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        γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶補(bǔ)料法合成L-茶氨酸工藝研究

        2016-10-13 06:22:09傅嘉懿陳晟吳敬
        生物技術(shù)通報(bào) 2016年2期
        關(guān)鍵詞:研究

        傅嘉懿陳晟吳敬

        (1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214122)

        γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶補(bǔ)料法合成L-茶氨酸工藝研究

        傅嘉懿1陳晟2吳敬1

        (1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214122)

        對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶法制備L-茶氨酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)恒速補(bǔ)料的策略,以200 mmol/L L-谷氨酰胺和2 mol/L乙胺鹽酸鹽作為初始底物,37℃、pH10.0條件下反應(yīng),每2 h補(bǔ)加100 mmol L-谷氨酰胺,反應(yīng)14 h,最終L-谷氨酰胺底物總濃度為900 mmol/L,L-茶氨酸的生成量達(dá)到573.2 mmol/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到63.7%,生產(chǎn)強(qiáng)度為40.9 mmol/(h·L)。采用變速流加的工藝,以同樣的初始條件進(jìn)行反應(yīng),每2 h補(bǔ)加L-谷氨酰胺至初始濃度200 mmol/L,反應(yīng)15 h,最終L-谷氨酰胺總濃度為600 mmol/L,L-茶氨酸的生成量達(dá)到445.8 mmol/L,轉(zhuǎn)化率為74.3%,生產(chǎn)強(qiáng)度為29.7 mmol/(h·L)。

        γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶;L-茶氨酸;恒速補(bǔ)料;變速補(bǔ)料

        L-茶氨酸(L-Theanine,L-The)由日本科學(xué)家于1949年首次從綠茶中分離得到[1],是茶葉中特有的游離氨基酸,是天然茶葉中的重要風(fēng)味物質(zhì),具有抑制苦味物質(zhì)、改善產(chǎn)品風(fēng)味的作用。同時(shí)L-The還有鎮(zhèn)靜放松[2,3]、降低血壓[4,5]、控制體重[6]、增強(qiáng)免疫應(yīng)答[7,8]、預(yù)防腫瘤[9,10,11]等功效,因此在食品添加劑和保健品中被廣泛應(yīng)用。L-The自然界含量極少,從茶葉中提取成本很高,因此化學(xué)合成法是目前研究的主要方向。但是化學(xué)合成法存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、收率低等缺點(diǎn),同時(shí)由于需要采用高壓惰性氣體保護(hù),因而生產(chǎn)成本居高不下。近年來(lái),微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法已成為研究的熱點(diǎn)。

        γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-Glutamyltranspeptidase,GGT,EC 2.3.2.2)是谷胱甘肽代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,2002年Suzuki等[12]研究報(bào)道,Escherichia coli K-12來(lái)源的GGT酶可以將L-谷氨酰胺(L-Gln)上的γ-谷氨?;D(zhuǎn)移到乙胺受體上,催化合成L-The。由于這一過(guò)程位點(diǎn)特異性和光學(xué)選擇性強(qiáng),無(wú)需對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù),反應(yīng)過(guò)程中也不消耗ATP,因此利用GGT酶轉(zhuǎn)肽活性制備系列γ-谷氨酰基類(lèi)化合物的研究成為生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

        在實(shí)驗(yàn)室前期工作中已對(duì)GGT酶制備茶氨酸進(jìn)行了初步研究,在L-Gln濃度為200 mmol/L時(shí),L-The的摩爾轉(zhuǎn)化率為78%,同時(shí)發(fā)現(xiàn)L-The的摩爾轉(zhuǎn)化率隨L-Gln濃度的升高而降低,在底物濃度為500 mmol/L和1 000 mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化率分別為58%和45%,產(chǎn)物濃度分別為290.2 mmol/L和450 mmol/L[12],目前對(duì)高底物濃度條件合成L-The的研究尚無(wú)報(bào)道。在工業(yè)化生產(chǎn)中,較高的底物濃度可大大降低L-The的生產(chǎn)成本,因此本研究采用不同的補(bǔ)料策略,以期提高L-The在高濃度底物下的產(chǎn)量,為L(zhǎng)-The的酶法工業(yè)化制備奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        菌種為實(shí)驗(yàn)室保存,L-Gln(上海生工生物工程股份有限公司),乙胺鹽酸鹽(上海生工生物工程股份有限公司),L-The標(biāo)品(Sigma公司),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 方法

        1.2.1 粗酶液制備 菌種活化后按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,25℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h,裝液量為250 mL發(fā)酵瓶裝50 mL。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液以8 000 r/min離心20 min,收集上清液。

        1.2.2 GGT酶活測(cè)定方法 以γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺和雙甘二肽為底物進(jìn)行顏色反應(yīng)[13]。酶活測(cè)定體系為1 mL,含終濃度為5 mmol/L γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺,80 mmol/L 雙甘二肽,50 mmol/L 硼砂-NaOH緩沖液,pH10.0,在37℃下加入20 μL適當(dāng)稀釋的酶液反應(yīng)5 min后,加入4 mol/L醋酸溶液400 μL終止反應(yīng),在分光光度計(jì)410 nm處測(cè)定吸光值。該條件下每分鐘生成1 μmol對(duì)硝基苯胺所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

        1.2.3 酶法合成L-The 取一定濃度的L-Gln和乙胺鹽酸鹽用硼砂-NaOH緩沖液溶于500 mL燒杯中,加入一定量酶液,調(diào)節(jié)pH為10.0,體系終體積為300 mL,放置于37℃恒溫水浴鍋,以150 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行酶反應(yīng),定時(shí)取樣進(jìn)行分析。

        1.2.4 L-The的檢測(cè) 以高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)分析產(chǎn)物濃度[14]。

        1.2.4.1 樣品處理 反應(yīng)液取樣后用10%(W/V)的三氯乙酸等體積稀釋?zhuān)覝胤胖?-2 h,12 000 r/min離心10 min,再用0.22 μm水相針式濾器過(guò)濾,此時(shí)樣品可于HPLC檢測(cè)。

        1.2.4.2 流動(dòng)相配置 A相(1 L):無(wú)水醋酸鈉4.52 g,加入1 L去離子水,攪拌溶解,再加入225 μL三乙胺,醋酸調(diào)節(jié)pH到7.2±0.05,后加入5 mL四氫呋喃,混合后備用。

        B相(1 L):無(wú)水醋酸鈉4.52 g,去離子水定容為200 mL,醋酸調(diào)節(jié)pH到7.2±0.05,再加400 mL甲醇(色譜純)和400 mL乙腈(色譜純)。

        A,B 相配置完畢后需用無(wú)油真空泵過(guò)膜抽濾,其中A 相使用0.22 μm 的纖維素膜,B 相使用0.45 μm尼龍膜,并將抽濾后的流動(dòng)性與超聲清洗器中超聲15-30 min 排除氣泡。

        1.2.4.3 衍生化試劑及程序 柱前衍生化反應(yīng)采用鄰苯二甲醛(OPA)與2-巰基乙醇聯(lián)用,緩沖液為0.4 mol/L的硼酸緩沖液(pH10.2),具體試劑配方和柱前衍生化程序由Agilent公司提供。

        1.2.4.4 HPLC色譜條件 檢測(cè)系統(tǒng):Agilent 120;色譜柱:Eclipse XDB-C18 5 μm(4.6 mm×150 mm);流動(dòng)相:乙腈一水(75∶25);流速:0.8 mL/min;柱溫:40℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):338 nm。

        梯度洗脫程序:流動(dòng)相完全由A、B 兩相組成,初始比例為A∶B = 92∶8(V/V),一個(gè)樣品分離時(shí)間為20 min,流動(dòng)相混合比例呈勻速線性變化,具體條件為:0-12 min,B 相為8%-26%(V/V);12-14 min,B 相為26%-100%(V/V);14-15.5 min,B相保持100%(V/V);15.5-18.5 min,B 相為8%-100%(V/V);18.5-20 min,B 相保持8%(V/V)。

        1.2.5 L-The產(chǎn)率的計(jì)算 L-The摩爾轉(zhuǎn)化率公式:

        2 結(jié)果

        2.1 酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-The補(bǔ)料初始條件的確定

        前期研究表明,采用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-The時(shí),底物濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致L-The轉(zhuǎn)化率下降,其原因主要是因?yàn)楦邼舛鹊牡孜風(fēng)-Gln對(duì)GGT酶具有抑制作用,因此考慮使用較低的初始底物濃度,反應(yīng)過(guò)程中補(bǔ)加L-Gln的補(bǔ)料策略以實(shí)現(xiàn)L-The的高濃度底物高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)。為確定補(bǔ)料過(guò)程的初始條件,首先研究了不同底物濃度和不同加酶量對(duì)L-The合成的影響。根據(jù)前期工作的結(jié)果,GGT酶催化合成L-The在底物濃度較低的條件下反應(yīng)速度較快,且轉(zhuǎn)化率較高[13],因此選擇研究L-Gln濃度為200 mmol/L和100 mmol/L 條件下,研究不同加酶量對(duì)反應(yīng)的影響。

        首先以200 mmol/L L-Gln和2 mmol/L乙胺鹽酸鹽為底物,研究加酶量為2、6和10 U/mL時(shí),對(duì)L-The合成的影響。結(jié)果(圖1)顯示,在加酶量為2 U/mL時(shí),酶轉(zhuǎn)化在前3 h反應(yīng)較快,后2 h反應(yīng)逐漸趨于平衡;而在加酶量為6 U/mL 和10 U/mL時(shí),酶轉(zhuǎn)化在前2 h反應(yīng)較快,后3 h反應(yīng)逐漸平衡。在反應(yīng)進(jìn)行至2 h時(shí),L-The對(duì)底物L(fēng)-Gln的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為29.5%、54.4%和58.9%,反應(yīng)5 h轉(zhuǎn)化率分別為62.4%、69.3%和77.1%。以100 mmol/L L-Gln和1 mol/L乙胺鹽酸鹽為底物,研究加酶量為2、4和6 U/mL時(shí)對(duì)L-The合成的影響。結(jié)果(圖2)顯示,當(dāng)加酶量分別為2、4和6 U/mL,反應(yīng)進(jìn)行至2 h時(shí),L-The對(duì)L-Gln的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為44.2%、60.2%和80.9%,最終轉(zhuǎn)化率分別為80.4%、92.5%和93.6%。

        圖1 L-Gln初始濃度為200 mmol/L的過(guò)程曲線

        圖2 L-Gln初始濃度為100 mmol/L的過(guò)程曲線

        綜上所述,在不同底物濃度的條件下,加酶量為2 U/mL時(shí),酶反應(yīng)在前3 h速率較快,加酶量為6 U/mL和10 U/mL時(shí),酶反應(yīng)都在前2 h速率較快,2 h后反應(yīng)速率降低,因此初步確定以2 h作為后續(xù)補(bǔ)料過(guò)程的補(bǔ)料間隔。圖1和圖2顯示,底物L(fēng)-Gln濃度為200 mmol/L,加酶量6 U/mL與10 U/mL相差7.8%,但是比2 U/mL有明顯提高,所以加酶量6 U/mL是最優(yōu)條件,此條件下反應(yīng)2 h產(chǎn)物濃度達(dá)到120 mmol/L左右。而在L-Gln濃度為100 mmol/L時(shí),反應(yīng)2 h產(chǎn)物濃度最高僅能達(dá)到80 mmol/L,由于工業(yè)生產(chǎn)追求的是高產(chǎn)量,也就是較高的產(chǎn)物濃度,所以選擇底物濃度200 mmol/L,加酶量6 U/mL作為后續(xù)補(bǔ)料過(guò)程的初始條件。

        2.2 酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-The恒速補(bǔ)料策略研究

        以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺鹽酸鹽為初始底物,加酶量為6 U/mL,在pH 10.0和37℃條件下,研究不同的補(bǔ)料量對(duì)L-The合成的影響。由于將底物維持在較低濃度能保持較高的反應(yīng)速率,所以選擇每2 h進(jìn)行恒速補(bǔ)料,L-Gln補(bǔ)料量分別為200、150和100 mmol。

        首先以每2 h添加200 mmol L-Gln固體粉末的補(bǔ)料方式,研究對(duì)L-The合成的影響。由于合成L-The的反應(yīng)要求L-Gln與乙胺鹽酸鹽的摩爾比在1∶5-1∶10范圍內(nèi),因此在反應(yīng)過(guò)程中每4 h補(bǔ)加400 mmol乙胺固體以保證乙胺鹽酸鹽的濃度。結(jié)果(圖3)顯示,底物L(fēng)-Gln在反應(yīng)前4 h消耗較大,每2 h濃度下降120 mmol/L左右,隨著反應(yīng)進(jìn)行,L-Gln消耗速率逐漸降低,反應(yīng)至4-6 h時(shí),L-Gln消耗速率為89.5 mmol/L,6-8 h為80.4 mmol/L,分析原因是由于隨著酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行,反應(yīng)液L-Gln和L-The濃度都逐漸上升,正逆反應(yīng)速度逐漸達(dá)到平衡,致使反應(yīng)速率進(jìn)一步下降。8-11 h和11-14 h底物濃度下降僅為37.6 mmol/L和22.5 mmo/L。反應(yīng)至14 h最終L-Gln的總濃度為1 000 mmol/L,L-The的濃度達(dá)到562 mmol/L,轉(zhuǎn)化率為56.2%。

        圖3 每2 h補(bǔ)料200 mmol的恒速補(bǔ)料過(guò)程曲線

        以每2 h添加150 mmol L-Gln固體粉末,每4 h補(bǔ)加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體的補(bǔ)料方式,研究對(duì)L-The生產(chǎn)的影響。結(jié)果(圖4)顯示,L-Gln在反應(yīng)前6 h消耗較快,每2 h消耗量為120 mmol/L左右,6 h后L-Gln消耗速率降低,6-8 h底物消耗量為97.6 mmol/L,8-10 h底物消耗量為56.4 mmol/L,10 h后反應(yīng)速率大幅下降,反應(yīng)在14 h左右時(shí)達(dá)到平衡。最終L-Gln的總濃度為950 mmol/L,L-The的濃度達(dá)到573 mmol/L,轉(zhuǎn)化率為63.7%。

        圖4 每2 h補(bǔ)料150 mmol的恒速補(bǔ)料過(guò)程曲線

        研究以每2 h添加100 mmol L-Gln固體粉末,每4 h補(bǔ)加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體的補(bǔ)料方式對(duì)酶轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果(圖5)顯示,L-Gln在反應(yīng)前8 h消耗很快,每2 h消耗量為120 mmol/L左右,8 h后L-Gln消耗略有降低,8-10 h L-Gln消耗量為80.3 mmol/L,10-12 h為54.8 mmol/L,12 h后反應(yīng)速率下降,L-Gln幾乎不消耗。而L-The在前12 h的合成速率都較大,12 h后速率下降,約在16 h達(dá)到平衡。最終L-Gln的總濃度為900 mmol/L,L-The的濃度達(dá)到610.1 mmol/L,轉(zhuǎn)化率為67.8%。

        2.3 酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-The變速補(bǔ)料策略研究

        根據(jù)上述的結(jié)果,在恒速補(bǔ)料的情況下,反應(yīng)初期底物濃度較低,所以反應(yīng)速率較快,而反應(yīng)后期由于底物的累積導(dǎo)致反應(yīng)變慢,逐漸達(dá)到平衡。因此嘗試采用變速補(bǔ)料的工藝,以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺鹽酸鹽為初始底物,加酶量為6 U/mL,在pH10.0和37℃條件下,每2 h測(cè)定L-Gln的含量,從而確定補(bǔ)加L-Gln的量,保證補(bǔ)料后L-Gln濃度為200 mmol/L,同時(shí)每4 h添加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體,研究變速補(bǔ)料對(duì)L-The合成的影響。結(jié)果(圖6)顯示,每2 h所需補(bǔ)加的L-Gln量在反應(yīng)前期較多,隨著反應(yīng)進(jìn)行,反應(yīng)速率降低,補(bǔ)加的底物逐漸減少,反應(yīng)進(jìn)行到18 h后,反應(yīng)液中底物濃度幾乎不變,可以認(rèn)為反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡,所以不再進(jìn)行補(bǔ)料。最終L-Gln總濃度為600 mmol/L,L-The濃度最終達(dá)到445.8 mmol/L,轉(zhuǎn)化率為74.3%。

        圖5 每2 h補(bǔ)料100 mmol的恒速補(bǔ)料過(guò)程曲線

        圖6 變速補(bǔ)料過(guò)程L-Gln和L-The濃度曲線

        2.4 不同補(bǔ)料工藝的研究

        通過(guò)對(duì)恒速補(bǔ)料和變速補(bǔ)料工藝的比較發(fā)現(xiàn),不同的轉(zhuǎn)化工藝所需的反應(yīng)周期不同,產(chǎn)生的L-The的濃度也不同。表1顯示,從轉(zhuǎn)化率角度,變速補(bǔ)料工藝的轉(zhuǎn)化率最高,達(dá)74.3%,但所達(dá)到的底物濃度僅為600 mmol/L,導(dǎo)致生產(chǎn)強(qiáng)度較低,為29.7 mmol/(h·L),遠(yuǎn)低于恒速補(bǔ)料的生產(chǎn)強(qiáng)度。而比較不同的恒速補(bǔ)料策略,生產(chǎn)強(qiáng)度差異較小,轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物終濃度都以100 mmol/2 h恒速補(bǔ)料工藝最高,達(dá)67.8%和610.1 mmol/L,基本滿足了L-The在高底物濃度條件下能達(dá)到高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)物濃度的要求。因此,以100 mmol/2 h恒速補(bǔ)料進(jìn)行茶氨酸的生產(chǎn)最能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求。

        3 討論

        L-The作為一種具有重要價(jià)值的非蛋白氨基酸,已經(jīng)成為研究茶葉中功能活性成分的熱點(diǎn)。目前L-The的合成主要以化學(xué)合成法為主,但是化學(xué)合成得到的產(chǎn)物存在一定的安全性問(wèn)題,同時(shí)容易產(chǎn)生DL-型消旋體,因此近年來(lái)以酶法合成L-The逐漸被廣泛研究。

        2002年,來(lái)自日本的Suzuki等[15]利用GGT酶,以200 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺為底物合成L-The,轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60%,產(chǎn)物濃度為120 mmol/L。Shuai等[16]以20 mmol/L的L-Gln和0.05 mol/L的乙胺為底物,L-The的轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%,產(chǎn)物濃度為18.8 mmol/L。孫帥[17]以200 mmol/L的L-Gln和1.8 mol/L乙胺合成L-The,反應(yīng)36 h轉(zhuǎn)化率達(dá)到86%,產(chǎn)物濃度達(dá)到172 mmol/L。李勤等[18]將來(lái)源于E. coli DH5α的GGT酶基因克隆到高表達(dá)質(zhì)粒pET-32α中,并轉(zhuǎn)化E. coli BL21,構(gòu)建茶氨酸生物合成的工程菌,直接以工程菌為催化劑,以L-Gln和乙胺鹽酸鹽為底物,在一定條件下反應(yīng)6 h,L-The轉(zhuǎn)化率為41.05%。

        利用其它酶轉(zhuǎn)化L-The的研究也有報(bào)道。1998年,Tachiki等[19]利用谷氨酰胺酶,以500 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺為底物,L-The的轉(zhuǎn)化率為47%,產(chǎn)物濃度為235 mmol/L。2005年,Yamamoto等[20]報(bào)道了以200 mmol/L的L-谷氨酸鈉和1.2 mol/L的乙胺為底物,L-The的轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%,濃度為170 mmol/L的產(chǎn)物。2008年,Tachiki等[21]以300 mmol/L的L-Gln和0.9 mol/L的乙胺為底物,獲得L-The的轉(zhuǎn)化率為55%,濃度為165mmol/L的產(chǎn)物。Yokoyama和Itoh[22,23]分別報(bào)道了一種在介孔硅材料上固定化谷氨酰胺酶,再由其催化合成L-The的方法。2008年,Yamamoto等[24]利用γ-谷氨酰甲胺合成酶,以600 mmol/L的L-谷氨酸鈉和0.6 mol/L的乙胺為底物,L-The的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到100%,產(chǎn)物濃度達(dá)到600 mmol/L。

        表1 不同補(bǔ)料工藝的比較

        傳統(tǒng)的酶轉(zhuǎn)化過(guò)程中,在底物濃度較低的情況下,L-Gln消耗速率較快,L-The合成速度快;而在高底物濃度下,L-Gln消耗減慢,產(chǎn)物合成速率較慢。因此本實(shí)驗(yàn)研究了不同的補(bǔ)料方法,并通過(guò)比較得出以200 mmol/L的L-Gln和2 mol/L的乙胺鹽酸鹽為初始底物,加酶量6 U/mL,每2 h補(bǔ)加100 mmol L-Gln,反應(yīng)16 h為最優(yōu)工藝。在最優(yōu)條件下L-The的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到67.8%,產(chǎn)物濃度達(dá)到610.1 mmol/L,生產(chǎn)強(qiáng)度為38.1 mmol/(h·L)。

        4 結(jié)論

        通過(guò)采用恒速補(bǔ)料和變速補(bǔ)料的策略,在L-Gln濃度為900 mmol/L和600 mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到67.8%和74.3%,生產(chǎn)強(qiáng)度分別為38.1 mmol/(h·L)和29.7 mmol/(h·L)。本研究通過(guò)補(bǔ)料工藝進(jìn)行L-The的合成,即使在高底物濃度下,仍能獲得令人滿意的底物轉(zhuǎn)化率,且步驟簡(jiǎn)單,成本低廉,具有較好的應(yīng)用前景。

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        (責(zé)任編輯 馬鑫)

        A Research of L-theanine Synthesis with Two Feeding Methods of L-glutamine Using γ-glutamyltranspeptidase

        FU Jia-yi1CHEN Sheng2WU Jing1
        (1. State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122;2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122)

        The optimization of L-theanine production by γ-GGT(gamma-glutamyltranspeptidase)was investigated. The constant speed feeding strategy was performed using 200 mmol/L L-glutamine and 2 mol/L ethylamine hydrochloride as the initial substrates,under the condition of 37℃,pH10.0,100 mmol/L L-glutamine was added every 2 hours and the reaction sustained for 14 hours. Eventually the total concentration of L-glutamine and L-theanine were 900 mmol/L and 573.2 mmol/L respectively. The conversion rate of L-theanine reached 63.7%,and the production intensity was 40.9 mmol/(h·L). The variable speed feeding process conducted for 15 hours with the same initial conditions,and the adding L-glutamine to the initial concentration of 200 mmol/L in every 2 hours. After 15 hours,600 mmol/L of L-glutamine was converted to L-theanine with a final concentration of 445.8 mmol/L and the conversion rate and production intensity reached 74.3% and 29.7 mmol/(h·L).

        γ-glutamyltranspeptidase;L-theanine;constant speed feeding;constant speed feeding

        10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.022

        2015-03-12

        傅嘉懿,女,碩士研究生,研究方向:工業(yè)酶技術(shù);E-mail:rorjil@hotmail.com

        吳敬,女,博士,教授,研究方向:基因工程和分子酶學(xué)工程;E-mail:jingwu@jiangnan.edu.cn

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