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（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙 410125）

辣椒乙烯轉(zhuǎn)錄因子CaERF18的分離與誘導(dǎo)表達(dá)

鄭井元1劉峰1朱春暉2

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙 410125）

旨在明確辣椒（Capsicum annuum L. HDA149）與南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）不親和互作過(guò)程中相關(guān)特異性ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子的候選基因及其表達(dá)模式。應(yīng)用RT-PCR方法，從南方根結(jié)線蟲(chóng)誘導(dǎo)的辣椒中分離到一個(gè)694 bp cDNA序列的乙烯（ERF）轉(zhuǎn)錄因子基因核心序列，命名為CaERF18，編碼231個(gè)氨基酸，含有一個(gè)保守的由59個(gè)氨基酸構(gòu)成的ERF結(jié)構(gòu)域，與NtERF118、SlERF4 和 SlERF19 AP2結(jié)構(gòu)域的相似性分別為44.3%、42.6% 和39.3%。表達(dá)分析表明，南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染可顯著誘導(dǎo)CaERF18的表達(dá)，接種線蟲(chóng)后12 h相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始升高，12 h升高3.8倍，72 h升高7.2倍。結(jié)果表明，CaERF18是一受病原物誘導(dǎo)表達(dá)的基因，推測(cè)CaERF18在介導(dǎo)辣椒對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的抗性作用中可能具有重要的調(diào)控功能。

辣椒；根結(jié)線蟲(chóng)；乙烯；轉(zhuǎn)錄因子；誘導(dǎo)表達(dá)

乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子（Ethylene-response factor，ERF）屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族，共同特征是都含有由57-66個(gè)氨基酸殘基組成的保守AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，在調(diào)控生物和非生物脅迫應(yīng)答基因表達(dá)中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［1-5］。根據(jù)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量差異和是否含有其他結(jié)構(gòu)域，可將ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族劃分為3個(gè)主要的亞族：AP2亞族、ERF亞族和RAV亞族［6］。AP2亞族含有兩個(gè)重復(fù)的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，ERF亞族只含有一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，RAV亞族除了含有一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，還含有一個(gè)植物特異性轉(zhuǎn)錄因子中的保守B3結(jié)構(gòu)域［6］。另外，依據(jù)AP2/ERF氨基酸序列的保守性序列特征，通常又將ERF超家族分成兩個(gè)亞家族：CBF/DREB和ERF［6］。

ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育，如花和種子發(fā)育、果實(shí)成熟，植物非生物脅迫（如低溫、干旱和高鹽脅迫等［7］），以及植物抗病反應(yīng)中起著重要的作用［8，9］。水稻乙烯轉(zhuǎn)錄因子OsEATB通過(guò)下調(diào)赤霉素生物合成酶基因的表達(dá)控制節(jié)間的生長(zhǎng)［10］；ERF是植物非生物脅迫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子［11，12］，AtERF73應(yīng)對(duì)低氧脅迫［13］、AtRAP2應(yīng)對(duì)低鉀脅迫［14］；DREB類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子參與植物的高溫和干旱脅迫［15-17］；ERF是植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的重要調(diào)控基因［18］，超表達(dá)GmERF5的大豆植株能顯著增強(qiáng)對(duì)大豆疫霉菌的抗性［19］，超表達(dá)小麥ERF基因TaPIE1能顯著增強(qiáng)小麥植株對(duì)絲核菌（Rhizoctonia cerealis）的抗性［20］，辣椒的ERF基因CaERF1、CaJERF1在植物的抗病應(yīng)答以及非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［21，22］。因此，篩選、鑒定、分離新的ERF轉(zhuǎn)錄因子，將為利用生物技術(shù)改良植物的抗病、抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控提供有效的基因資源。

本研究在辣椒與根結(jié)線蟲(chóng)互作后的轉(zhuǎn)錄組分析基礎(chǔ)上，依據(jù)一系列備選上調(diào)表達(dá)的基因序列結(jié)合ERF基因的保守性，設(shè)計(jì)序列特異性引物，采用RT-PCR方法，從南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染辣椒后的根部組織中分離出一個(gè)乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因的核心序列，命名為CaERF18，研究這一基因在南方根結(jié)線蟲(chóng)誘導(dǎo)后不同時(shí)間的表達(dá)特性，初步了解CaERF18基因的結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)特征，為深入闡明CaERF18基因的結(jié)構(gòu)和功能、揭示CaERF18基因介導(dǎo)的辣椒抗根結(jié)線蟲(chóng)機(jī)制，最終為利用CaERF18基因改良植物的抗病性和抗逆性鑒定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒（Capsicum annuum L.）雙單倍體材料HDA149，含有單顯性抗根結(jié)線蟲(chóng)基因Me3，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所茆振川博士贈(zèng)送（最初從法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院Alain Palloxin 博士處引進(jìn)），在湖南省蔬菜研究所示范基地?cái)U(kuò)繁。南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）從湖南省蔬菜研究所示范基地采集，經(jīng)形態(tài)學(xué)、特異引物PCR鑒定后進(jìn)行致病性測(cè)定，最后采集單卵塊用茄門(mén)甜椒擴(kuò)繁。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 辣椒種子消毒后播種于育苗缽內(nèi)，幼苗長(zhǎng)至4-5片真葉時(shí)移栽，移栽10 d后接種南方根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)，每株接種1 000條，分別在取樣之后的第12、36和72 h取1.5-2.0 cm長(zhǎng)的根尖組織，液氮冷凍后置于-80℃的冰箱中，取用時(shí)混合磨樣?？俁NA采用天根生化科技有限公司的“TRNzol A+總RNA提取試劑盒”，總RNA的質(zhì)量和完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。第1鏈cDNA的合成采用SuperScript?Ⅲ First-Strand Synthesis System（Invitrogen）試劑盒。

1.2.2 CaERF18部分序列的克隆與分析 根據(jù)南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染辣椒后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一條含有約900 bp的序列顯著上調(diào)表達(dá)，初步預(yù)測(cè)是一個(gè)具有特定結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)此序列的結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物CaERF18-F（5'-AAGAATCGGTTCTCGCAAAAG-3'）和CaERF18-R（5'-ATTATCATCCTCAGTTTCACAG-3'），以1.2.1合成的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL擴(kuò)增體系（1 μL cDNA、1 μL CaERF18-F、1 μL CaERF18-R、1.6 μL dNTP（2.5 mmol/L）、2 μL 10×buffer、Taq DNA polymerase 0.2 μL（5 U/μL）、13.2 μL ddH2O）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。電泳后回收目的擴(kuò)增產(chǎn)物，連接、克隆到T 載體后送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Primer、DNAman軟件及NCBI網(wǎng)站的Nucleoide Blast、Protein Blast等程序進(jìn)行分析。

1.2.3 根結(jié)線蟲(chóng)侵染對(duì)CaERF18基因表達(dá)的影響 參照1.2.1的方法用南方根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)接種辣椒幼苗，以不接種南方根結(jié)線蟲(chóng)的辣椒幼苗為對(duì)照，分別在接種后的6、12、24、36和72 h取根尖組織樣品，用液氮速凍、-80℃保存。總RNA提取及cDNA的合成參照1.2.1。

根據(jù)CaERF18基因cDNA序列特征，用Primer Premier5.0和Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物為CaERF18-qF（Primer：5'-CGATGATTCTGAGAGCCCAC-3'）和CaERF18-qR（Primer：5'-TGCCCTATTACCTGGAAGTTGC-3'）。辣椒β-actin為參照基因［23］，擴(kuò)增引物為β-actin-qF（5'-TGCAGG-AATCCACGAGACTAC-3'）和β-actin-qR（5'-TACCACCACTGAGCACAATGTT-3'）。qRT-PCR以各取樣時(shí)間點(diǎn)的根部組織cDNA為模板，20 μL擴(kuò)增體系中包含10 μL 2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa），上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA（第一鏈cDNA合成后稀釋40倍）1.6 μL，加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s；94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完成后分析熔解曲線以及熒光值變化曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CaERF18的序列結(jié)構(gòu)

將辣椒植株接種南方根結(jié)線蟲(chóng)，接種后的12、36和72 h分別取根尖組織樣品，混合磨樣提取總RNA，用設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物對(duì)提取的RNA進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后擴(kuò)增出 694 bp的專(zhuān)一性片段（圖1）。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、克隆和測(cè)序，將測(cè)序序列在GenBank中進(jìn)行Blastn比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這一序列含有一典型的保守AP2/ERF基序，與煙草（Nicotiana tomentosiformis）NtERF118的相似性達(dá)46%，因此將其暫命名為CaERF18。進(jìn)一步分析推定的231個(gè)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，序列中含有一個(gè)長(zhǎng)度為59個(gè)氨基酸殘基組成的AP2結(jié)構(gòu)域，以及一段富含R、K氨基酸殘基的類(lèi)似核定位信號(hào)區(qū)（圖2），同時(shí)將這一推定的氨基酸序列在BaCeILo（http：//gpcr2.biocomp. unibo.it/bacello/index.htm）上分析，發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核，說(shuō)明CaERF18基因是在細(xì)胞核中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。

圖1 特異引物RT-PCR擴(kuò)增電泳圖

為進(jìn)一步分析比較CaERF18基因與其他種類(lèi)植物ERF基因的相似性，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BlastTP同源搜索，選擇了同源性較高的煙草（Nicotiana tomentosiformis L.）、番茄（Solanum lycopersicum L.）、辣椒（C. annuum L.）、芫菁（Brassica rapal L.）、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）6個(gè)物種中的8個(gè)ERF蛋白進(jìn)行多重氨基酸序列比對(duì)，比對(duì)采用DNAMAN軟件進(jìn)行，比對(duì)結(jié)果（圖3）顯示，8個(gè)基因在保守結(jié)構(gòu)域上都具有共同的氨基酸序列。相似性和進(jìn)化關(guān)系（圖4）表明，CaERF18與同科的煙草NtERF118和SlERF119的相似性最高。

2.2 CaERF18的誘導(dǎo)表達(dá)特征

用南方根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)侵染辣椒材料HDA149，依據(jù)線蟲(chóng)侵染的前期、初期、中期和后期4個(gè)時(shí)間段，取侵染后不同時(shí)間段的根尖組織，提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了CaERF18在病原線蟲(chóng)侵染后的表達(dá)特征。結(jié)果（圖5）顯示，線蟲(chóng)接種6 h的相對(duì)表達(dá)量為0.8倍，12 h后上升到了3.8倍，之后在24 h和36 h的表達(dá)量相對(duì)較為穩(wěn)定，分別為3.3倍和3.4倍，到72 h后，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到監(jiān)測(cè)的最高值，為7.2倍。根結(jié)線蟲(chóng)侵染的時(shí)間段來(lái)看，CaERF18的相對(duì)表達(dá)水平呈上升的趨勢(shì)，具有被病原物誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達(dá)的特征。

3 討論

ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類(lèi)參與植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子［7，19，24］。許多研究認(rèn)為ERF轉(zhuǎn)錄因子主要與植物抗逆，如水脅迫、鹽脅迫、耐旱、耐冷、耐熱等相關(guān)［7，12，17，25］，但越來(lái)越多的研究顯示，ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子是植物抗病應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物的抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。超表達(dá)GmERF5可增強(qiáng)大豆對(duì)大豆疫霉病的抗性［19］，TaPIE1通過(guò)激活乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中下游防衛(wèi)基因和脅迫基因的表達(dá)正調(diào)控小麥對(duì)病原物立枯絲核菌侵染和冷害的防衛(wèi)反應(yīng)［20］，ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子是油菜（B. napus）應(yīng)對(duì)生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要參與者［26］。而很多ERF類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子既參與生物脅迫又參與逆境脅迫［20，26］，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)分離到一個(gè)辣椒ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子的核心cDNA序列，將為下一步從轉(zhuǎn)錄水平上同時(shí)研究辣椒的抗病和抗逆機(jī)制提供一個(gè)新的候選基因。

圖2 CaERF18 cDNA 核心序列及推定的氨基酸序列

圖3 部分ERF轉(zhuǎn)錄因子與 CaERF18 蛋白AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的比對(duì)

多數(shù)ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子都具有誘導(dǎo)表達(dá)的特性，但具有一定的時(shí)空特性。根結(jié)線蟲(chóng)侵染辣椒是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，茆振川等［27］研究顯示，用根結(jié)線蟲(chóng)接種辣椒品種HDA149后的0-6 h根結(jié)線蟲(chóng)侵染率為0，12 h有少量線蟲(chóng)開(kāi)始侵入，24 h和36 h有大量線蟲(chóng)侵入，且在線蟲(chóng)周?chē)性S多壞死細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，在線蟲(chóng)接種后的6 h，CaERF18的相對(duì)表達(dá)量為0.8倍，此時(shí)線蟲(chóng)還尚未游動(dòng)到根尖組織附近，沒(méi)有觸動(dòng)辣椒的抗病性反應(yīng)，而當(dāng)接種后的12、24和36 h，CaERF18的相對(duì)表達(dá)量上升到了3.3-3.8倍，說(shuō)明大量線蟲(chóng)侵入后誘導(dǎo)的辣椒抗病性反應(yīng)中抗病相關(guān)基因的表達(dá)被激活，特別是在線蟲(chóng)大規(guī)模侵入后的72 h，CaERF18的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了7.2倍，而辣椒HDA149含有單顯性抗線蟲(chóng)基因Me3，推測(cè)CaERF18可能參與了這一由Me3基因介導(dǎo)的抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在這一過(guò)程中CaERF18由于根結(jié)線蟲(chóng)的大量侵入而被誘導(dǎo)激活和上調(diào)表達(dá)，可能具有重要的調(diào)控作用。在擬南芥中乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)北方根結(jié)線蟲(chóng)的侵入有強(qiáng)烈的吸引或趨避作用［28］，那么辣椒中的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)而言，是否具有如擬南芥一樣的吸引或趨避作用，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外CaERF18與NtERF118、SlERF119、SlERF4等具有較高的同源性，還具有典型的核定位信號(hào)區(qū)，推測(cè)CaERF18可能同時(shí)參與了抗病和抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此分離CaERF18的全長(zhǎng)cDNA，詳細(xì)了解多種病原物和多種逆境脅迫的表達(dá)特性、組織表達(dá)特性、調(diào)控的下游靶標(biāo)基因、參與的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等，將為闡明辣椒的抗病和抗逆分子機(jī)制提供新的基因資源，為今后的抗病和抗逆育種提供新思路。

圖4 CaERF18 與其他作物ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子同源性比對(duì)

圖5 CaERF18 在南方根結(jié)線蟲(chóng)接種的辣椒中表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

4 結(jié)論

通過(guò)RT-PCR方法從辣椒中分離到一個(gè)新的ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子核心序列，序列分析顯示該基因具有一個(gè)由59個(gè)氨基酸殘基組成的典型AP2/ERF類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核定位信號(hào)區(qū)。qRT-PCR分析表明，CaERF18受病原物南方根結(jié)線蟲(chóng)的侵染而上調(diào)表達(dá)，接種南方根結(jié)線蟲(chóng)6、12、24、36和72 h的相對(duì)表達(dá)量分別為0.8、3.8、3.3、3.4和7.2倍。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation and Induced Expression of Ethylene Transcription Factor Gene CaERF18 from Capscium annuumm

ZHENG Jing-yuan1LIU Feng1ZHU Chun-hui2
（1. Institute of Vegetables， Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410125；2. Plant Protection Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410125）

To clarify the candidate genes and expression of one ERF transcription factor in pepper（Capsicum annuum L. HDA149）during the incompatible interaction between HDA149 and Meloidogyne incognita，the core sequence of an ethylene transcription factor gene CaERF18 was isolated from pepper induced by M. incognita with RT-PCR. The cDNA core sequence was 694 bp，encoding 231 amino residues containing a conserved ERF motif of 59 amino acids that shared 44.3%，42.6% and 39.3% identities with the motif of NtERF118，SlERF4 and SlERF19，respectively. The expression analysis revealed that the expression of CaERF18 was significantly induced by M. incognita，the relative expression level of CaERF18 began to increase at 12 h with 3.8 times，and 7.2 times（peak）of the control at 72 h after inoculation with M. incognita. The expression of CaERF18 was strongly up-regulated by the nematode inoculation，which implied that the gene might play an important regulatory role in the resistant interaction of C. annuum to nematode.

pepper；root-knot nematode；ethylene；transcription factor；induced expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.014

2015-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201498），湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新項(xiàng)目（2014YB09）

鄭井元，男，博士，副研究員，研究方向：蔬菜病害；E-mail：zhengjingyuan2004@163.com