徐旭張恒斌鐘麗梅

白細胞介素-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關性研究*

徐旭①張恒斌①鐘麗梅①

目的：探討白細胞介素-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）相關性。方法：采用序列特異性引物配合聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP）技術對125例炎癥性腸病患者（研究組：UC組78例，CD組47例）與120例健康體檢者（對照組）IL-23R基因非同義單核苷酸多態(tài)性（IL-23R Arg381Gln）進行分析，計算等位基因的表現(xiàn)頻率，評估IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關性。結果：UC組、CD組、對照組A等位基因的表現(xiàn)頻率分別為5.13%、2.13%、5.83%，三者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但CD組A等位基因的表現(xiàn)頻率稍低于UC組與對照組。UC組、CD組、對照組G等位基因的表現(xiàn)頻率分別為6.41%、6.38%、5.83%，比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：白細胞介素-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病無顯著的關系，個體遺傳差異性可能決定炎癥性腸病的易感性。

白細胞介素-23R； Arg381Gln； 基因多態(tài)性； 炎癥性腸病

炎 癥 性 腸 ?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是指機體腸道非特異性炎癥反應導致的自身免疫性疾病。本病的疾病類型主要有潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）與克羅恩?。–rohn’s Disease，CD）。文獻［1-2］證實，IBD與遺傳因素具有緊密的關系。IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性可能對IBD發(fā)生發(fā)展具有重要的作用［3］。本研究通過分析IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與IBD的關系，以探討IL-23R Arg381Gln對IBD患者發(fā)病機制的調控作用，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月-2015年1月本院確診為IBD漢族患者125例作為研究組，男60例，女65例，年齡12～87歲，平均（45.62±15.23）歲，其中潰瘍性結腸炎78例作為UC組，克羅恩病47例作為CD組。同期選取健康體檢者120例作為對照組，男58例，女62例，年齡11～85歲，平均（45.59±15.17）歲。各組患者在性別、年齡等一般資料方面比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。全部研究對象臨床資料完整，自愿參加本研究試驗并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2納入與排除標準 （1）納入標準：IBD的診斷標準參照中華醫(yī)學會IBD診治共識意見［4］。（2）排除標準：合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎與哮喘等自身免疫性疾病，合并肝腎功能障礙，心肺功能不全與精神性疾病患者。

1.3方法 （1）制備基因組DNA：全部研究對象收集外周血樣本5 mL，置于二乙胺四乙酸二鉀（Ethylenediaminetetraacetic Acid-K2，EDTA-K2）抗凝試管內，采用基因組DNA提取試劑盒 （Tiangen BioTech Beijing Co.LTD公司，中國）提取基因組DNA，根據(jù)吸光度明確DNA產(chǎn)物純度與濃度，采用去離子稀釋基因組DNA樣品至50 ng/μL。（2）IL-23R基因PCR反應：序列特異性引物配合聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP）技術，參照基因庫（GenBank）中IL-23R基 因 序 列（NC_000001.10）， 采 用primer5.0設計引物以包含目標位點（rsl 1209026）：正義：5’-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3’，反義：5’-TGGGCTGAGGACTTAGCCTCTTTAAGC CTC-3’（中國上海Sangon公司合成），PCR總體系10 μL（水2 μL+PCR主要混合物5 μL+正義反義引物2 μL+模板DNA 1 μL），反應條件：95 ℃預變性1 min；33個循環(huán)（95 ℃ 10 s，60 ℃30 s）；72 ℃ 15 s；4 ℃ 30 min，目標基因片段長約461 bp。（3）PCR測序反應：PCR測序引物：5’-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3’；目的基因片段擴增（rsl 1209026），測序反應條件：96 ℃變性2 min，PCR循環(huán)（參數(shù)：96 ℃ 10 s；50 ℃ 5 s；60 ℃ 4 min；25個循環(huán)），擴增完成后4 ℃保溫。醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物，電泳，采集測序圖譜（上海納欣生物有限公司）。（4）計算等位基因頻率：采用Chromas軟件，根據(jù)IL-23R目標基因位點正常堿基排列序列采集目標位點的等位基因，計算等位基因的表現(xiàn)頻率。

1.4統(tǒng)計學處理 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以（）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用 χ2檢驗，全部等位基因的表現(xiàn)頻率的相關數(shù)據(jù)均符合Hardy-Weinberg平衡定律，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1基因組DNA與IL-23R基因PCR擴增產(chǎn)物 基因組DNA中A260/A280比值為1.7～1.85，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析結果見圖1；IL-23R基因PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析結果見圖2。

2.2IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性分析 PCR測序反應結果為單峰、純合基因型，rsl 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln存在單核苷酸多態(tài)性G/A，見圖3。CD組A等位基因的表現(xiàn)頻率稍低于UC組與對照組，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示等位基因A可能對CD具有保護作用。UC組與對照組A等位基因的表現(xiàn)頻率相近，三組IL-23R Arg381GlnGG等位基因的表現(xiàn)頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　各組IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性比較 例（%）

圖1　IL-23R 基因組DNA電泳圖（0.8%瓊脂糖凝膠）

圖2　IL-23R 基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖（2%瓊脂糖凝膠）

圖3　IL-23R Arg381G1n等位基因G/A測序圖譜

3　討論

目前，關于炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）的病理原因與病理機制尚未完全明確。但遺傳因素在IBD發(fā)生與發(fā)展中具有重要的作用。文獻［5］表明，同卵雙生人群UC發(fā)生率為5%～20%，CD發(fā)生率為40%～60%。同時，文獻［6］顯示，當一級親屬患有IBD，則IBD發(fā)生風險則可能增加15倍。IBD是多基因參與的自身免疫性疾病，IBD易感基因位點已經(jīng)成為了IBD研究的熱門領域之一。白細胞介素-23（Interleukin-23， IL-23）是目前針對自身免疫性疾病的重要細胞因子，IL-23功能的實現(xiàn)有賴于白細胞介素-23受體（Interleukin-23 Receptor，IL-23R）［7］。IL-23R非同義單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism. SNP）RSL 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln基因可能與IBD的發(fā)生與發(fā)展具有緊密的關系［8-10］。IL-23R定位 于染色體IP32.1-p31.2，編 碼 區(qū)2.9×103，由11個外顯子組成［11］。IL-23R通過與lL-23/IL-23R/Thl7/IL-17途徑導致腸黏膜非特異性炎癥反應［12］。SNP是人類最為常見的可遺傳變異基因，占已知基因多態(tài)性的90%以上［13］。通過比較CD與對照人群的全基因組掃描結果發(fā)現(xiàn)，IL-23R 1142位點上具有一個改變IL-23R氨基酸編碼的基因多態(tài)性（1142 G＞A）。1142 G＞A是一個非同義SNP，堿基G由A替代，使IL-23R氨基酸編碼的蛋白質中的一個精氨酸轉變?yōu)楣鹊０罚≧SL 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln），從而導致蛋白質功能異常［14-16］。Arg381Gln基因在IBD患者家族中存在明顯不平衡傳遞現(xiàn)象，從而導致IBD疾病的發(fā)生與發(fā)展［17］。但國際上關于IL-23R Arg381Gln 與IBD的相關性研究結果差異顯著。部分研究肯定了IL-23R Arg381Gln與非猶太人群IBD患兒具有緊密的關系［18］。但部分研究則否認IL-23R Arg381Gln與智利、日本IBD患者的關系［19］。因此，IL-23R Arg381Gln可能存在個體遺傳差異性，但關于我國關于IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關性研究較為罕見。

本研究結果顯示，我國IL-23R Arg381Gln存在單核苷酸多態(tài)性G/A，其中CD患者IL-23R Arg381Gln的A等位基因的表現(xiàn)頻率為2.13%，稍低于UC患者（5.13%）與健康體檢者（5.83%），因此，IL-23R Arg381Gln的A等位基因可能對CD具有一定程度的保護作用。分析其原因主要為IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性（C.1142 G＞A）使IL-23R氨基酸編碼的蛋白質中的某一個精氨酸轉變?yōu)楣劝滨０?，而谷氨酰胺可作為物質代謝的關鍵營養(yǎng)物質，其對腸道黏膜生長具有重要的免疫調節(jié)功能，在維持腸道黏膜屏障功能與結構中具有重要的價值［20-21］。結合本研究結果，UC、CD患者與健康體檢者IL-23R Arg381Gln等位基因的表現(xiàn)頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與IBD無顯著的關系。但相關文獻證實，IL-23R Arg381Gln具有個體遺傳差異性。同時，由于本研究樣本量較小，進一步確切的研究結果尚有待進一步的研究探討。

綜上所述，我國IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性（l209026，C.1142G＞A，P.Arg381Gln） 與 炎 癥性腸病無顯著的關系，個體遺傳差異性可能決定炎癥性腸病的易感性。但由于樣本量較小，IL-23R Arg381Gln基因多態(tài)性與IBD的確切關系尚有待進一步探討。

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The Correlation Study between Interleukin-23R Arg381Gln Gene Polymorphism and Inflammatory Bowel Disease/

XU Xu，ZHANG Heng-bin，ZHONG Li-mei.//Medical Innovation of China，2016，13（26）：009-012

Objective：To study the correlation between interleukin-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease.Method：By sequence specific primers and PCR technique in 125 cases of inflammatory bowel disease（study team：UC group of 78 cases，CD group of 47 cases）and 120 healthy checkup （control group）IL-23R genes non-synonymous single-nucleotide polymorphisms were analyzed and the allele performance frequency were calculated.The correlation between IL-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease was evaluated.Result：The allele performance frequency of UC group，CD group and control group were 5.13%，2.13%，5.83%，the comparison difference among groups had no statistical significance （P＞0.05），but A allele performance frequency of CD group was slightly lower than UC group and control group.The G allele performance frequency of UC group，CD group and control group were 6.41%，6.38%，5.83%，compared among groups with no significant difference（P＞0.05）.Conclusion：It has no significant correlation between IL-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease，the individual genetic differences may determine the susceptibility of inflammatory bowel disease.

Interleukin-23R； Arg381Gln； Genetic polymorphism； Inflammatory bowel disease

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.26.003

2016-01-19） （本文編輯：蔡元元）

深圳市寶安區(qū)科技計劃項目（2013242）

①廣東省深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院 廣東 深圳 518102

徐旭

First-author’s address：Shenzhen Baoan District Central Hospital，Shenzhen 518102，China