馬曉雯趙婷婷王俊剛張樹珍楊本鵬

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開發(fā)實驗，?？?571101）

甘蔗己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因ShHXT6的亞細胞定位及表達

馬曉雯1，2趙婷婷2王俊剛2張樹珍2楊本鵬2

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開發(fā)實驗，?？?571101）

通過NCBI公布的同源物種設(shè)計特異性引物克隆出甘蔗己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因ShHXT6。該基因cDNA長1 929 bp，其開放閱讀框編碼490個氨基酸。蛋白分子量為53.87 kD，理論等電點為9.44。該基因編碼的氨基酸與玉米、狗尾草和水稻的己糖轉(zhuǎn)運蛋白的一致性分別為80.85%、76.89%和72.86%等。系統(tǒng)進化樹分析表明，ShHXT6氨基酸與玉米HXT6蛋白一致性非常相近。ShHXT6在未成熟組織中表達較高，尤其是未成熟葉，在根中幾乎不表達。構(gòu)建該基因的瞬時表達載體，通過農(nóng)桿菌注射洋蔥表皮的方法對ShHXT6編碼的蛋白進行亞細胞定位，結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白定位于細胞膜。

甘蔗；己糖轉(zhuǎn)運蛋白；生長發(fā)育；表達；亞細胞定位

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是生長于熱帶和亞熱帶的高光效C4植物，是重要的糖料作物，同時也是蔗糖的主要原料，甘蔗糖占全國食糖的93%［1］。

在甘蔗中，蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物之一，也是甘蔗體內(nèi)光合產(chǎn)物運輸、分配及其儲存的主要形式［2］，同時也是重要的糖信號分子［3，4］。蔗糖從源組織運輸?shù)綆旖M織后，一部分被儲存，一部分不能直接被植物體利用，需要重新水解為單糖，在己糖轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助下被庫組織細胞吸收和利用［5］，維持植物正常生理功能。己糖轉(zhuǎn)運蛋白（hexose transporter，STP/HXT）是單糖轉(zhuǎn)運蛋白的一種，廣泛存在于植物中，能夠跨膜轉(zhuǎn)運葡萄糖、果糖和甘露糖等己糖類物質(zhì)。根據(jù)質(zhì)子對己糖轉(zhuǎn)運蛋白運輸方向，將植物己糖轉(zhuǎn)運蛋白分為3類：（1）H+/己糖同向轉(zhuǎn)運體［6，7］，（2）H+/己糖反向轉(zhuǎn)運體［7］，（3）己糖單向易化轉(zhuǎn)運體［7］。目前已經(jīng)從擬南芥中分離出26個己糖轉(zhuǎn)運蛋白［7］，葡萄中分離8個己糖轉(zhuǎn)運蛋白［8］，在其他植物中也陸續(xù)分離出己糖轉(zhuǎn)運蛋白家族［9-11］。其功能主要參與植株和花粉的生長，影響植物的生長與發(fā)育，或參與植物體內(nèi)己糖的運輸，最終決定經(jīng)濟器官的品質(zhì)；或參與植物與微生物的互作以及植物的衰老和逆境反應(yīng)等多種生命活動，影響植物的抗性。糖為植物生長發(fā)育提供所必需的碳源和能源，源器官中光合作用所合成的光合同化物通過糖轉(zhuǎn)運蛋白運輸?shù)綆炱鞴?，為細胞生長發(fā)育提供能源或為蛋白質(zhì)、核酸等提供骨架以維持植物生長發(fā)育［12］。

單糖轉(zhuǎn)運蛋白的定位與其功能有密切的關(guān)系。迄今研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)單糖轉(zhuǎn)運蛋白定位在細胞膜上［11］，也有研究發(fā)現(xiàn)了液泡中的糖轉(zhuǎn)運蛋白，在水稻中還發(fā)現(xiàn)了定位在高爾基體上的糖轉(zhuǎn)運蛋白［13］。不同部位的糖轉(zhuǎn)運蛋白其功能也不同。本研究從甘蔗中克隆出己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因ShHXT6，對其進行生物信息學(xué)分析，運用熒光定量分析技術(shù)對其在不同組織中的表達量進行分析，并構(gòu)建GFP融合載體，進行亞細胞定位，旨在進一步了解己糖轉(zhuǎn)運蛋白對甘蔗生物量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本實驗所需要的植物材料為甘蔗品種ROC22，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所海口實驗基地。

1.1.2 菌株與試劑 Escherichia coil DH5α購自廣州復(fù)能公司。LA-Taq、pMD19-T、T4連接酶、實時熒光定量PCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司。植物總RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axgen。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗總RNA及cDNA第一鏈合成 取成熟的甘蔗葉片放于液氮中迅速研磨成粉，再按Omega公司試劑盒說明書提取RNA，消化基因組DNA。cDNA 第一鏈合成按TaKaRa公司說明書操作。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)已知的植物HXT6序列設(shè)計引物，以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系為：2×GC buffer 12.5 μL，dNTPs 2.0 μL，cDNA 模板1 μL，引物 ShHXT6F（10 μmol/L）：1 μL，引物ShHXT6R（10 μmol/L）：1 μL，LA-Taq酶0.3 μL，ddH2O 7.2 μL，共25 μL。PCR 擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 2 min，34個循環(huán)；72℃ 15 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，將其產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，16℃過夜。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α，在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，分別以同樣的引物進行菌落PCR 擴增，挑取陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

表1 ShHXT6擴增引物

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN對ShHXT6氨基酸與其他物種的己糖轉(zhuǎn)運蛋白家族進行同源分析，并構(gòu)建進化樹。利用在線軟件對其蛋白質(zhì)分子量，等電點，親水性等進行分析。

1.2.4 GFP融合載體的構(gòu)建 對ShHXT基因序列進行分析，找到其完整開放閱讀框，在其兩端設(shè)計帶酶切位點的引物，如表2所示。PCR 反應(yīng)體系為：2×GC buffer 12.5 μL，dNTPs 2.0 μL，cDNA模板1 μL，引物 ShHXT6F（10 μmol/L）：1 μL，引物ShHXT6R（10 μmol/L）：1 μL，LA-Taq酶0.3 μL，ddH2O7.2 μL，共25 μL。PCR 擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 2 min，34個循環(huán)；72℃ 15 min。將PCR產(chǎn)物回收連接到pMD19-Tsimple載體中，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進行PCR驗證后提取質(zhì)粒ShHXT-19T。用限制性內(nèi)切酶Spe I對ShHXT-19T和pCAMBIA1302質(zhì)粒進行單酶切，酶切產(chǎn)物回收ShHXT-19T小片段和pCAMBIA1302大片段，用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化到DH5α，重組質(zhì)粒酶切驗證后送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，獲得pCAMBIA-ShHXT融合載體。

表2 ShHXT-GFP擴增引物

1.2.5 實時熒光定量分析 取新鮮甘蔗的未成熟葉、成熟葉、未成熟莖、成熟莖及根。未成熟葉為甘蔗未抽出心葉；成熟葉為甘蔗植株由上及下完全展開且可見肥厚帶的+3葉。未成熟莖為植株上部莖頂端生長點以下第2節(jié)；成熟莖為甘蔗植株由下及上第3或4節(jié)。根為挖取植株后成熟根。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq說明書進行實時熒光定量PCR分析，以甘蔗GADPH為內(nèi)參矯正目的基因。PCR反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，34個循環(huán)。PCR引物，見表3。

表3 ShHXT6熒光定量引物

1.2.6 農(nóng)桿菌注射洋蔥表皮細胞 參考Xu等［14］的方法并進行修改。挑取對照質(zhì)粒pCAMBIA1302和重組質(zhì)粒pCAMBIA-ShHXT的陽性單克隆，至10 mL YEP 液體培養(yǎng)基（10 mg/mL Str+20 mg/mL Rif +50 mg/mL Kan），28℃，振蕩培養(yǎng)至OD600=1.5-2.0，離心，收集菌體。再用50 mL配制好的侵染液重懸。最后將農(nóng)桿菌侵染液注入已經(jīng)在28℃，暗培養(yǎng)48 h的洋蔥表皮，28℃暗培養(yǎng)72 h。再將洋蔥表皮置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 ShHXT6的克隆

以提取的甘蔗葉片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行RT-PCR。擴增產(chǎn)物進行電泳，得到一條1 900 bp左右的條帶（圖1），與預(yù)期條帶大小一致，將其回收，連接轉(zhuǎn)化，并送公司測序后得到1 929 bp長度的序列。

圖1 甘蔗ShHXT6 PCR擴增產(chǎn)物

2.2 ShHXT6結(jié)構(gòu)分析

利用ProtParam軟件進行在線預(yù)測分析，該基因編碼475個氨基酸殘基（圖2），蛋白分子量為51.95 kD，理論等電點為9.47，不穩(wěn)定系數(shù)為42.06，說明為穩(wěn)定蛋白。總平均疏水指數(shù)為0.463，表明該蛋白為疏水性蛋白。富含精氨酸Arg（A）（6.5%），絲氨酸Ser（S）（5.5%），蘇氨酸Thr（T）（6.3%），丙氨酸Ala（A）（10.1%），亮氨酸Leu（L）（11.4%），苯丙氨酸Phe（F）（6.7%），纈氨酸Val（V）（9.5%）。其二級結(jié)構(gòu)α-螺旋（H）47.96%，β-折疊（S）19.59%，β-轉(zhuǎn)角（T）9.59%，無規(guī)則卷曲（C）22.86%。

2.3 ShHXT6同源性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

從NCBI在線數(shù)據(jù)庫中選出13個不同作物的己糖轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列，將這些氨基酸序列與甘蔗ShHXT6的序列進行同源性分析，結(jié)果（圖3）顯示，該基因編碼的氨基酸與玉米、狗尾草和水稻的己糖轉(zhuǎn)運蛋白一致性分別為80.85%、76.89%和72.86%。表明HXT6家族類型多樣，但不同植物間的HXT6結(jié)構(gòu)保守。

甘蔗ShHXT6氨基酸序列與其他植物己糖轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖4）顯示，這些己糖轉(zhuǎn)運蛋白分為4類：甘蔗與玉米聚為一類；圖小麥（EMS51881.1）與山羊草（EMT33361.1）聚為一類；海棗（XP_008803828.1）與油棕（XP_010919657.1）聚為一類，ShHXT6與玉米的HXT6最接近。

圖2 甘蔗ShHXT6的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 甘蔗ShHXT6推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物的HXT6同源性分析

2.4 GFP融合載體的構(gòu)建

將得到的ShHXT-19T和pCAMBIA1302質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Spe I進行單酶切回收ShHXT-19T小片段和pCAMBIA1302大片段，用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化到DH5α，然后將重組質(zhì)粒進行酶切驗證。結(jié)果（圖5）表明，重組質(zhì)粒測序結(jié)構(gòu)正確，獲得pCAMBIA-ShHXT融合載體。

圖4 甘蔗ShHXT6與其他植物HXT6的進化樹

圖5 pCAMBIA-ShHXT酶切電泳圖

2.5 ShHXT6基因表達量分析

熒光定量PCR檢測甘蔗葉、莖和根中HXT6表達量變化，結(jié)果（圖6）表明，該基因在甘蔗不同組織的表達差異，在葉片中，未成熟葉表達量遠遠高于成熟葉片；在莖中，未成熟莖表達量也高于成熟莖。尤其是未成熟葉，表達量達到最高，在根中幾乎不表達。說明它在未成熟組織中表達量高。

圖6 ShHXT6在甘蔗不同組織的差異性表達

2.6 ShHXT在洋蔥表皮中的亞細胞定位

使用熒光顯微鏡在紫外光下觀察農(nóng)桿菌侵染的洋蔥表皮細胞中的GFP表達情況。結(jié)果（圖6）顯示，空載pCAMBIA1302在細胞各個部位都能觀察到綠色熒光（圖6-A），轉(zhuǎn)化的pCAMBIA-ShHXT融合載體的洋蔥細胞，在細胞膜上有明顯的綠色熒光，有明顯的定位特征（圖6-C），因此推測ShHXT基因編碼的蛋白是一種膜蛋白。

圖7 ShHXT在洋蔥表皮中的亞細胞定位

3 討論

最初研究發(fā)現(xiàn)己糖轉(zhuǎn)運蛋白主要在庫中表達，即蔗糖直接從韌皮部釋放到質(zhì)外體中，并在此處由蔗糖轉(zhuǎn)化酶分解成單糖，再由己糖轉(zhuǎn)運蛋白帶到庫組織中，為細胞分化提供能量，從而影響植物生長發(fā)育，其中包括胚胎形成、種子萌發(fā)、營養(yǎng)生長和發(fā)育等。目前已經(jīng)從一些植物中克隆出HXT基因，并對其功能進行研究。從煙草中分離出來的己糖轉(zhuǎn)運蛋白主要在庫組織表達：如根、花及未成熟葉［15］；擬南芥中的己糖轉(zhuǎn)運蛋白主要在根和花中表達［16］。葡萄中的己糖轉(zhuǎn)運蛋白主要在漿果和未成熟葉中表達［17］，黃瓜中己糖轉(zhuǎn)運蛋白主要在花粉管中表達，促進花粉管的發(fā)育［18］。但在甘蔗中對HXT的研究很少。本研究從甘蔗中分離出HXT基因 ShHXT6，氨基酸一致性和系統(tǒng)進化樹分析得到 ShHXT6是一種與甘蔗糖轉(zhuǎn)運相關(guān)的己糖轉(zhuǎn)運蛋白。過去對甘蔗的研究主要集中在甘蔗體內(nèi)物質(zhì)代謝的相關(guān)酶及蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白，從而提供甘蔗產(chǎn)量并改良品質(zhì)。但對己糖轉(zhuǎn)運蛋白在甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)方面的研究甚少。本研究表明，ShHXT6在甘蔗未成熟葉中表達最多，在未成熟莖中也有表達，這與前人的研究結(jié)果相符。這說明它在未成熟組織中表達較高，可能在未成熟組織尤其是未成熟葉中對其利用率高，促進其細胞分化，為植物組織提供碳源和能量，促進其生長發(fā)育或儲存在其中。光合產(chǎn)物的運輸與分配直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，植物中的光合產(chǎn)物要有效地轉(zhuǎn)運到庫組織中才能提高作物經(jīng)濟產(chǎn)量。

單糖轉(zhuǎn)運蛋白主要定位在膜蛋白，參與糖類物質(zhì)的運輸，為庫組織的生長發(fā)育提供必需的能源和碳源。也有一些糖轉(zhuǎn)運蛋白定位于液泡膜，可能參與糖類物質(zhì)的存儲［20］。本研究表明，ShHXT6基因編碼的蛋白定位在細胞膜，可能參與糖類物質(zhì)的運輸，這與表達量分析結(jié)果一致。本研究對ShHXT6基因進行克隆，對其進行了表達量的分析及亞細胞定位，為了解甘蔗體內(nèi)光合產(chǎn)物的運輸分配，提高甘蔗產(chǎn)量及品質(zhì)改良提供基因資源。

4 結(jié)論

甘蔗ShHXT6基因包含一個1 470 bp的開放閱讀框，編碼460個氨基酸；該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為42.20，屬于穩(wěn)定蛋白。其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。ShHXT6基因編碼的氨基酸與玉米的HXT6的一致性最高。ShHXT6主要在未成熟葉中表達。亞細胞定位表明，ShHXT6基因編碼的蛋白是一種膜蛋白。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Subcellular Localization and Expression Analysis of Hexose Transporter Gene ShHXT6 in Sugarcane

MA Xiao-wen1，2ZHAO Ting-ting2WANG Jun-gang2ZHANG Shu-zhen2YANG Ben-peng2
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Sugarcane Research Center of CATAS，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of CATAS，Key Laboratory for Tropical Crops of Ministry of Agriculture，Haikou 571101）

The gene ShHXT6 of hexose transporter（HXT）of sugarcane was cloned with the specific primers designed according to the homologous species in NCBI. The cDNA of ShHXT6 was 1 929 bp，encoding 460 amino acids. The predicted molecular mass was 53.87 kD，and pI was 9.44. The deduced amino acid of ShHXT6 with the HXT from Zea mays，Setaria italica and Oryza sativa was in consistence by 80.85%，76.89% and 72.86%，respectively. Phylogenetic tree analysis showed that the consistency of ShHXT6 amino acid and maize HXT6 protein was very similar. The expression of ShHXT6 was high in the immature tissues，especially in the immature leaves，but nearly no expression in the roots. The transient expression vector of this gene was constructed，and the subcellular localization of protein encoded by ShHXT6 was determined by the method of Agrobacterium injection into onion epidermis，and the results showed that the protein encoded by this gene was located in the cell membrane.

sugarcane；hexose transporter；growth and development；expression；subcelular localization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.013

2015-06-16

國家“863”計劃（2013AA102604-1），海南省自然科學(xué)基金項目（313078），海南省重大科技（ZDZX2013023-1）

馬曉雯，女，碩士研究生，研究方向：植物遺傳育種，E-mail：mxwf15095555680@163.com；趙婷婷為本文并列第一作者

楊本鵬，男，研究員，研究方向：甘蔗細胞工程與耕作栽培；E-mail：y-bp@163.com