè)序引物：5’-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3’；目的基因片段擴(kuò)增（rsl 1209026），測(cè)序反應(yīng)條件：96 ℃變性2 min，PCR循環(huán)（參數(shù)：96 ℃ 10 s；50 ℃ 5 s；60 ℃ 4 min；25個(gè)循環(huán)），擴(kuò)增完成后4 ℃保溫。醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物，電泳，采集測(cè)序圖譜（上海納欣生物有限公司）。（4）計(jì)算等位基因頻率：采用Chromas軟件，根據(jù)IL-23R目標(biāo)基因位點(diǎn)正常堿基排列序列采集目標(biāo)位點(diǎn)的等位基因，計(jì)算等位基因的表現(xiàn)頻率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用 χ2檢驗(yàn)，全部等位基因的表現(xiàn)頻率的相關(guān)數(shù)據(jù)均符合Hardy-Weinberg平衡定律，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基因組DNA與IL-23R基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 基因組DNA中A260/A280比值為1.7～1.85，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖1；IL-23R基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性分析 PCR測(cè)序反應(yīng)結(jié)果為單峰、純合基因型，rsl 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln存在單核苷酸多態(tài)性G/A，見(jiàn)圖3。CD組A等位基因的表現(xiàn)頻率稍低于UC組與對(duì)照組，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示等位基因A可能對(duì)CD具有保護(hù)作用。UC組與對(duì)照組A等位基因的表現(xiàn)頻率相近，三組IL-23R Arg381GlnGG等位基因的表現(xiàn)頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1　各組IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性比較 例（%）

圖1　IL-23R 基因組DNA電泳圖（0.8%瓊脂糖凝膠）

圖2　IL-23R 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（2%瓊脂糖凝膠）

圖3　IL-23R Arg381G1n等位基因G/A測(cè)序圖譜

3　討論

目前，關(guān)于炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）的病理原因與病理機(jī)制尚未完全明確。但遺傳因素在IBD發(fā)生與發(fā)展中具有重要的作用。文獻(xiàn)［5］表明，同卵雙生人群UC發(fā)生率為5%～20%，CD發(fā)生率為40%～60%。同時(shí)，文獻(xiàn)［6］顯示，當(dāng)一級(jí)親屬患有IBD，則IBD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)則可能增加15倍。IBD是多基因參與的自身免疫性疾病，IBD易感基因位點(diǎn)已經(jīng)成為了IBD研究的熱門(mén)領(lǐng)域之一。白細(xì)胞介素-23（Interleukin-23， IL-23）是目前針對(duì)自身免疫性疾病的重要細(xì)胞因子，IL-23功能的實(shí)現(xiàn)有賴于白細(xì)胞介素-23受體（Interleukin-23 Receptor，IL-23R）［7］。IL-23R非同義單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism. SNP）RSL 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln基因可能與IBD的發(fā)生與發(fā)展具有緊密的關(guān)系［8-10］。IL-23R定位 于染色體IP32.1-p31.2，編 碼 區(qū)2.9×103，由11個(gè)外顯子組成［11］。IL-23R通過(guò)與lL-23/IL-23R/Thl7/IL-17途徑導(dǎo)致腸黏膜非特異性炎癥反應(yīng)［12］。SNP是人類(lèi)最為常見(jiàn)的可遺傳變異基因，占已知基因多態(tài)性的90%以上［13］。通過(guò)比較CD與對(duì)照人群的全基因組掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-23R 1142位點(diǎn)上具有一個(gè)改變IL-23R氨基酸編碼的基因多態(tài)性（1142 G＞A）。1142 G＞A是一個(gè)非同義SNP，堿基G由A替代，使IL-23R氨基酸編碼的蛋白質(zhì)中的一個(gè)精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣鹊０罚≧SL 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln），從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能異常［14-16］。Arg381Gln基因在IBD患者家族中存在明顯不平衡傳遞現(xiàn)象，從而導(dǎo)致IBD疾病的發(fā)生與發(fā)展［17］。但國(guó)際上關(guān)于IL-23R Arg381Gln 與IBD的相關(guān)性研究結(jié)果差異顯著。部分研究肯定了IL-23R Arg381Gln與非猶太人群IBD患兒具有緊密的關(guān)系［18］。但部分研究則否認(rèn)IL-23R Arg381Gln與智利、日本IBD患者的關(guān)系［19］。因此，IL-23R Arg381Gln可能存在個(gè)體遺傳差異性，但關(guān)于我國(guó)關(guān)于IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性研究較為罕見(jiàn)。

本研究結(jié)果顯示，我國(guó)IL-23R Arg381Gln存在單核苷酸多態(tài)性G/A，其中CD患者IL-23R Arg381Gln的A等位基因的表現(xiàn)頻率為2.13%，稍低于UC患者（5.13%）與健康體檢者（5.83%），因此，IL-23R Arg381Gln的A等位基因可能對(duì)CD具有一定程度的保護(hù)作用。分析其原因主要為IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性（C.1142 G＞A）使IL-23R氨基酸編碼的蛋白質(zhì)中的某一個(gè)精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０罚劝滨０房勺鳛槲镔|(zhì)代謝的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其對(duì)腸道黏膜生長(zhǎng)具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，在維持腸道黏膜屏障功能與結(jié)構(gòu)中具有重要的價(jià)值［20-21］。結(jié)合本研究結(jié)果，UC、CD患者與健康體檢者IL-23R Arg381Gln等位基因的表現(xiàn)頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與IBD無(wú)顯著的關(guān)系。但相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，IL-23R Arg381Gln具有個(gè)體遺傳差異性。同時(shí)，由于本研究樣本量較小，進(jìn)一步確切的研究結(jié)果尚有待進(jìn)一步的研究探討。

綜上所述，我國(guó)IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性（l209026，C.1142G＞A，P.Arg381Gln） 與 炎 癥性腸病無(wú)顯著的關(guān)系，個(gè)體遺傳差異性可能決定炎癥性腸病的易感性。但由于樣本量較小，IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與IBD的確切關(guān)系尚有待進(jìn)一步探討。

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The Correlation Study between Interleukin-23R Arg381Gln Gene Polymorphism and Inflammatory Bowel Disease/

XU Xu，ZHANG Heng-bin，ZHONG Li-mei.//Medical Innovation of China，2016，13（26）：009-012

Objective：To study the correlation between interleukin-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease.Method：By sequence specific primers and PCR technique in 125 cases of inflammatory bowel disease（study team：UC group of 78 cases，CD group of 47 cases）and 120 healthy checkup （control group）IL-23R genes non-synonymous single-nucleotide polymorphisms were analyzed and the allele performance frequency were calculated.The correlation between IL-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease was evaluated.Result：The allele performance frequency of UC group，CD group and control group were 5.13%，2.13%，5.83%，the comparison difference among groups had no statistical significance （P＞0.05），but A allele performance frequency of CD group was slightly lower than UC group and control group.The G allele performance frequency of UC group，CD group and control group were 6.41%，6.38%，5.83%，compared among groups with no significant difference（P＞0.05）.Conclusion：It has no significant correlation between IL-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease，the individual genetic differences may determine the susceptibility of inflammatory bowel disease.

Interleukin-23R； Arg381Gln； Genetic polymorphism； Inflammatory bowel disease

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.26.003

2016-01-19） （本文編輯：蔡元元）

深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013242）

①?gòu)V東省深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院 廣東 深圳 518102

徐旭

First-author’s address：Shenzhen Baoan District Central Hospital，Shenzhen 518102，China