唐國鑫，陳寧

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

土壤宏基因組中芽孢桿菌信號肽的克隆及分析

唐國鑫1，2，陳寧1*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

從土壤宏基因組中篩選獲得在芽孢桿菌中高效分泌重組蛋白的信號肽。通過數(shù)據(jù)分析，將預(yù)測到的信號肽DNA片段與蛋白酶基因融合，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB800和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DL6中表達(dá)，進(jìn)行胞外蛋白酶酶活測定。篩選得到25個可能來源于G+菌的信號肽序列，胞外蛋白酶活性分析的結(jié)果顯示，有14個信號肽具有較好的分泌蛋白酶的能力，其中引導(dǎo)效果最好的信號肽（sig20）是蛋白酶自身信號肽的1.64倍。將高分泌信號肽轉(zhuǎn)化到地衣芽孢桿菌中，證實其在地衣芽孢桿菌同樣具有較好的引導(dǎo)效果。應(yīng)用生物信息學(xué)與宏基因組學(xué)相結(jié)合的方法，可有效獲得高效的芽孢桿菌信號肽序列，為蛋白質(zhì)高效分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建提供豐富的表達(dá)元件。

宏基因組；信號肽；芽孢桿菌；蛋白酶

眾所周知，芽孢桿菌被作為工業(yè)中外源蛋白表達(dá)的優(yōu)良宿主。它們的發(fā)酵成本相對低廉［1］。其中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌已通過美國食品藥物管理局一般認(rèn)為安全（generallyreeonized as safe，GRAS）認(rèn)證［2-3］。同時，芽孢桿菌可直接將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中［4］，簡化了目的產(chǎn)物的提取和純化過程。有相關(guān)報道，芽孢桿菌分泌外源目標(biāo)蛋白最高可達(dá)到20～25 g/L［5］。

信號肽是一段通常位于分泌蛋白的新生肽鏈N端的氨基酸序列，并將新生的肽鏈引導(dǎo)到細(xì)胞特定的部位。信號肽一般含15～45個氨基酸殘基［6］，一般分為三個區(qū)域：帶正電的N端，含有堿性氨基酸，可與細(xì)胞膜上的易位蛋白和帶負(fù)電的磷脂相互作用［7-8］；中間為疏水的H區(qū)，含大量疏水氨基酸；C端為加工區(qū)，含小分子的氨基酸，是信號肽的切割位點［9-10］，信號肽酶識別出信號肽C端的切割位點，將信號肽從成熟蛋白上切除［11］。

篩選高效信號肽是提高蛋白質(zhì)分泌量的一個有效手段。BROCKNEIER U等［12］篩選到了對角質(zhì)酶分泌引導(dǎo)效率不同的信號肽；DEGERING C等［13］通過篩選，獲得了7個枯草芽孢桿菌蛋白酶（BPN′）的野生型信號肽引導(dǎo)效率高的信號肽。范鑫［14］通過篩選24個枯草芽孢桿菌信號肽，其中最好的信號肽YnfF使木聚糖酶的胞外酶活達(dá)到37.2 U/mL。

宏基因組是由HANDELSMAN J等［15］于1998年首次提出的概念。其定義為自然環(huán)境獲得的樣品中所有微生物基因組的總和。自然環(huán)境中超過99%的微生物不能通過傳統(tǒng)的方式培養(yǎng)，這極大的限制了人們認(rèn)識和了解微生物［16］。宏基因組學(xué)以環(huán)境中全部微生物的脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）作為研究對象。相對于傳統(tǒng)的篩菌方法獲得的微生物基因資源，宏基因組學(xué)避免了微生物分離培養(yǎng)的難題，極大的拓展了對微生物資源的利用［17-19］。

本研究通過生物信息學(xué)的方法從宏基因組數(shù)據(jù)中獲得信號肽，在枯草芽孢桿菌（B.subtilis）WB800得到有效的表達(dá)和分泌，進(jìn)一步對5條胞外蛋白酶活性較好的信號肽在地衣芽孢桿菌中進(jìn)行了驗證，并對這些信號肽進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，為蛋白高效分泌表達(dá)體系的構(gòu)建奠定了較好的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB800、地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis）DL6：本實驗室保存菌種；大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒pHT43：本實驗室保存；重組質(zhì)粒pBE980B-pro（含有由芽孢桿菌組成型啟動子P43控制表達(dá)的芽孢桿菌堿性蛋白酶基因（pro，GenBank：AR691047），自身攜帶有一個野生型Pro309信號肽）：本實驗室構(gòu)建［20］。

1.1.2試劑及樣品

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶：美國Thermo公司；高保真DNA聚合酶Cobuddy、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-riborucleo side triphosphate，dNTP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素等抗生素：北京Solarbio公司；酪蛋白：美國Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

宏基因組來源于天津大港冬季的堿性土壤，土壤宏基因組DNA的提取和純化采用美國OMEGA土壤DNA提取試劑盒完成，宏基因組DNA序列測定和拼接由蘇州金維智公司完成。聚合酶鏈?zhǔn)椒词剑╬olymerase chain reaction，PCR）引物合成和DNA測序均由北京華大基因和蘇州金維智公司完成。

1.1.3培養(yǎng)基和溶液

固體LB培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉、10 g/L氯化鈉、10 g/L蛋白胨、15 g/L瓊脂粉，LB牛奶平板添加1%脫脂奶粉用于枯草芽孢桿菌胞外分泌的蛋白酶水解圈分析。

芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化復(fù)蘇培養(yǎng)基為包含0.5 mol/L的山梨醇和0.38 mol/L的甘露醇的LB培養(yǎng)基。

2%酪蛋白溶液：酪蛋白溶于pH9.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05 mol/L）中，用于測蛋白酶酶活。0.4 mol/L三氯乙酸用于終止蛋白酶反應(yīng)。

1.2儀器與設(shè)備

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、SKY-2111B恒溫?fù)u床：上海博迅實業(yè)有限公司；ECM399電擊儀：美國HarvardApparatus公司；Epoth 2TC酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；紫外酶標(biāo)板：德國GreinerBio-OneGmbH公司。

1.3試驗方法

1.3.1信號肽篩選載體的構(gòu)建

設(shè)計引物up-promoter（5′-CTCGTCAAACATCACCC TCTT-3′）和down-MC（5′-CTTGGAATTGTGCTGAAG CT-3′），以pBE980B-pro質(zhì)粒為模板，擴增獲得包含pro基因完整表達(dá)盒的片段。PCR程序為：預(yù)變性98℃，3 min；擴增：95℃，20s，52℃，20s，72℃，45s，30個循環(huán)；補齊：72℃，10min。將PCR產(chǎn)物純化后與經(jīng)過SmaⅠ-NheⅠ雙酶切并平端化處理的pHT43載體部分連接，獲得了重組質(zhì)粒pHT43-pro，該質(zhì)粒去除了原質(zhì)粒上由異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)的外源基因表達(dá)片段，可組成型表達(dá)芽孢桿菌蛋白酶。

再設(shè)計引物mPro 5′-GCTAAGGATCCGCTGAAGAA GCAAAAGAAAAATA-3′（下劃線處為BamHⅠ酶切位點），以pHT43-pro質(zhì)粒為模板，down-MC為下游引物，擴增出不含信號肽的蛋白酶成熟肽基因片段，PCR程序與前文一致。用BamHⅠ和PstⅠ切下蛋白酶基因，同樣的酶切下pHT43-pro的pHT43載體部分，連接后得到重組質(zhì)粒，命名為pHT43-mpro（mpro為不含信號肽的芽孢桿菌蛋白酶成熟肽基因片段），該質(zhì)粒用于不同信號肽的篩選。土壤宏基因組預(yù)測獲得的信號肽DNA序列分別與蛋白酶基因進(jìn)行融合，獲得含有不同信號肽的重組質(zhì)粒pHT43-SP-mpro。

1.3.2枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及初篩

枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化均采用相同的電擊轉(zhuǎn)化的方式，取5～10 μL（約500 ng）質(zhì)粒與100 μL B.subtilisWB800感受態(tài)細(xì)孢混合，放入預(yù)冷的2 mm電擊杯中，冰浴2 min后取出，置于電擊儀中，用1 750 V的電壓電擊，電擊后立刻加入1 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃、220 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)3 h，涂布于含有10 μg/mL氯霉素和1%脫脂奶粉的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，觀察菌落和水解圈。通過測定蛋白水解圈大小與菌落直徑的比值，進(jìn)行初篩。

1.3.3蛋白酶酶活測定

配制不同質(zhì)量濃度的酪氨酸溶液，讀取其在波長280nm下的吸光度值，以酪氨酸質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以波長280nm下的吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［21］。結(jié)果顯示酪氨酸質(zhì)量濃度在0～400 μg/mL范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，R2為0.999。酶活定義為在50℃、pH 9.0條件下，每分鐘蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg的酪氨酸為一個酶活單位（U）［21］，酶活計算公式如下：

式中：X—酶活，U；269.8—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；Y—OD280nm；2.266—截距；4—稀釋倍數(shù)，即1 mL反應(yīng)體系里實際只含1/4毫升上清液；10—反應(yīng)時間，min。

將重組B.subtilisWB800在37℃，220 r/min培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)液以12000r/min離心1min沉淀菌體，取250 μL上清液在50℃水浴中溫浴2 min后，加入pH 9.0的2%酪蛋白溶液250 μL，50℃保溫10 min，立刻加入500 μL濃度為0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液于酶標(biāo)儀中測定OD280nm。

2　結(jié)果與分析

2.1宏基因組信號肽數(shù)據(jù)庫的建立

土壤宏基因組DNA的抽提、純化依照說明書的方法進(jìn)行，最終獲得的DNA純度A260nm/A280nm為1.87，質(zhì)量濃度228.8 ng/μL，符合宏基因組DNA測序的要求，并由蘇州金維智公司進(jìn)行了高通量測序和初步的拼接注釋。結(jié)果表明該測序具有較好的質(zhì)量。通過數(shù)據(jù)拼接，獲得了37 284個大于500 bp的片段，初步比對獲得了70 072個可能的基因。利用在線蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）分析，并結(jié)合在線信號肽預(yù)測工具SignalP 4.1 Server（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/），最終獲得了398個可能含有信號肽序列的新基因（與Genbank數(shù)據(jù)比對，全肽序列的同源性≤90%），構(gòu)建了含信號肽序列的基因數(shù)據(jù)庫（數(shù)據(jù)未顯示）。再根據(jù)蛋白的同源性關(guān)系，篩選了其中可能來源于G+菌的含有可能的分泌性信號肽的新基因34個，對這些基因N端編碼的70個AA用SignalP 4.1 Server進(jìn)行分析，獲得了可能的信號肽序列和信號肽酶的切割位點，將這些信號肽序列在信號肽數(shù)據(jù)庫（http：//www.signalpeptide.com/）中進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測的信號肽均為新的信號肽序列，其序列被用于在芽孢桿菌中進(jìn)行外源蛋白的分泌表達(dá)分析。

2.2信號肽的初篩

圖1　不同信號肽-蛋白酶產(chǎn)生的水解圈Fig.1 Hydrolyzed circles of different signal peptides-protease

將不同的信號肽插入到信號肽篩選載體pHT43-mpro的BamHⅠ位點處，與芽孢桿菌堿性蛋白酶基因pro融合，成功構(gòu)建了25個信號肽重組質(zhì)粒，獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB800中，進(jìn)行初篩。根據(jù)水解圈與菌落比值大小并與含野生型信號肽質(zhì)粒pHT43-pro的重組菌株進(jìn)行對比，結(jié)果見圖1（未完全列出），將不同水平的信號肽分成了四組：高分泌組包括sig8、sig12、sig13、sig20、sig27、sig34；中等分泌組包括sig18、sig24、sig26、sig28、sig30、sig31、sig37、sig40；低分泌組包括sig15、sig21、sig29、sig32、sig36、sig41，差分泌組包括sig17、sig22、sig35、sig38、sig39。其中高分泌組的水解圈比值高于野生型，中等分泌組的水解圈比值與野生型相當(dāng)，差分泌組的水解圈很小，有的甚至難以測定。

2.3胞外分泌蛋白酶活性定量分析

挑取出高分泌組和中等分泌組的B.subtilisWB800重組菌株，接種于2 mL含氯霉素10 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)，將該種子液按2%接種量接種于5 mL含氯霉素10 μg/mL的LB培養(yǎng)基的大試管中，37℃，220 r/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)24 h，離心后去除菌體，取上清液測定蛋白酶的活性。以同樣培養(yǎng)條件的含pHT43-pro質(zhì)粒的B.subtilisWB800為陽性對照，含pHT43-mpro質(zhì)粒的B.subtilisWB800為陰性對照（該菌株喪失了胞外分泌蛋白酶的能力），測定其相對酶活，即扣除陰性對照后的酶活。對比分析含不同信號肽的重組菌株的蛋白酶的胞外分泌能力，將不同信號肽引導(dǎo)的蛋白酶胞外酶活與Pro309信號肽進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。每個菌株做5個平行試驗。

同時，利用SignalP4.1Server信號肽分析工具對這25個預(yù)測的信號肽以及Pro309信號肽進(jìn)行分析，從肽鏈長度、D值（D值對區(qū)分是否為分泌蛋白具有重要作用）、N端正電荷數(shù)（根據(jù)預(yù)測結(jié)果對N區(qū)的劃分，統(tǒng)計N區(qū)氨基酸攜帶的凈正電荷數(shù)）和信號肽的疏水百分比（疏水氨基酸數(shù)量占信號肽總氨基酸數(shù)量的百分比）這四個方面進(jìn)行對比，按胞外酶活排序，結(jié)果見表1。

表1結(jié)果顯示初篩的14個信號肽，可在枯草芽孢桿菌中有效的表達(dá)分泌芽孢桿菌堿性蛋白酶。高分泌組的胞外蛋白酶活性是野生型的1.4倍以上，其中含有信號肽sig20（氨基酸序列：MKRLISTLLIGILLTASAPSAFAKPD）的重組菌株的胞外蛋白酶的活性是野生型的1.64倍；中等分泌組的胞外蛋白酶活性是野生型的0.8～1.4倍，這一結(jié)果與水解圈法得到的結(jié)果基本一致。

這26個信號肽長度大多在24～36個氨基酸，平均長度為28.3，長度分布比較隨機。統(tǒng)計得出引導(dǎo)效率最高的前11個信號肽（野生型信號肽Pro309以及效率高于野生型的信號肽）平均D值為0.694，最差的后15個信號肽（效率低于野生型信號肽）平均D值為0.552。推測D值越高，胞外酶活越高，但這并不是絕對的，如排名第5的sig34的D值只有0.525，而排名第18的sig15的D值卻達(dá)到0.851。從表中可以發(fā)現(xiàn)，N區(qū)正電荷數(shù)在2～4的時候，信號肽傾向于效率較好。有的信號肽，如sig34和sig21卻并不遵循這個規(guī)律。信號肽的疏水比例則與信號肽是否能成功插入細(xì)胞膜有關(guān)，然而，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)這26個信號肽的疏水比例大多在50%～70%隨機分布。

表1　不同信號肽與野生型信號肽引導(dǎo)效率的比值Table 1 Guide efficiency ratio of different signal peptides and wild-type signal peptide

2.4高分泌信號肽在地衣芽孢桿菌中的表達(dá)

圖2　含不同信號肽的重組菌株的相對胞外蛋白酶酶活Fig.2 Relative extracellular protease activity in recombinant strain containing different signal peptides

將含高分泌組信號肽（sig8、sig12、sig13、sig20、sig27）的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.lincheniformisDL6中，篩選出陽性克隆，用與B.subtilisWB800同樣的方法培養(yǎng)和測定上清液中的蛋白酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在地衣芽孢桿菌中，與野生型信號肽Pro309相比，除sig27外（sig27在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中的蛋白酶分泌量分別是野生型信號肽的1.52倍和0.98倍），其余幾個信號肽的相對胞外蛋白酶活性與在B.subtilisWB800中相似，結(jié)果見圖2。由圖2可知，這些信號肽在地衣芽孢桿菌中也可以有效地引導(dǎo)分泌蛋白酶。

3　結(jié)論

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)和宏基因組學(xué)相結(jié)合的方法，從土壤宏基因組中篩選出25個信號肽并成功在枯草芽孢桿菌中得到了分泌表達(dá)，其中最好的信號肽sig20對蛋白酶的分泌表達(dá)是蛋白酶野生型信號肽的1.64倍。此外，將部分信號肽應(yīng)用于地衣芽孢桿菌，也得到了較好的效果。結(jié)果表明，從宏基因組中獲得信號肽來提高蛋白的分泌水平是一種行之有效的辦法。

通過分析信號肽的長度、D值、N端正電荷數(shù)和信號肽的疏水百分比，試圖找出信號肽分泌效率的規(guī)律，預(yù)測影響信號肽強弱的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和位點。然而，這些因素與信號肽的強弱之間并沒有明顯的或者絕對的規(guī)律，并不能覆蓋影響信號肽功能的所有因素，說明宿主對信號肽的識別和蛋白的分泌是非常復(fù)雜的。因此，構(gòu)建高效的信號肽篩選和評價體系對于獲得高效信號肽的是十分重要的。本研究篩選到的新的信號肽，為在芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)目標(biāo)蛋白提供了新的信號肽資源和表達(dá)元件。

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TANG Guoxin1，2，CHEN Ning1*
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

Signal peptide，efficiently secreting recombinant proteins inBacillussp.was obtained from soil metagenome.After database analysis，the predicted signal peptide DNA fragment was fused with a protease gene，and then expressed inBacillus subtilisWB800 andBacillus licheniformis DL6 to measure the extracellular protease activity.Totally 25 signal peptide sequences which may derived from G+bacteria were screened，extracellular protease activity results showed that there were 14 signal peptides had excellent ability of secreting protease.One of the signal peptides，named sig20，was 1.64 times of its own protease signal peptide，which performed the optimal secretion ability.The high secretion signal peptides were transformed intoB.licheniformisand the results confirmed the similar secretion ability inB.subtilis.By combining bioinformatics and metagenomics methods，effectively Bacillus signal peptipe sequence could be obtained，which provided a rich expression elements for expression and secretion of recombinant proteins.

metagenome；signal peptide；Bacillus；protease

0254-5071（2016）06-0138-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.029

2016-01-15

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃‘863計劃’項目（2014AA021303，2014AA021302）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿科學(xué)研究計劃（13JCYBJC39500）

唐國鑫（1991-），男，碩士研究生，研究方向為芽孢桿菌信號肽的篩選與改造。

陳寧（1963-），男，教授，博士，研究方向為氨基酸與有機酸發(fā)酵。