馬曉麗 冀瑞萍

（晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，晉中 030600）

一氧化氮對干旱脅迫下白菜幼苗微管蛋白的影響

馬曉麗 冀瑞萍

（晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，晉中 030600）

旨在探討一氧化氮對干旱脅迫后白菜葉片微管蛋白的影響，以津育11白菜種子為實(shí)驗(yàn)材料，分別采用15、18、21、24和27 g/mL 5種不同濃度的PEG6000溶液對7日齡白菜幼苗進(jìn)行模擬干旱處理，通過紫外分光光度計(jì)和SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳研究不同處理組白菜幼苗葉片微管蛋白含量的差異，確定PEG6000最佳處理濃度為27 g/mL。50、100和150 μmol/L 3個不同濃度的一氧化氮對PEG6000處理組進(jìn)行熏蒸，觀察不同處理組白菜幼苗葉片微管蛋白含量的變化差異。結(jié)果顯示，與對照組相比不同濃度PEG6000對白菜幼苗葉片微管蛋白含量都呈增加的趨勢，經(jīng)一氧化氮處理后降低；且在干旱脅迫的過程中白菜體內(nèi)編碼一氧化氮的基因表達(dá)量和一氧化氮含量都有大幅上調(diào)。因此，生理濃度的一氧化氮對干旱引起的微管蛋白的解聚有一定的緩解作用，減少脅迫對植株造成的損害。

白菜；一氧化氮；干旱；微管蛋白

一氧化氮（NO）作為內(nèi)源性氣體信號分子［1］在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育［2-9］和脅迫響應(yīng)［10-17］等方面起著重要的作用。干旱是世界最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球由于水分脅迫導(dǎo)致的作物減產(chǎn)，可以超過其他因素造成減產(chǎn)的總和［18］。而我國國土總面積的52.5%是干旱和半干旱地區(qū)［19］，嚴(yán)重阻礙了農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境的改善［20，21］。

細(xì)胞骨架作為細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展中較晚發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞器，參與動植物的各種生長發(fā)育和生理活動［22］，而真核生物細(xì)胞骨架的重要成分有微管、微絲和中間纖絲，其中微管主要由微管蛋白α、β亞基聚合形成直徑為25 nm的中空管狀結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生和維持、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂等過程［23，24］。干旱脅迫雖一直是植物研究熱點(diǎn)，但是對于NO對干旱脅迫下白菜幼苗細(xì)胞骨架的影響還未見報(bào)道。

本研究以白菜幼苗為材料，研究聚乙二醇6000（PEG6000）模擬干旱處理和一氧化氮后續(xù)處理幼苗葉片中微管蛋白的含量的變化，以期探討微管蛋白在PEG6000模擬干旱和PEG6000模擬干旱-一氧化氮復(fù)合處理后在植物中的功能，從而為研究NO氣體信號分子對調(diào)控植物生長發(fā)育的作用和增強(qiáng)植物抗逆影響等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

津育11號白菜（Brassica rapa pekinensis）由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 選取籽粒飽滿大小均勻的白菜種子用次氯酸鈉消毒3-5次，并用無菌水漂洗數(shù)次后，培養(yǎng)于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，30粒/盤，每組3次重復(fù)，溫度（22±1）℃，相對濕度65%，光照強(qiáng)度180 μE/（m2·s），光周期為16/8 h（晝/夜），7 d后開始對白菜幼苗進(jìn)行處理。設(shè)對照（CK）、PEG處理、PEG+NO處理、PEG+PTIO處理共4組。

1.2.2 PEG6000處理 PEG處理參考張儀章［25］的方法，7日齡白菜幼苗，吸去培養(yǎng)皿中水分，分別加入15 mL不同質(zhì)量濃度（15、18、21、24和27 g/mL）的PEG6000處理12 h。

1.2.3 一氧化氮處理 NO供體硝普鈉（sodium nitrop russide，SNP）購買自Sigma公司。經(jīng)27 g/mL PEG6000干旱脅迫的白菜幼苗，分別再用濃度為50、100和150 μmol/L的NO密閉熏蒸處理24 h。

1.2.4 白菜幼苗葉片微管蛋白提取 稱取白菜幼苗葉片0.1 g（除去葉柄和葉脈），放入已加入1 mL微管蛋白提取緩沖液的預(yù)冷的研缽中，置于冰盒上研磨，用超高速離心機(jī)（Micro Ultracentrifuge GXⅡHitachi）離心（53 600×g，4℃，20 min），離心后取上清液［26］。

1.2.5 測定白菜幼苗葉片的微管蛋白含量 參照李合生［27］方法，取上清液樣品提取液20 μL，加蒸餾水780 μL，CBB 200 μL，總體積共1 mL，混勻后在595 nm下比色測定吸光值，并通過查實(shí)驗(yàn)室中已得的標(biāo)準(zhǔn)曲線［標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=0.0019x+0.352，y為測出值，x為蛋白含量（μg）］計(jì)算得出蛋白質(zhì)的含量。提取液樣品中微管蛋白含量的計(jì)算公式如下：

其中，C：實(shí)驗(yàn)室查到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)值（μg）；VT：加入的提取液的總體積（μL）；VS：分光光度計(jì)測定時的加樣量（mL）；WF：樣品鮮重量（g）。

1.2.6 SDS-PAGE凝膠電泳 用SDS-PAGE凝膠電泳，采用3%的濃縮膠和10%的分離膠，厚度為0.75 mm。上樣前按體積比1∶1加入20 μL的提取液和20 μL的2×上樣緩沖液，然后放入沸水中熱處理3 min。點(diǎn)樣20 μL，80 V電壓下電泳30 min，接著換成130 V電壓，電泳60 min。

1.2.7 NO含量的測定 NO濃度的測定用硝酸還原酶法，按照NO濃度測試盒說明書進(jìn)行測定，按上述公式計(jì)算NO濃度。

1.2.8 白菜NOS基因相對表達(dá)量的測定 取不同處理組白菜幼苗葉片各0.05 g，提取RNA。BraNOS引物為F（5'-GCTCGTAGACTGCCTCTTC-3'）和R（5'-GACGCTTGCCACGCGAGATAC-3'）；內(nèi)參基因18S rRNA為F（5'-CCTGCATACCGCAGCTAGGA-3'）和R（5'-GCGGCAATACGAATGCCCC-3'），由TaKa-Ra公司合成。采用2-△△CT方法對實(shí)時熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)的相對定量分析計(jì)算。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)使用STATISTICA（Stat Soft Inc，Tulsa，OK）軟件進(jìn)行分析，多重比較用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果

2.1 干旱脅迫對白菜幼苗葉片微管蛋白含量的影響

對照組和經(jīng)不同濃度PEG6000（15、18、21、24和27 g/mL）處理后微管蛋白含量變化（圖1）顯示，與對照組相比，PEG6000在5個濃度處理后的白菜幼苗微管蛋白含量都表現(xiàn)為增加的趨勢，且PEG6000濃度越高，微管蛋白含量增加越明顯，增加百分比分別為28.87%、34.51%、36.62%、44.37%和51.39%。因此選定27 g/mL作為干旱脅迫最佳處理濃度。

已有研究可知，純化的微管蛋白主要由α亞基和β亞基以1∶1的二聚體形式存在，分子量大小是110 kD。經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖2）顯示，出現(xiàn)分子量大約為53 kD的條帶，而55 kD是微管蛋白單體分子量，推測可能是由于非共價鍵遭到破壞使所提取的白菜幼苗葉片微管蛋白發(fā)生解聚，因此該電泳圖譜顯示的是微管蛋白的單體分子量。此外，從圖2可看出對照組和各處理組的電泳條帶大小基本相同，說明經(jīng)干旱脅迫后的白菜幼苗葉片的微管蛋白都發(fā)生降解，且根據(jù)條帶的粗細(xì)不同可知干旱脅迫濃度越高降解程度越大，與PEG濃度對白菜微管蛋白含量影響（圖1）得到的結(jié)果一致。

圖1 不同濃度PEG對白菜微管蛋白含量的影響

圖2 不同濃度PEG對白菜微管蛋白影響的SDS-PEG凝膠電泳圖

2.2 外源NO對干旱脅迫下白菜幼苗葉片微管蛋白含量的影響

不同濃度的NO對對照組幼苗葉片中的微管含量的影響（圖3）表明，沒有明顯差異。而經(jīng)過干旱脅迫后的白菜幼苗再經(jīng)50、100和150 μmol/L 3個濃度的NO處理后，白菜幼苗葉片的微管蛋白含量分別有不同程度的下降。濃度為50 μmol/L時的作用并不明顯，推測濃度偏低，對植物的影響較小。隨著處理濃度的提高，微管蛋白含量發(fā)生較大的變化，濃度為150 μmol/L時能最大程度的降低脅迫后引起的微管蛋白含量的升高。說明在生理濃度范圍內(nèi)較高濃度NO在一定程度上對PEG6000模擬干旱脅迫處理的白菜幼苗葉片微管蛋白的解聚有一定的緩解作用。

圖3 外源NO對干旱脅迫下白菜幼苗微管蛋白含量的影響

圖4 不同處理組對微管蛋白含量的影響

2.3 不同處理組白菜幼苗葉片微管蛋白含量的變化

為進(jìn)一步研究NO在白菜抵御干旱脅迫中的作用，用150 μmol/L的NO供體SNP和NO合成抑制劑PITO對白菜幼苗進(jìn)行預(yù)處理，觀察微管蛋白的含量變化。與對照組CK相比（圖4），PEG處理組微管蛋白含量大幅增加，脅迫后的幼苗再經(jīng)NO處理后發(fā)現(xiàn)能在一定程度上降低微管蛋白的含量，這種降低又能被NO清除劑PITO抑制，表現(xiàn)出該組微管蛋白的含量低于干旱脅迫組卻高于PEG+NO組，且差異顯著。

2.4 干旱脅迫后白菜幼苗葉片NO合成相關(guān)基因的表達(dá)量及內(nèi)源NO含量的變化

為了進(jìn)一步探究外源NO對干旱脅迫后微管蛋白含量發(fā)生變化的原因，對白菜葉片中編碼一氧化氮酶的基因和幼苗體內(nèi)內(nèi)源含量進(jìn)行了測定。BraNOS是白菜體內(nèi)產(chǎn)生一氧化氮酶的主要編碼基因，白菜幼苗在經(jīng)干旱脅迫后該基因的表達(dá)水平相對于未經(jīng)處理的對照組都顯著上調(diào)且在處理12 h后達(dá)到最高。同時葉片內(nèi)源NO含量也顯著升高（圖5），即在受到干旱脅迫后白菜幼苗體內(nèi)NO含量顯著升高，說明NO可能參與到白菜響應(yīng)干旱脅迫的抗逆調(diào)節(jié)過程中。

圖5 干旱脅迫對白菜幼苗一氧化氮合酶基因表達(dá)量（A）和內(nèi)源一氧化氮含量（B）的影響

3 討論

植物微管的研究與動物微管相比較而言相對落后，其主要原因是從植物細(xì)胞中提取微管蛋白相對較困難。Morejohn等［28］首次在體外成功聚合在玉米、煙草、胡蘿卜和玫瑰懸浮細(xì)胞中分離純化得到的微管蛋白。目前我們已知微管骨架主要由微管蛋白和微管結(jié)合蛋白組成，并且通過其亞單位不斷延伸和縮短發(fā)生踏車現(xiàn)象，從而改變它的存在狀態(tài)。高素娟等［29］研究發(fā)現(xiàn)，光是其中一種調(diào)控微管組織的影響因素，且在受到化學(xué)試劑及環(huán)境脅迫時，體內(nèi)胞質(zhì)微管會迅速組裝或解聚。程娜娜等［30］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擬南芥葉片受到增強(qiáng)UV-B輻射累積到一定程度時，體內(nèi)微管蛋白單體含量顯著升高。時蘭春［31］的研究表明，當(dāng)膨壓下降時，微管會彎曲、解聚甚至出現(xiàn)熒光斑點(diǎn)，微絲在質(zhì)壁分離部位解聚，而在不發(fā)生質(zhì)壁分離的部位其排布模式則發(fā)生改變；當(dāng)膨壓上升時，微絲解聚，但是微管隨原生質(zhì)體膨脹而被拉伸，不僅無解聚現(xiàn)象甚至可以觀察到新微管合成。

本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度PEG6000處理7日齡的白菜幼苗，采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定所提取的白菜幼苗葉片的微管蛋白。經(jīng)5種不同PEG6000濃度下模擬干旱處理后，白菜幼苗葉片微管蛋白含量都呈現(xiàn)增加的趨勢，推測由于PEG6000模擬干旱處理后，幼苗葉片中的微管發(fā)生了解聚，使體系中的微管蛋白的單體含量增加，而微管解聚可能是白菜幼苗在PEG6000模擬干旱處理下形成的自我保護(hù)功能，這與郭愛華［26］研究的小麥微管蛋白和程娜娜［30］研究擬南芥微管蛋白的結(jié)果一致。脅迫后再經(jīng)3個濃度的NO復(fù)合處理時，隨著NO濃度的增加，白菜幼苗葉片微管蛋白單體含量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，可能是生理濃度范圍內(nèi)較高濃度處理下，白菜幼苗葉片微管發(fā)生聚合，從而使測得的體系中微管蛋白單體含量降低。在干旱脅迫過程中植物為了應(yīng)對干旱所造成的傷害，產(chǎn)生NO的相關(guān)基因表達(dá)量顯著提高，同時體內(nèi)NO含量也隨之顯著升高，而在沒有干旱脅迫的對照組中編碼NO的相關(guān)基因的相對表達(dá)量并沒有發(fā)生顯著變化。所以，NO可能參與到了白菜幼苗應(yīng)對干旱脅迫的過程，并只在受到脅迫時才發(fā)生變化。綜上所述，NO處理提高了植物的抗干旱能力，參與到了植物抗逆生理過程中。在PEG6000模擬干旱和NO熏蒸處理后，白菜幼苗葉片微管蛋白含量的增減，取決于PEG6000的濃度、NO的濃度和植物對PEG6000和NO的敏感程度差異。至于NO以何種機(jī)制影響干旱脅迫下白菜幼苗葉片微管蛋白的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

干旱脅迫下白菜幼苗生長受到抑制，白菜幼苗葉片中的微管蛋白發(fā)生解聚致使單體含量增加。經(jīng)干旱脅迫后的白菜幼苗接著給予外源NO的處理，可以顯著緩解干旱脅迫對白菜幼苗生長的抑制。與PEG組相比，PEG+NO處理組白菜幼苗葉片微管蛋白單體含量減少且差異顯著，PEG+PITO組則幾乎恢復(fù)到PEG組水平。在PEG干旱脅迫期間，白菜幼苗葉片內(nèi)產(chǎn)生NO的主要基因BraNOS大量表達(dá)，與在此期間NO含量急劇升高的結(jié)果一致。說明在脅迫條件下，可以通過提高白菜幼苗體內(nèi)NO含量來降低脅迫后微管蛋白的傷害程度，從而緩解干旱脅迫對白菜幼苗生長的抑制作用。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Influence of Exogenous Nitric Oxide on Microtubulin of Brassica pekinensis Under Drought Stress

MA Xiao-li JI Rui-ping
（College of Life Sciences，Jinzhong University，Jinzhong 030600）

In order to study the effect of nitric oxide（NO）on microtubulin in drought-stressed Brassica pekinensis， using B. pekinensis cultivar Jinyu-11 as experimental material， and the drought situation was simulated by treating 7-day seedlings with 15， 18， 21， 24， 27 g/mL of PEG6000 concentrations. Ultraviolet spectrophotometry and SDS-PAGE were used to investigate the differences of microtubulin content in cabbage seedling leaves， and the optimal treatment concentration of PEG6000 was determined to be 27 g/mL. Then the pretreated seedlings were fumigated with various concentrations of NO：50， 100， and 150 μmol/L respectively， and the variations of microtubulin content in the treated cabbages were observed. Results showed that the contents of microtubulin in cabbage seedling leaves demonstrated the trend of increasing with PEG6000 pre-treatments compared to control， but decreased after NO treatment. Moreover， both the content of endogenous NO and the expression of NO-related genes increased significantly under drought stress. Therefore， physiological concentration of NO alleviated the disaggregation of microtubulin caused from drought stress at certain level， which eliminated the damages to plants from the stress.

Brassica pekinensis；nitric oxide；drought stress；microtubulin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.023

2015-09-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30870137），山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新基金項(xiàng)目（20101129）

馬曉麗，女，博士研究生，副教授，研究方向：植物細(xì)胞學(xué)；E-mail：mxl425@126.com