王浩，李炎璋，李迎，趙亮，宋健，賈士芳

（太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西太原030000）

響應(yīng)面法優(yōu)化酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇

王浩，李炎璋，李迎，趙亮，宋健，賈士芳*

（太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西太原030000）

研究熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）GIM2.7發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的最佳工藝條件，提高酒糟資源的利用率。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇主要因素接種量、裝液量、有機(jī)氮源添加量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)接種量為16%、有機(jī)氮源添加量5%、裝液量109 mL/250 mL時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)到57.8%，與預(yù)測(cè)值（60.4%）相接近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的發(fā)酵條件是有效的。

酒糟水解液；木糖醇；發(fā)酵；熱帶假絲酵母；響應(yīng)面法

木糖醇是一種重要的功能性五碳糖醇，其甜度與蔗糖相當(dāng)，熱量與葡萄糖相當(dāng)，在體內(nèi)代謝不需胰島素參與，也不會(huì)造成血糖的急劇變化，可作為糖尿病人的甜味替代品［1］。此外，由于木糖醇具有預(yù)防齲齒、溶解熱大、不發(fā)生美拉德反應(yīng)等功效以及具備甘油和其他多元醇的優(yōu)異特性，可廣泛用于醫(yī)療、化工、食品等行業(yè)［2-3］。

目前，國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)木糖醇的主要方法是化學(xué)合成法，即用富含半纖維素的玉米芯、棉子殼、甘蔗渣、樺木片等農(nóng)副產(chǎn)品經(jīng)酸（如HCl、H2SO4）水解成木糖后，經(jīng)純化處理和加氫反應(yīng)制得木糖醇，該方法成本高、產(chǎn)率低、污染較嚴(yán)重［4］。鑒于化學(xué)法生產(chǎn)木糖醇存在的一些弊端，有學(xué)者開始關(guān)注利用微生物發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)木糖醇［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道，酵母轉(zhuǎn)化木糖醇的能力最強(qiáng)，產(chǎn)木糖醇的酵母菌主要集中在假絲酵母屬（Candida），如熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）在24 h內(nèi)可轉(zhuǎn)化90%以上的木糖產(chǎn)木糖醇［6-7］。

白酒糟成分比較復(fù)雜，但以半纖維素物質(zhì)為主。我國(guó)的白酒糟年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到2 100萬(wàn)t以上［8］，產(chǎn)量如此龐大的酒糟如果不加合理利用，既會(huì)污染環(huán)境也會(huì)造成資源的浪費(fèi)。利用酒糟為原料發(fā)酵產(chǎn)木糖醇在國(guó)外已有相關(guān)報(bào)道，而在國(guó)內(nèi)則研究甚少［9］。酒糟的成本較低，利用酒糟為原材料發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇可大大降低木糖醇生產(chǎn)的成本，本研究采用響應(yīng)面法探究熱帶假絲酵母（C.tropicalis）GIM2.7發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的最佳工藝條件，以期降低生產(chǎn)成本，提高木糖醇的轉(zhuǎn)化率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原材料和菌種

酒糟：太原某酒廠。

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）GIM2.7：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，115℃滅菌15 min。

液體種子培養(yǎng)基：木糖10 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，115℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：每100 mL酒糟水解液（含木糖約36 g/L）補(bǔ)加5 mL有機(jī)氮源溶液（其中酵母膏和蛋白胨質(zhì)量濃度均為50 g/L），起始pH 5.0，115℃滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

UV-5200紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；HZQ-X100立式搖床：常州杰博森儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-25C數(shù)顯酸度計(jì)：上海宇隆儀器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1酒糟水解液的制備

稱取一定量烘干后的白酒糟，粉碎至60目，按1∶10（g∶mL）的料比加入2%的混合酸（濃磷酸和濃鹽酸各1%），浸泡過(guò)夜，121℃水解2.5 h，過(guò)濾除去酒糟殘?jiān)?，?0℃真空適當(dāng)濃縮后，以2.5%的比例加入活性炭脫毒60min。使用活性炭脫毒可以有效除去水解液中的糠醛和酚類化合物等發(fā)酵抑制物，提高發(fā)酵性能［10］。得到的水解液用過(guò)量的石灰乳中和（pH 10.0），再用濃磷酸回調(diào)至pH 5.0，抽濾，于4℃冷藏備用。

1.3.2種子液制備

將凍干熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）GIM2.7轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，30℃活化36 h，然后挑取斜面菌種3環(huán)，接種至裝液量為100 mL/250 mL的液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，180 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。

1.3.3酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇

取10 mL種子液接種至裝液量為100 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃搖床發(fā)酵48 h［11-12］（其中0～24 h轉(zhuǎn)速為180 r/min，24～48 h轉(zhuǎn)速為120 r/min），發(fā)酵過(guò)程不做任何處理。發(fā)酵結(jié)束后，取適量發(fā)酵液于3 000 r/min離心10 min，收集上清液，待分析木糖醇、木糖含量。

1.3.4木糖醇轉(zhuǎn)化率的測(cè)定方法

木糖含量測(cè)定采用地衣酚法［13］，并繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.049 1x+0.035 6（R2=0.993 1）。根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算發(fā)酵液中木糖含量。

木糖醇含量測(cè)定采用變色酸法［14］，并繪制木糖醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.088 8x+0.015 2（R2=0.993 1）。根據(jù)木糖醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算發(fā)酵液中木糖醇含量。

木糖醇轉(zhuǎn)化率的計(jì)算公式如下：

1.3.5單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以木糖醇轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究酒糟水解液接種量（5%、10%、15%、20%、25%）、裝液量（60mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL、140mL/250mL）、氮源添加量（0、3%、5%、7%、9%）、初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對(duì)發(fā)酵效果的影響。

1.3.6響應(yīng)面最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別以接種量、裝液量、氮源添加量為主要影響因素，以木糖醇轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)和使用Design Expert 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1接種量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響

接種量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　接種量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of inoculum on the conversion rate of xylitol

由圖1可知，在5%～25%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，木糖醇轉(zhuǎn)化率先增后減，當(dāng)接種量為15%時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，為42.9%。這可能是由于酒糟水解液環(huán)境復(fù)雜，接種量過(guò)小（5%～10%），菌體受發(fā)酵液中糠醛、乙酸、酚類化合物等發(fā)酵抑制物的影響［15］，延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間，使木糖醇積累少，轉(zhuǎn)化率低；但接種量過(guò)大（＞15%），大量的木糖和其他營(yíng)養(yǎng)成分用于菌體生長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)木糖醇少，表現(xiàn)在木糖醇轉(zhuǎn)化率明顯降低。因此，本試驗(yàn)選擇接種量為15%。

2.1.2裝液量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響

裝液量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)裝液量為60～100 mL/250 mL時(shí)，隨著裝液量的增加，木糖醇轉(zhuǎn)化率升高，這是因?yàn)榘l(fā)酵液中溶氧充足，一方面菌體快速繁殖，木糖主要用于菌體生長(zhǎng)，木糖醇代謝相對(duì)較慢，另一方面將導(dǎo)致形成的木糖醇再度氧化成木酮糖［16］；當(dāng)裝液量為100 mL/250 mL時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值，為46.1%；當(dāng)裝液量＞100 mL/250 mL時(shí)，發(fā)酵液中溶氧量下降，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不足，菌體濃度較低，從而影響了木糖醇的積累。因此，本試驗(yàn)選擇裝液量為100 mL/250 mL。

圖2　裝液量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of liquid volume on the conversion rate of xylitol

2.1.3有機(jī)氮源添加量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響

有機(jī)氮源添加量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　有機(jī)氮源添加量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of organic nitrogen source addition on the conversion rate of xylitol

由圖3可知，當(dāng)有機(jī)氮源添加量為0～5%時(shí)，隨著有機(jī)氮源添加量的逐漸增加，木糖醇轉(zhuǎn)化率明顯升高，這主要是因?yàn)榘l(fā)酵液中有機(jī)氮源添加量過(guò)低時(shí)，不能滿足菌體大量生長(zhǎng)的需求，菌體濃度較低，致使木糖醇轉(zhuǎn)化率偏低；當(dāng)有機(jī)氮源添加量為5%時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，為45.3%；當(dāng)繼續(xù)添加氮源＞5%時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率變化不大。因此，從節(jié)約成本角度考慮，本試驗(yàn)選擇有機(jī)氮源添加量為5%。

2.1.4初始pH對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響

初始pH對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)初始pH 4.0時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率偏低，這可能是由于發(fā)酵液中存在大量未解離的乙酸分子，強(qiáng)烈地抑制了菌體生長(zhǎng)和木糖醇的代謝積累［15］；當(dāng)初始pH值從4.5升至5.5時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率先緩慢升高后又緩慢降低，當(dāng)初始pH 5.0時(shí)，木糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，為45.1%。木糖醇轉(zhuǎn)化率隨著初始pH值變化不明顯，可見初始pH值對(duì)發(fā)酵效果影響較小。因此，固定初始pH值為5.0進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4　初始pH對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of initial pH on the conversion rate of xylitol

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)分析

采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)接種量、裝液量和有機(jī)氮源添加量進(jìn)行優(yōu)化，以木糖醇轉(zhuǎn)化率（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2?；貧w模型的方差分析結(jié)果見表3。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

針對(duì)表2結(jié)果，應(yīng)用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行回歸分析，建立多元二次回歸方程如下：

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，表明該回歸模型達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。模型失擬項(xiàng)P=0.552 1＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型能夠很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.976 7，表示有97.67%的響應(yīng)值變化可用該模型來(lái)解釋，說(shuō)明試驗(yàn)可靠性較高，故此模型可以用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，因素A、B、C、A2和B2對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響均極顯著（P＜0.01），因素AB、AC、BC對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率影響不顯著P＞0.05）。各因素對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響依次是B（接種量）＞A（有機(jī)氮源添加量）＞C（裝液量）。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

為進(jìn)一步直觀分析響應(yīng)面優(yōu)化效果，根據(jù)回歸模型繪制各因素交互作用對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)曲面和等高線圖，結(jié)果見圖5。響應(yīng)面及其等高線的形狀可直觀反映各因素間的交互作用對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響，可明顯看出它們的等高線基本呈圓形，且曲面坡度較平緩，所以交互作用均不顯著［17］，但它們對(duì)響應(yīng)值的交互影響順序?yàn)椋篈C＞AB＞BC。通過(guò)對(duì)模型方程分析得出酒糟水解液發(fā)酵產(chǎn)生木糖醇的最佳工藝條件為：接種量15.77%、有機(jī)氮源添加量4.84%、裝液量109.13 mL/250 mL。

圖5　接種量、裝液量和有機(jī)氮源添加量交互作用對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，liquid volume and organic nitrogen source addition on the conversion rate of xylitol

2.3最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

將得出的最佳工藝條件修正為：接種量16%、有機(jī)氮源添加量5%、裝液量109 mL/250 mL，在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，木糖醇轉(zhuǎn)化率的平均值為57.8%，與預(yù)測(cè)值（60.4%）相接近，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的木糖醇發(fā)酵條件可信，此模型準(zhǔn)確可靠，具有一定實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到熱帶假絲酵母（C.tropicalis）GIM2.7發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的最佳工藝條件為：初始pH5.0、接種量16%、有機(jī)氮源添加量5%、裝液量109 mL/250 mL。在此條件下，木糖醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)到57.8%，與預(yù)測(cè)值（60.4%）相接近。結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的發(fā)酵條件是有效的，對(duì)提高木糖醇的生產(chǎn)提供了技術(shù)支持，并且有利于酒糟的合理利用。

［1］EMODIA.Xylitol：itspropertiesand food applications［J］.Food Technol，1978，32：28-32.

［2］朱宏陽(yáng)，周劍，李泳寧，等.木糖醇生產(chǎn)的研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2012，24（5）：5-8.

［3］劉春，房桂干，施英喬，等.木糖醇的生產(chǎn)技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2010，30（6）：113-118.

［4］NGAMI P，SINGH D.Processes for fermentative production of xylitol-asugar subustitute［J］.Process Biochem，1995，30：17-124.

［5］王樂(lè)，袁其朋，常錚，等.聚氨酯固定化熱帶假絲酵母發(fā)酵木糖醇［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（7）：943-948.

［6］CHENG K K，ZHANG J A，CHAVEZ E，et al.Integrated production of xylitol and ethanol using corn cob［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，87（2）：411-417.

［7］NAKANO K，KATSU R，TADA K，et a1.Production of highly concentrated xylitol byCandida magnoliaeunder a microaerobic condition maintained by simple fuzzy control［J］.J Biosci Bioeng，2000，89（4）：372-376.

［8］李建，葉翔.酒糟綜合利用多元化研究［J］.中國(guó)釀造，2013，32（12）：121-124.

［9］王錚，陳紅英，沈才洪，等.熱帶假絲酵母利用酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的初步研究［J］.中國(guó)釀造，2006，25（3）：44-47.

［10］SITI M M K，NURUL L M，ABDUL G L A，et al.Detoxification of sago trunk hydrolysate using activated charcoal for xylitol production［J］. Procedia Food Sci，2011，1：908-913.

［11］TEAK B K，DEOK K O.Xylitol production byCandida tropicalisin a chemically defined medium［J］.Biotechnol Lett，2003，25（24）：2085-2088.

［12］FABIáN L，OSVALDO D D，ALEJANDRA M，et al.Characterization of a new xylitol-producerCandida tropicalisstrain［J］.Anton Leeuw，2004，85（4）：281-286.

［13］秦偉軍，陳葉福，趙換英，等.玉米芯堿液預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26（4）：248-253.

［14］劉健，陳洪章，李佐虎.木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究［J］.工業(yè)微生物，2001，31（2）：36-41.

［15］吳昊，陳嘯鵬，賀愛永，等.玉米芯稀酸水解液滅菌方式對(duì)Clostridium acetobutylicumXYl6發(fā)酵性能的影響［J］.南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（2）：11-15.

［16］張厚瑞，何成新，梁小燕，等.半纖維素水解物生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2000，16（3）：304-307.

［17］MURALIDHAR R V，CHIRUMAMILA R R，MARCHANT R，et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindraceausing two different carbon source［J］.Biochem Eng J，2001，9（1）：17-23.

WANG Hao，LI Yanzhang，LI Ying，ZHAO Liang，SONG Jian，JIA Shifang*
（College of Chemical and Biological Engineering，Taiyuan University of Science and Technology，Taiyuan 030000，China）

The optimum conditions of xylitol fermentation from vinasse hydrolysate byCandida tropicalisGIM2.7 were researched to improve the utilization rate of vinasse resources.On the basis of single factor experiment results，the main factors including inoculum，liquid volume，nitrogen source addition were optimized by response surface methodology.The results showed that in the optimum conditions of inoculum 16%，organic nitrogen source addition 5%，and liquid volume 109 ml/250 ml，the conversion rate of xylitol was up to 57.8%，which was approached with predicted value（60.4%）.Results indicated that it was a very effective method to optimize fermentation conditions of producing xylitol from vinasse hydrolysate by response surface methodology.

vinasse hydrolysate；xylitol；fermentation；Candida tropicalis；response surface methodology

TQ923

0254-5071（2016）06-0113-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.024

2016-03-07

太原科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（XJ2015058）；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（SJ2016276）

王浩（1994-），男，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ獭?/p>

賈士芳（1978-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樽魑锷砩鷳B(tài)、生物能源及天然產(chǎn)物開發(fā)利用等。