王靜 潘孝明 劉宇 梁興國

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

酶法合成RNA的相關(guān)技術(shù)研究進展

王靜 潘孝明 劉宇 梁興國

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

近些年來RNA相關(guān)研究發(fā)展迅速，從質(zhì)和量兩方面對RNA合成技術(shù)提出了更高的要求。RNA合成方法包括化學(xué)合成和酶法合成兩種。目前已商業(yè)化的RNA化學(xué)合成法能夠?qū)崿F(xiàn)長度小于90個堿基的RNA合成，但合成費用相對較高，使許多研究難以展開。相對于化學(xué)合成，酶法合成具有效率高、條件溫和的特性，能夠合成長序列，是一種高效、低耗的RNA合成方案。酶法合成的技術(shù)流程包括轉(zhuǎn)錄和加工兩步，其中轉(zhuǎn)錄的模型主要分為線性轉(zhuǎn)錄和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄兩種，不同的模型產(chǎn)生的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特性不同，需要采用相應(yīng)的加工方式對其進行處理才能獲得準(zhǔn)確的目的RNA產(chǎn)物。近年來研究者們不斷地研究探索RNA的酶法合成，發(fā)現(xiàn)并構(gòu)建了多種轉(zhuǎn)錄模型和初始轉(zhuǎn)錄物的加工方案，將從酶法合成RNA的轉(zhuǎn)錄模型和加工技術(shù)的原理、特點和問題等方面進行概述，以期為后續(xù)酶法合成RNA的進一步研究和選擇性應(yīng)用提供參考。

RNA；酶法合成；線性轉(zhuǎn)錄；滾環(huán)轉(zhuǎn)錄；特異位點剪切

隨著生物化學(xué)與分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，RNA的生物功能被越來越多地發(fā)現(xiàn)與報道，如microRNA（miRNA）［1，2］、small interfering RNA（siRNA）［3，4］和nanostructure RNA［5，6］等幾類RNA的研究均取得了突破性進展。同時，大量開展RNA相關(guān)研究從質(zhì)和量兩方面對RNA的合成技術(shù)提出了更高的要求。

RNA材料的合成方式包括化學(xué)合成和酶法合成兩種。RNA的化學(xué)合成是按照3'→5'磷酸二酯鍵的方向依次連接核苷酸，需采用特定的化學(xué)試劑對相應(yīng)的基團進行適當(dāng)?shù)募颖Ｗo和去保護來完成。核酸化學(xué)合成起始于20世紀前期［7］，并已在30年前實現(xiàn)了自動化，可滿足長度小于90個堿基的RNA合成。此外，化學(xué)合成可以實現(xiàn)RNA的化學(xué)修飾，目前仍是一種廣泛應(yīng)用的RNA合成方法。但由于核糖核苷糖環(huán)的2'-OH和3'-OH反應(yīng)活性近似，導(dǎo)致特定官能團加保護和脫保護困難［8］，合成收率隨序列長度增加而顯著降低［9］。另外，由于化學(xué)合成需要采用固相合成法，合成規(guī)模難以擴大，無法滿足核酸類藥物的研發(fā)與制備要求，許多報道也提出當(dāng)前化學(xué)合成技術(shù)不能滿足快速增長的RNA研究的需求［10，11］。

酶法合成RNA是在RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）體外轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上建立的生物制備方法，現(xiàn)已建立了多種模型［12-14］。相對于化學(xué)合成的固相合成模式，酶法合成更易于實現(xiàn)較大規(guī)模生產(chǎn)，適合進行一些核酸類藥物的生產(chǎn)，是一種發(fā)展前景良好的RNA合成方法［9，15］。但酶法合成一般較難實現(xiàn)RNA的修飾，仍然有許多技術(shù)問題需要解決。深入了解RNA酶法合成相關(guān)技術(shù)的原理和特性，將有助于上述問題的解決。到目前為止，國內(nèi)外期刊鮮有酶法合成RNA的相關(guān)綜述報道。本文就RNA酶法合成的轉(zhuǎn)錄模型和加工技術(shù)的機制、設(shè)計和特點等方面進行概述，以期為后續(xù)RNA酶法合成的研究及其應(yīng)用范圍的拓展提供參考。

1 RNA酶法合成簡介

酶法合成RNA的制備流程包括轉(zhuǎn)錄和加工兩個核心部分，轉(zhuǎn)錄過程要求合成多拷貝，加工過程要求終產(chǎn)物序列同所需的序列完全一致。轉(zhuǎn)錄是酶法合成的基礎(chǔ)，具有效率高、反應(yīng)條件溫和的特點，所使用的RNA聚合酶主要包括T7和SP6兩種噬菌體RNA聚合酶。在DNA雙鏈模板轉(zhuǎn)錄模型中，這兩種RNA酶識別各自的啟動子，在最適條件下可以獲得相對DNA模板幾百倍甚至幾千倍的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物［12，15］。但高效的轉(zhuǎn)錄要求起始轉(zhuǎn)錄的前三位堿基富含嘌呤，特別是+1位必須是鳥嘌呤［16］。T7和SP6 RNA聚合酶還會在完成模板編碼的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成后繼續(xù)在其3'端添加1-3 nt任意堿基，造成產(chǎn)物3'端異質(zhì)［13］。不同的轉(zhuǎn)錄模型形成的初始轉(zhuǎn)錄物不同，線性轉(zhuǎn)錄模型產(chǎn)生的是模板編碼的RNA產(chǎn)物單體；滾環(huán)模型產(chǎn)生的是模板編碼的RNA首尾串聯(lián)而成的聚合物。因此，要得到目的產(chǎn)物，兩種模型轉(zhuǎn)錄初始產(chǎn)物都需要在后續(xù)加工過程中通過特異性水解酶對其進行切割。本綜述分別從轉(zhuǎn)錄和加工兩個方面分別進行論述。

2 RNA酶法合成中的轉(zhuǎn)錄模型

2.1 線性轉(zhuǎn)錄模型

根據(jù)轉(zhuǎn)錄模板的類型，轉(zhuǎn)錄大致可以分為線性轉(zhuǎn)錄和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄兩種，它們具有不同的啟動子依賴性、轉(zhuǎn)錄效率、特性及問題［12-14］。線性轉(zhuǎn)錄模型是指以線性的DNA單鏈或雙鏈為模板進行轉(zhuǎn)錄，根據(jù)模型中啟動子的存在與否，又可以分為啟動子-線性轉(zhuǎn)錄模型和無啟動子-線性轉(zhuǎn)錄模型兩類。

最早的啟動子-線性轉(zhuǎn)錄模型由Melton等［12］在1984年構(gòu)建，該模型在SP6 RNA聚合酶的作用下能夠轉(zhuǎn)錄100-6 000個堿基長度的RNA。隨著分子生物技術(shù)的進步，該方法也得到改進和完善，成為一種常規(guī)的轉(zhuǎn)錄方案，具體的技術(shù)方案如圖1所示：（1）將用于轉(zhuǎn)錄的雙鏈模板插入到載體的多克隆位點，要求插入片段連接在相應(yīng)啟動子的下游和相應(yīng)酶切位點之間；（2）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，測序鑒定篩選陽性克隆，提取陽性克隆的重組質(zhì)粒；（3）采用限制性內(nèi)切酶在插入片段的下游切割，使載體線性化；（4）采用T7或SP6 RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄［17-19］。對于雙鏈RNA的制備可以通過將轉(zhuǎn)錄模板插入雙反向的啟動子之間和特異酶切位點之間，進行兩向的線性轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)。2013年，Rouhana等［20］采用該方法制備了雙鏈RNA，并以此作為材料對渦蟲進行RNAi研究。以質(zhì)粒構(gòu)建的啟動子-線性轉(zhuǎn)錄模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用在許多轉(zhuǎn)錄或基因表達的相關(guān)研究中［21-23］，一般涉及的RNA產(chǎn)物較長，對產(chǎn)物末端準(zhǔn)確性要求不高，不需要后續(xù)的加工處理即可使用。

1987年，Milligan等［13］直接用化學(xué)合成的兩條分別含有啟動子信息和模板信息的DNA鏈經(jīng)退火形成雙鏈模板（圖2-A），轉(zhuǎn)錄合成12-35 nt的RNA，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)錄條件最終能夠獲得毫克級的產(chǎn)物。由于該方法不需要載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化等繁瑣的操作，所以簡單易行，被廣泛應(yīng)用于相對較短的RNA序列的制備［24，25］。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建啟動子-雙鏈轉(zhuǎn)錄模型的轉(zhuǎn)錄流程

Milligan等［13］還嘗試構(gòu)建了一種截短型啟動子-線性轉(zhuǎn)錄模型（圖2-B），其非模板鏈只含有T7 RNA聚合酶啟動子-17 - +1位的堿基，而模板鏈與非截短型的（圖2-A）相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)截短型能夠形成與非截短型雙鏈模板同樣的RNA產(chǎn)物，并且截短的非模板鏈去除-17 - -14和-4 - +2位一個或數(shù)個堿基后仍然可以發(fā)生轉(zhuǎn)錄。2002年，Donzé和Picard借助該模型建立了一個酶法合成siRNA的方案，并成功地運用到哺乳動物細胞RNAi的研究中［26］。2012年，Cheong等［27］聯(lián)合該轉(zhuǎn)錄模型和DNA-親和色譜建立了一種快速制備RNA樣品的方法，合成的RNA可以滿足X-射線、NMR等分析要求。令人意外的是，Sharmeen和Taylor［28］發(fā)現(xiàn)了兩種無啟動子轉(zhuǎn)錄模型。其中一種是引物模型（圖2-C），由一條短鏈DNA于模板鏈的3'端退火，在完全無啟動子的情況下引發(fā)轉(zhuǎn)錄。另一種是無啟動子且無引物的單鏈DNA模板轉(zhuǎn)錄模型（圖2-D），令人費解的是既沒有啟動子又沒有引物的情況下，SP6 RNA聚合酶能夠僅以一條單鏈DNA寡核苷酸鏈為模板進行轉(zhuǎn)錄，并產(chǎn)生與DNA寡核苷酸鏈相同大小的RNA。但是這種模型的合成效率顯著降低。1988年，Krupp［29］采用不同序列的寡核苷酸鏈實驗該模型的轉(zhuǎn)錄特性發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)錄可能會引發(fā)許多異質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)生，不能保證從同一位點起始轉(zhuǎn)錄。由此可以看出，在啟動子存在的情況下，RNA聚合酶會以啟動子轉(zhuǎn)錄的機制為主導(dǎo)，而在啟動子缺失的情況下，RNA聚合酶可能是識別DNA的二級結(jié)構(gòu)起始轉(zhuǎn)錄信號，并以較低的效率完成之后的轉(zhuǎn)錄［30，31］。

圖2 幾種線性轉(zhuǎn)錄模型

此外，Milligan等［13］在研究中發(fā)現(xiàn)了T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在3'端異質(zhì)的問題，這個缺陷極大影響了酶法合成在RNA合成方面的應(yīng)用。早期Moran等報道提出DNA模板中引入不能與NTP形成堿基配對的核苷類似物修飾，可能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄在核苷類似物之前終止。他們研究了3種類似物：4-甲基吲哚 β-脫氧核糖核苷（4-methylindole β-deoxynucleoside）、1-萘基 α-脫氧核糖核苷（1-naphthyl α-deoxynucleoside）和1-芘基 α-脫氧核糖核苷（1-pyrenyl α-deoxynucleoside），結(jié)果只有4-甲基吲哚β-脫氧核糖核苷在一定程度有所改善，但仍未完全抑制產(chǎn)物異質(zhì)［24］。1999年，Kao等［32，33］發(fā)現(xiàn)DNA模板鏈的5'端兩個堿基進行氧甲基化修飾能夠明顯降低未端含單個多余堿基的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)生，但是對含兩個多余堿基的產(chǎn)物沒有改善。而Sherlin等［34］酶法合成tRNA時對模板鏈5'端兩個堿基進行2'-O-甲基化修飾，獲得可用于X-射線晶體分析的RNA樣品?？梢姡瑢€性轉(zhuǎn)錄模型的模板適當(dāng)修飾可以使初始轉(zhuǎn)錄物更接近準(zhǔn)確產(chǎn)物，降低后續(xù)加工的壓力。

2.2 滾環(huán)轉(zhuǎn)錄模型

1989年，Krupp［12］發(fā)現(xiàn)一種SP6和T7 RNA聚合酶的新型轉(zhuǎn)錄模型，即滾環(huán)轉(zhuǎn)錄（Rolling circle transcription，RCT）（圖3-A）。該模型以一種單鏈未成環(huán)的DNA（5'-GCATATTTTAAAGTAATATCGTCCA-3'）為轉(zhuǎn)錄模板，自其3'端第一個C起始轉(zhuǎn)錄，到達5'末端后并未終止，而是以DNA的3'端為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，形成繞環(huán)，這是滾環(huán)轉(zhuǎn)錄的最初模型。猜測可能的機制是鏈內(nèi)部分氫鍵作用拉近了模板鏈3'末端與5'末端，形成一個近似的連接端和單鏈環(huán)。1995年，Daubendiek等［35］報道了一類化學(xué)合成的單鏈環(huán)狀DNA模板的轉(zhuǎn)錄模型，圖3-B所示為其最初所用的34 nt DNA環(huán)狀模板，該模板環(huán)內(nèi)無連續(xù)互補序列，幾乎不可能形成雙螺旋的二級結(jié)構(gòu)，最終能夠合成12-260次繞環(huán)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。之后，該研究團隊探索了不同大?。?3 nt/73 nt/83 nt）的環(huán)狀DNA，發(fā)現(xiàn)它們均能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄［31，36］。值得注意的是，這些轉(zhuǎn)錄的模板都沒有啟動子序列。關(guān)于單環(huán)模板的轉(zhuǎn)錄起始機制尚無定論，猜測在缺失啟動子的情況下，雙鏈上的突環(huán)、泡狀結(jié)構(gòu)（bubble）、缺口（gap）和發(fā)卡（hairpin）結(jié)構(gòu)都有可能引發(fā)轉(zhuǎn)錄的起始［30，37，38］，DNA單環(huán)的構(gòu)型如何引發(fā)RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄還需進一步研究。研究者已將該方法成功地應(yīng)用到RNA ladder的制作、納米環(huán)載體的構(gòu)建以及具有催化活性的RNA合成等方面［31，36，39］。2015年，Wang等［40］建立了一種基于滾環(huán)模型的RNA合成方法——滾環(huán)轉(zhuǎn)錄-特異位點斷聯(lián)法（RCT-site-specific disconnection）（圖3-C），該方法以目的RNA的互補DNA鏈為模板，首先以T4 DNA連接酶聯(lián)合一條短鏈DNA splint將模板鏈連接成環(huán)，并同時以該splint為引物引發(fā)高效率的滾環(huán)轉(zhuǎn)錄，合成的初始RNA產(chǎn)物是目的RNA的多串聯(lián)產(chǎn)物，然后經(jīng)后續(xù)特異位點切割處理，形成最終產(chǎn)物。

圖3 滾環(huán)轉(zhuǎn)錄模型

3 初始轉(zhuǎn)錄物的加工技術(shù)

不同的轉(zhuǎn)錄模型產(chǎn)生的初始轉(zhuǎn)錄物特性不同。對于啟動子-線性轉(zhuǎn)錄模型，由于其具有轉(zhuǎn)錄起始5'端富嘌呤依賴性和3'端產(chǎn)物異質(zhì)性，往往對模板進行加長設(shè)計，轉(zhuǎn)錄后形成5'和3'端附含有外序列的初始RNA產(chǎn)物，需將這些多余的序列切除。對于滾環(huán)模型，它的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是目標(biāo)RNA的串聯(lián)產(chǎn)物，需要在RNA單體首尾連接處進行特異位點剪切。所以，大部分初始轉(zhuǎn)錄物需用ribozyme、DNAzyme和RNase H等進行酶切處理，以獲得準(zhǔn)確的RNA產(chǎn)物。

3.1 Ribozyme 特異位點酶切

Ribozyme在酶法合成RNA研究中的應(yīng)用相對較多。Wich?acz［41］小組為了解決轉(zhuǎn)錄終產(chǎn)物3'異質(zhì)的問題，設(shè)計的模板鏈5'端比目的產(chǎn)物長7 nt，采用trans-acting antigenomic delata ribozyme識別并剪切掉這7 nt多余序列。Price等［42］在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列前后分別設(shè)計了一個hammerhead ribozyme，能夠?qū)D(zhuǎn)錄產(chǎn)物兩端分別進行自剪切，從而獲得準(zhǔn)確的RNA產(chǎn)物，并應(yīng)用到RNA-蛋白復(fù)合體的結(jié)晶分析。Walker［43］小組在啟動子-線性轉(zhuǎn)錄模型的基礎(chǔ)之上，構(gòu)建了一個可常規(guī)應(yīng)用的質(zhì)粒載體，在目的模板的上下游分別插入一個hammerhead ribozyme和一個hepatitis delta virus ribozyme相對應(yīng)的模板，初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物左右兩端的ribozyme分別發(fā)揮自剪切功能，形成所需的RNA產(chǎn)物。這種方法需要的模板較長，設(shè)計時需考慮較多，不適于大宗的RNA生產(chǎn)。更有意思的是，Daubendiek等［31］在滾環(huán)轉(zhuǎn)錄模型的應(yīng)用中將ribozyme設(shè)計到環(huán)形DNA模板中，獲得的串聯(lián)轉(zhuǎn)錄物中的ribozyme能夠進行特異位點自剪切而形成ribozyme的單體。

3.2 DNAzyme特異位點酶切

同ribozyme類似，DNAzyme也可以進行特異性剪切。DNAzyme的序列組成包括一個活性中心和兩條用于識別底物的結(jié)合臂。目前應(yīng)用于RNA加工處理較多的是8-17和10-23 DNAzyme兩種［44-47］。Sohail等［48］用8-17 DNAzyme定點剪切初始轉(zhuǎn)錄物5'端多余序列，獲得的目的siRNA可成功用于MDAMB-231人類乳腺癌細胞I型胰島素樣生長因子受體（IGF1R）mRNA的RNAi研究。Cheong等［27］借助于DNA親和色譜建立了一種制備RNA樣品的方法，即轉(zhuǎn)錄后得到的初始轉(zhuǎn)錄物相對于目的產(chǎn)物序列3'端含有一段多余序列，這段多余序列是與親和色譜柱結(jié)合的親和標(biāo)簽，經(jīng)過親和分離純化后采用10-23 DNAzyme對其剪切加工，再經(jīng)DNase I水解10-23 DNAzyme獲得目的RNA產(chǎn)物。但是，DNAzyme的剪切特性具有序列偏好性且剪切效率差異較大，譬如10-23 DNAzyme偏好剪切5'-嘌呤-嘧啶-3'之間的磷酸二酯鍵（5'…R↓Y…3'，R=A或G，Y=U或C，其中R不形成堿基配對，Y必須與10-23 DNAzyme形成堿基配對），而8-17 DNAzyme主要識別5'…A↓G…3'，斷裂A與G之間的磷酸二酯鍵［49］。所以核酶特異位點剪切的加工方法在通用性上有其局限性。

3.3 RNase H 特異位點酶切

目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)能夠識別RNA序列的限制性內(nèi)切酶。RNase H是一類核酸內(nèi)切酶，能夠水解RNA-DNA雜合子中RNA的磷酸二酯鍵，而不水解雙鏈RNA或單鏈RNA。而1987年，Inoue等［50］發(fā)現(xiàn)RNase H能識別雙鏈RNA-DNA雜合子中3個連續(xù)2'-O-甲基化修飾的核苷酸和連續(xù)4個無修飾的核苷酸的序列，從而只切割2'-O-甲基化修飾和無修飾核苷酸之間的磷酸二酯鍵。之后，氧甲基化修飾的DNA被應(yīng)用于輔助RNase H特異位點剪切，包括RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工處理中［51］。Miller等［52］設(shè)計轉(zhuǎn)錄了一個3'端加長25 nt序列的初始tRNALys，3產(chǎn)物，采用氧甲基化修飾的DNA輔助RNase H對其進行特異酶切，結(jié)果證明該方法酶切的產(chǎn)物與化學(xué)合成的tRNALys，3大小一致。Wang等［40］對該技術(shù)中DNA氧甲基化修飾的參數(shù)進行了優(yōu)化，結(jié)合滾環(huán)轉(zhuǎn)錄和RNase H的特異位點酶切實現(xiàn)了miRNA的準(zhǔn)確合成，可得到DNA模板4×103倍以上的miRNA，是目前最具潛力的酶法合成RNA方案之一。

4 結(jié)語

高效、準(zhǔn)確的RNA合成方式是RNA相關(guān)研究的基礎(chǔ)和根本，目前已有的轉(zhuǎn)錄和加工技術(shù)已經(jīng)能夠合成準(zhǔn)確的RNA材料，研究者可根據(jù)研究需求選擇合適的合成方案。相對于化學(xué)合成法，酶法合成具有技術(shù)門檻低、成本低和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢，然而，在特殊堿基修飾和序列通用性兩個方面仍難以滿足研究需求。就目前而言，對于特定堿基的基團修飾基本上只能依賴于化學(xué)合成，酶法合成難以實現(xiàn)。酶法合成的通用性相對較低，主要原因在于不同目的RNA的轉(zhuǎn)錄起始效率和剪切效率都因序列位點不同而存在較大差異，需要有針對性地進行設(shè)計和優(yōu)化，對于多種RNA的合成負擔(dān)相對較大。因此，應(yīng)針對轉(zhuǎn)錄和加工過程中的序列反應(yīng)特性進一步研究。

此外，由于酶法合成需要進行加工處理才能獲得準(zhǔn)確的RNA產(chǎn)物，相對增加了制備的成本和產(chǎn)物降解的風(fēng)險，根本問題還是在于T7和SP6 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄特性。2007年，科學(xué)家們對一種海洋藍細菌的噬藍藻體Syn5進行基因組測序、蛋白結(jié)構(gòu)分析［53，54］，成功純化獲得Syn5 RNA聚合酶，2013年報道發(fā)現(xiàn)該聚合酶具有較顯著的轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢：（1）對轉(zhuǎn)錄初始堿基富嘌呤的偏好性明顯低于T7 RNA聚合酶；（2）不具有在準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3'端添加任意堿基的能力，能夠形成準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄物［55，56］。這無疑是一項重要的發(fā)現(xiàn)，但仍需對其轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性進一步驗證。在酶法合成方面，分子技術(shù)仍有可能繼續(xù)改進其高效性和準(zhǔn)確性，所以期待更為高效、低耗的酶法合成技術(shù)為RNA合成提供新途徑，使RNA相關(guān)研究得以更廣泛地展開。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Enzymatic Synthesis of RNA

WANG Jing PAN Xiao-ming LIU Yu LIANG Xing-guo
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）

With the rapid development of RNA related studies，RNA synthesis technology is further challenged from two aspects of quality and quantity. At present there are mainly two methods for RNA synthesis，chemical synthesis and enzymatic synthesis. By the commercialized chemical way，the synthesis of RNA with ＜ 90 bases is achieved；however，the cost of the synthesis is relatively high，which leads the initiation of many researches in difficulty. Compared to the chemical way，the enzymatic synthesis presents the characteristics of the high efficiency and mild reaction conditions，and by it a long sequence of RNA can be synthesized，thus，it is an efficient and lowcost measure for RNA synthesis. The enzymatic production of RNA is in two steps，transcription and processing of initial transcripts. The transcription may be further classified into the linear transcription and the rolling circle transcription model，with which the characteristics of initial transcripts vary，and the corresponding processing methods should adapted to the varied initial transcripts，thereby，the accurate target RNA products may be obtained. Recently，as the exploration of enzymatic synthesis continues，many novel transcription and processing strategies have been developed. In this review，the mechanisms，characteristics and problems of the transcription models and processing methods in enzymatic synthesis were summarized，aiming at providing the

for further study and selective utilization of enzymatic synthesis of RNA.

RNA；enzymatic synthesis；linear transcription；rolling circle transcription；site-specific cleavage

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.008

2015-05-19

國家自然科學(xué)基金項目（31201327，31301420）

王靜，女，博士，研究方向：核酸化學(xué)與生物技術(shù)；E-mail：wodejia_sun@126.com

梁興國，男，博士，研究方向：核酸化學(xué)與生物技術(shù)；E-mail：liangxg@ouc.edu.cn