徐崢，段俊麗，錢夢騄，程茜

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掃描探針顯微技術(shù)測量血管內(nèi)皮細胞的彈性

徐崢1，段俊麗2，錢夢騄1，程茜1

(1. 同濟大學物理科學與工程學院，上海200092； 2. 上海交通大學附屬醫(yī)學院新華醫(yī)院老年科，上海 200092 )

血管內(nèi)皮細胞的功能與許多疾病間存在關(guān)聯(lián)，但現(xiàn)在對其功能好壞的定量描述仍十分少見。該文以內(nèi)皮細胞的彈性作為衡量其功能的一個標準。通過理論建立壓痕測量楊氏模量的計算方法，并利用掃描探針顯微鏡從實驗上得到了正常及過氧化氫處理過的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的楊氏模量。發(fā)現(xiàn)過氧化氫處理后細胞的楊氏模量升高，表明通過楊氏模量來表征細胞活性是可行的。

內(nèi)皮細胞；掃描探針顯微鏡；楊氏模量；活性

0 引言

血管內(nèi)皮細胞是鋪在血管內(nèi)壁的細胞，它位于血液和血管組織基底膜之間，厚度在微米數(shù)量級。在血管中，內(nèi)皮細胞主動傳輸小分子、大分子和激素，并在調(diào)節(jié)血壓、凝血、血管新生里起到至關(guān)重要的作用[1]。G. Favero 等研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能紊亂與心血管疾病及糖尿病有著緊密的聯(lián)系[2]。也有研究表明內(nèi)皮細胞功能異常會導致動脈粥樣硬化[3]、出血性疾病、免疫功能紊亂、移植排斥，甚至造成死胎等[1]。內(nèi)皮細胞的研究對預防和治療這些疾病起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)在，越來越多的研究從生理和病理上研究其功能并建立了一系列的離體模型，已有研究者研究了內(nèi)皮細胞功能對血管舒張性，凝血、新生、淋巴細胞黏附、遷移，以及血管信號和傳輸通路等的影響。然而，從細胞出發(fā)，以內(nèi)皮細胞的力學特性來對其定量描述的研究仍十分少見。

近年來隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米生物力學和納米生物醫(yī)學是迅速興起的生物醫(yī)學研究前沿。在細胞尺度上開展生理和病理學的研究，可以更深刻地揭示疾病的起因，為相關(guān)嚴重疾病的診療和康復提供更有效的途徑[4-5]。掃描探針顯微鏡如今正迅速發(fā)展為新型的表面結(jié)構(gòu)成像的有力工具，相對電子顯微鏡技術(shù)，掃描探針顯微技術(shù)不但可對絕緣體和導體進行成像，更可以對浸潤在液體(如生理鹽水)中的樣品進行成像，使生物樣品在掃描中仍可維持生命?，F(xiàn)在，掃描探針顯微鏡已被廣泛用以得到生物體材料的形貌及表面彈性[6-8]。

當用針尖產(chǎn)生納米壓痕時，掃描探針顯微鏡可逐點測量微小區(qū)域、彈性較小且表面彈性不均勻材料的力曲線。樣品由于探針微壓痕產(chǎn)生壓縮，通過分析施加力與位移間的關(guān)系，可以得到樣品的楊氏模量，其橫向分辨率僅幾個納米。如今，掃描探針顯微鏡已經(jīng)用來測量細菌[6]、關(guān)節(jié)軟骨[7]、骨組織[8]的彈性，也用來測量單個分子間的結(jié)合力[9]。

本文推導了探針表面施加力、探針縱向位移與細胞楊氏模量間的關(guān)系。測量了正常內(nèi)皮細胞及使用過氧化氫處理過的內(nèi)皮細胞的表面彈性模量。并分析了誤差的來源。

1 理論基礎與實驗方法

1.1 理論計算方法

對于針尖與試樣間的相互作用，其等效楊氏模量可以表示為

式中：和分別是材料的楊氏模量和泊松比，下標代表是探針壓頭，代表試樣。這樣由實驗測得的減去來確定探針壓頭的。如果已知探針材料的彈性參數(shù)，也可通過比較理論與實驗測定的來驗證相應的赫茲模型理論。

假設樣品在探針壓痕處平整且與界面間無摩擦力，則其正應力符合赫茲接觸模型，其邊界條件可寫為

在方程(2)中,

正位移u(0，0) 即壓痕深度可表示為[10]

(4)

如果假設壓痕深度與接觸半徑之間的關(guān)系為[11]

則可以得到力與等效楊氏模量間的關(guān)系:

(6)

1.2 實驗方法

試樣為人臍靜脈內(nèi)皮細胞，掃描方式為接觸模式。掃描探針顯微鏡工作示意圖如圖1所示。通過下壓或抬針過程，可得到下針位移以及由光探測器得到探針偏轉(zhuǎn)量的關(guān)系。其中偏轉(zhuǎn)量為探針受力的反饋，將兩者轉(zhuǎn)換為壓痕深度與探針受力的關(guān)系即為力曲線。隨后代入公式(6)，計算可得到等效楊氏模量。

2 結(jié)果與討論

探針彈性由原子力顯微鏡的熱調(diào)諧功能測得為0.14 N/m。假設探針針頭半徑為10 nm，細胞楊氏模量為0.47。得到曲線如圖2所示。圖2中，橫軸為軸位移，縱軸為偏轉(zhuǎn)量。虛線為進針曲線，實線為退針曲線。在非接觸區(qū)域，隨著軸位置的增加，偏移量幾乎不變，表明探針沒有受到力的作用。隨后探針接觸到細胞，受到細胞的彈性力作用，探針產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)。在退針時，在接觸區(qū)域，退針與進針曲線幾乎重合。當探針退出與試樣接觸區(qū)域時，由于粘滯力的存在，使探針產(chǎn)生負向偏移，隨后才進入非接觸區(qū)。

如果將接觸區(qū)與非接觸區(qū)的交界取為新的零點，則可將橫軸轉(zhuǎn)變?yōu)閴汉凵疃?，同時縱軸反應的是受力后的偏轉(zhuǎn)量，與相乘即為探針受力。由這兩個參數(shù)通過公式(6)可得到等效楊氏模量。

2.1 正常內(nèi)皮細胞的楊氏模量

正常內(nèi)皮細胞楊氏模量如圖3所示。其中橫軸代表單個細胞同一部位不同深度上的采樣點，縱軸代表楊氏模量，不同顏色代表不同細胞不同部位。由于細胞各點處高度不同，而有效數(shù)據(jù)在探針接觸到細胞后產(chǎn)生，因此采樣點長度略不同。從圖3中發(fā)現(xiàn)，在剛進入細胞時，采樣點計算得到的楊氏模量較大，這主要是因為在壓痕深度較小時，近場引力及靜電力對探針的影響。另一方面也可能是由于在計算中較小時絕對誤差較大造成的。因此在實際計算時，我們忽略剛進入細胞段的數(shù)據(jù)，只取相對穩(wěn)定區(qū)域的楊氏模量作計算。

對平穩(wěn)區(qū)域的數(shù)值進行平均，得到正常內(nèi)皮細胞的楊氏模量為(0.84±0.14)×105Pa。

2.2 過氧化氫處理后細胞的楊氏模量

由于過氧化氫生成的自由基，與生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、生物膜上不飽和脂肪酸等發(fā)生反應，導致大分子變性、脂質(zhì)過氧化、生物膜損傷等[12]。高濃度>300 μmol/L的過氧化氫會迅速導致細胞不可逆損傷甚至死亡，低濃度過氧化氫能通過激活細胞內(nèi)各種信號傳導機制，造成對細胞的損傷，但其機制比較復雜[13]。

分別用100 μmol/L和200 μmol/L過氧化氫對內(nèi)皮細胞進行處理。得到楊氏模量分布如圖4和5所示。對用100 μmol/L和200 μmol/L過氧化氫處理過的內(nèi)皮細胞，計算得到其楊氏模量分別為(5.47±1.02)×105Pa和(4.02±0.75)×105Pa。與未處理過的內(nèi)皮細胞相比，其楊氏模量增加約5倍。因此，處理過的細胞更硬且不易形變。這可能是由于該濃度的過氧化氫可使細胞功能損傷。內(nèi)皮細胞楊氏模量的增加可能與內(nèi)皮細胞的功能障礙有關(guān)，內(nèi)皮細胞變硬可能是細胞衰老的一個標志，而楊氏模量可能成為簡單的內(nèi)皮細胞功能評價指標。

從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)實驗及計算過程中存在誤差，誤差可能來源于以下幾個方面：

(1) 細胞培養(yǎng)在蓋玻片上，當探針下壓細胞時，壓痕深度與細胞本身的高度大致相當，此時細胞下方的蓋玻片相當于剛性界面，使得在相同載荷力的作用下，探針的壓痕深度變淺，因此會影響到楊氏模量的計算，更嚴格的計算將在以后的工作中進行探討。

(2) 細胞是非常柔軟的物質(zhì)，細胞壓痕主要是細胞膜和細胞骨架彈性的反映。因此，過氧化氫對內(nèi)皮細胞的影響很可能是由于過氧化氫使得細胞骨架構(gòu)型發(fā)生改變。而力曲線也依賴于測量細胞的部位，比如當壓痕在細胞核及細胞核仁上進行時，反映的楊氏模量應當偏大，而對細胞骨架進行測量時，其值相對較小。因此，需要在先得到細胞形貌的情況下才能使每次測量的細胞位置相同，但是在液相下得到細胞形貌現(xiàn)在仍然是難題，這將在以后的課題中進行研究。

(3) 在計算中，我們假設探針針尖的半徑為10 nm。而實際情況下，該半徑為標稱值，與實際探針半徑大小存在偏差，這樣的偏差將導致計算得到的楊氏模量與實際細胞的楊氏模量有所差別。

(4) 實際細胞的泊松比很難測量。一般細胞的泊松比在0.45~0.49之間。統(tǒng)一假設其值為0.47，實際泊松比可能與假設存在差別。當然，對于同種細胞，我們認為其泊松比的變化量不會太大。

3 結(jié)論

本文通過實驗及計算得到了人臍靜脈內(nèi)皮細胞的楊氏模量，發(fā)現(xiàn)用過氧化氫處理的內(nèi)皮細胞其彈性要高于未經(jīng)處理的，并分析了誤差的來源。為將細胞彈性作為評價細胞功能的手段提供了依據(jù)。

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Elasticity measurement of endothelial cells by scanning probe microscopy

XU Zheng1, DUAN Jun-Li2, QIAN Meng-Lu1, CHENG Qian1

(1. School of Physics Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092,China;2. Department of Gerontology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092,China)

It is known that the function of endothelial cells is associated with the presence of many diseases. However, so far the quantitativedescriptions of their function have been seldom investigated. In this paper, the function of endothelial cells is evaluated by the elastic modulus. The theoretical calculation for detecting their Young’s modulus based on indentation theory is established. The Young’s moduli of the normal endothelial cells and the endothelial cells after hydrogen peroxide treatment are investigated by the scanning probe microscopy. It is found that after hydrogen peroxide treatmentthe Young’s modulus of the endothelial cells will be increased. Thus, it is proved that the activity of the cell can be characterized by its elasticity. Finally, errors in the measurement are discussed.

endothelial cells; scanning probe microscope; Young’s modulus; activity

Q2-33

A

1000-3630(2016)-03-0239-04

10.16300/j.cnki.1000-3630.2016.03.011

2016-01-10;

2016-03-10

國家自然科學基金資助項目(11404245,11174223, 11374231)

徐崢(1984－), 男, 江蘇蘇州人, 博士, 研究方向為生物醫(yī)學超聲。

程茜, E-mail: q.cheng@#edu.cn