傅嘉懿陳晟吳敬

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶補(bǔ)料法合成L-茶氨酸工藝研究

傅嘉懿1陳晟2吳敬1

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶法制備L-茶氨酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)恒速補(bǔ)料的策略，以200 mmol/L L-谷氨酰胺和2 mol/L乙胺鹽酸鹽作為初始底物，37℃、pH10.0條件下反應(yīng)，每2 h補(bǔ)加100 mmol L-谷氨酰胺，反應(yīng)14 h，最終L-谷氨酰胺底物總濃度為900 mmol/L，L-茶氨酸的生成量達(dá)到573.2 mmol/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到63.7%，生產(chǎn)強(qiáng)度為40.9 mmol/（h·L）。采用變速流加的工藝，以同樣的初始條件進(jìn)行反應(yīng)，每2 h補(bǔ)加L-谷氨酰胺至初始濃度200 mmol/L，反應(yīng)15 h，最終L-谷氨酰胺總濃度為600 mmol/L，L-茶氨酸的生成量達(dá)到445.8 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為74.3%，生產(chǎn)強(qiáng)度為29.7 mmol/（h·L）。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；L-茶氨酸；恒速補(bǔ)料；變速補(bǔ)料

L-茶氨酸（L-Theanine，L-The）由日本科學(xué)家于1949年首次從綠茶中分離得到［1］，是茶葉中特有的游離氨基酸，是天然茶葉中的重要風(fēng)味物質(zhì)，具有抑制苦味物質(zhì)、改善產(chǎn)品風(fēng)味的作用。同時(shí)L-The還有鎮(zhèn)靜放松［2，3］、降低血壓［4，5］、控制體重［6］、增強(qiáng)免疫應(yīng)答［7，8］、預(yù)防腫瘤［9，10，11］等功效，因此在食品添加劑和保健品中被廣泛應(yīng)用。L-The自然界含量極少，從茶葉中提取成本很高，因此化學(xué)合成法是目前研究的主要方向。但是化學(xué)合成法存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、收率低等缺點(diǎn)，同時(shí)由于需要采用高壓惰性氣體保護(hù)，因而生產(chǎn)成本居高不下。近年來(lái)，微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法已成為研究的熱點(diǎn)。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）是谷胱甘肽代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，2002年Suzuki等［12］研究報(bào)道，Escherichia coli K-12來(lái)源的GGT酶可以將L-谷氨酰胺（L-Gln）上的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移到乙胺受體上，催化合成L-The。由于這一過(guò)程位點(diǎn)特異性和光學(xué)選擇性強(qiáng)，無(wú)需對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)，反應(yīng)過(guò)程中也不消耗ATP，因此利用GGT酶轉(zhuǎn)肽活性制備系列γ-谷氨酰基類(lèi)化合物的研究成為生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

在實(shí)驗(yàn)室前期工作中已對(duì)GGT酶制備茶氨酸進(jìn)行了初步研究，在L-Gln濃度為200 mmol/L時(shí)，L-The的摩爾轉(zhuǎn)化率為78%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)L-The的摩爾轉(zhuǎn)化率隨L-Gln濃度的升高而降低，在底物濃度為500 mmol/L和1 000 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率分別為58%和45%，產(chǎn)物濃度分別為290.2 mmol/L和450 mmol/L［12］，目前對(duì)高底物濃度條件合成L-The的研究尚無(wú)報(bào)道。在工業(yè)化生產(chǎn)中，較高的底物濃度可大大降低L-The的生產(chǎn)成本，因此本研究采用不同的補(bǔ)料策略，以期提高L-The在高濃度底物下的產(chǎn)量，為L(zhǎng)-The的酶法工業(yè)化制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為實(shí)驗(yàn)室保存，L-Gln（上海生工生物工程股份有限公司），乙胺鹽酸鹽（上海生工生物工程股份有限公司），L-The標(biāo)品（Sigma公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制備 菌種活化后按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h，裝液量為250 mL發(fā)酵瓶裝50 mL。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液以8 000 r/min離心20 min，收集上清液。

1.2.2 GGT酶活測(cè)定方法 以γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺和雙甘二肽為底物進(jìn)行顏色反應(yīng)［13］。酶活測(cè)定體系為1 mL，含終濃度為5 mmol/L γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺，80 mmol/L 雙甘二肽，50 mmol/L 硼砂-NaOH緩沖液，pH10.0，在37℃下加入20 μL適當(dāng)稀釋的酶液反應(yīng)5 min后，加入4 mol/L醋酸溶液400 μL終止反應(yīng)，在分光光度計(jì)410 nm處測(cè)定吸光值。該條件下每分鐘生成1 μmol對(duì)硝基苯胺所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.3 酶法合成L-The 取一定濃度的L-Gln和乙胺鹽酸鹽用硼砂-NaOH緩沖液溶于500 mL燒杯中，加入一定量酶液，調(diào)節(jié)pH為10.0，體系終體積為300 mL，放置于37℃恒溫水浴鍋，以150 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行酶反應(yīng)，定時(shí)取樣進(jìn)行分析。

1.2.4 L-The的檢測(cè) 以高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)分析產(chǎn)物濃度［14］。

1.2.4.1 樣品處理 反應(yīng)液取樣后用10%（W/V）的三氯乙酸等體積稀釋?zhuān)覝胤胖?-2 h，12 000 r/min離心10 min，再用0.22 μm水相針式濾器過(guò)濾，此時(shí)樣品可于HPLC檢測(cè)。

1.2.4.2 流動(dòng)相配置 A相（1 L）：無(wú)水醋酸鈉4.52 g，加入1 L去離子水，攪拌溶解，再加入225 μL三乙胺，醋酸調(diào)節(jié)pH到7.2±0.05，后加入5 mL四氫呋喃，混合后備用。

B相（1 L）：無(wú)水醋酸鈉4.52 g，去離子水定容為200 mL，醋酸調(diào)節(jié)pH到7.2±0.05，再加400 mL甲醇（色譜純）和400 mL乙腈（色譜純）。

A，B 相配置完畢后需用無(wú)油真空泵過(guò)膜抽濾，其中A 相使用0.22 μm 的纖維素膜，B 相使用0.45 μm尼龍膜，并將抽濾后的流動(dòng)性與超聲清洗器中超聲15-30 min 排除氣泡。

1.2.4.3 衍生化試劑及程序 柱前衍生化反應(yīng)采用鄰苯二甲醛（OPA）與2-巰基乙醇聯(lián)用，緩沖液為0.4 mol/L的硼酸緩沖液（pH10.2），具體試劑配方和柱前衍生化程序由Agilent公司提供。

1.2.4.4 HPLC色譜條件 檢測(cè)系統(tǒng)：Agilent 120；色譜柱：Eclipse XDB-C18 5 μm（4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相：乙腈一水（75∶25）；流速：0.8 mL/min；柱溫：40℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm。

梯度洗脫程序：流動(dòng)相完全由A、B 兩相組成，初始比例為A∶B = 92∶8（V/V），一個(gè)樣品分離時(shí)間為20 min，流動(dòng)相混合比例呈勻速線性變化，具體條件為：0-12 min，B 相為8%-26%（V/V）；12-14 min，B 相為26%-100%（V/V）；14-15.5 min，B相保持100%（V/V）；15.5-18.5 min，B 相為8%-100%（V/V）；18.5-20 min，B 相保持8%（V/V）。

1.2.5 L-The產(chǎn)率的計(jì)算 L-The摩爾轉(zhuǎn)化率公式：

2 結(jié)果

2.1 酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-The補(bǔ)料初始條件的確定

前期研究表明，采用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-The時(shí)，底物濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致L-The轉(zhuǎn)化率下降，其原因主要是因?yàn)楦邼舛鹊牡孜風(fēng)-Gln對(duì)GGT酶具有抑制作用，因此考慮使用較低的初始底物濃度，反應(yīng)過(guò)程中補(bǔ)加L-Gln的補(bǔ)料策略以實(shí)現(xiàn)L-The的高濃度底物高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)。為確定補(bǔ)料過(guò)程的初始條件，首先研究了不同底物濃度和不同加酶量對(duì)L-The合成的影響。根據(jù)前期工作的結(jié)果，GGT酶催化合成L-The在底物濃度較低的條件下反應(yīng)速度較快，且轉(zhuǎn)化率較高［13］，因此選擇研究L-Gln濃度為200 mmol/L和100 mmol/L 條件下，研究不同加酶量對(duì)反應(yīng)的影響。

首先以200 mmol/L L-Gln和2 mmol/L乙胺鹽酸鹽為底物，研究加酶量為2、6和10 U/mL時(shí)，對(duì)L-The合成的影響。結(jié)果（圖1）顯示，在加酶量為2 U/mL時(shí)，酶轉(zhuǎn)化在前3 h反應(yīng)較快，后2 h反應(yīng)逐漸趨于平衡；而在加酶量為6 U/mL 和10 U/mL時(shí)，酶轉(zhuǎn)化在前2 h反應(yīng)較快，后3 h反應(yīng)逐漸平衡。在反應(yīng)進(jìn)行至2 h時(shí)，L-The對(duì)底物L(fēng)-Gln的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為29.5%、54.4%和58.9%，反應(yīng)5 h轉(zhuǎn)化率分別為62.4%、69.3%和77.1%。以100 mmol/L L-Gln和1 mol/L乙胺鹽酸鹽為底物，研究加酶量為2、4和6 U/mL時(shí)對(duì)L-The合成的影響。結(jié)果（圖2）顯示，當(dāng)加酶量分別為2、4和6 U/mL，反應(yīng)進(jìn)行至2 h時(shí)，L-The對(duì)L-Gln的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為44.2%、60.2%和80.9%，最終轉(zhuǎn)化率分別為80.4%、92.5%和93.6%。

圖1 L-Gln初始濃度為200 mmol/L的過(guò)程曲線

圖2 L-Gln初始濃度為100 mmol/L的過(guò)程曲線

綜上所述，在不同底物濃度的條件下，加酶量為2 U/mL時(shí)，酶反應(yīng)在前3 h速率較快，加酶量為6 U/mL和10 U/mL時(shí)，酶反應(yīng)都在前2 h速率較快，2 h后反應(yīng)速率降低，因此初步確定以2 h作為后續(xù)補(bǔ)料過(guò)程的補(bǔ)料間隔。圖1和圖2顯示，底物L(fēng)-Gln濃度為200 mmol/L，加酶量6 U/mL與10 U/mL相差7.8%，但是比2 U/mL有明顯提高，所以加酶量6 U/mL是最優(yōu)條件，此條件下反應(yīng)2 h產(chǎn)物濃度達(dá)到120 mmol/L左右。而在L-Gln濃度為100 mmol/L時(shí)，反應(yīng)2 h產(chǎn)物濃度最高僅能達(dá)到80 mmol/L，由于工業(yè)生產(chǎn)追求的是高產(chǎn)量，也就是較高的產(chǎn)物濃度，所以選擇底物濃度200 mmol/L，加酶量6 U/mL作為后續(xù)補(bǔ)料過(guò)程的初始條件。

2.2 酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-The恒速補(bǔ)料策略研究

以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺鹽酸鹽為初始底物，加酶量為6 U/mL，在pH 10.0和37℃條件下，研究不同的補(bǔ)料量對(duì)L-The合成的影響。由于將底物維持在較低濃度能保持較高的反應(yīng)速率，所以選擇每2 h進(jìn)行恒速補(bǔ)料，L-Gln補(bǔ)料量分別為200、150和100 mmol。

首先以每2 h添加200 mmol L-Gln固體粉末的補(bǔ)料方式，研究對(duì)L-The合成的影響。由于合成L-The的反應(yīng)要求L-Gln與乙胺鹽酸鹽的摩爾比在1∶5-1∶10范圍內(nèi)，因此在反應(yīng)過(guò)程中每4 h補(bǔ)加400 mmol乙胺固體以保證乙胺鹽酸鹽的濃度。結(jié)果（圖3）顯示，底物L(fēng)-Gln在反應(yīng)前4 h消耗較大，每2 h濃度下降120 mmol/L左右，隨著反應(yīng)進(jìn)行，L-Gln消耗速率逐漸降低，反應(yīng)至4-6 h時(shí)，L-Gln消耗速率為89.5 mmol/L，6-8 h為80.4 mmol/L，分析原因是由于隨著酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)液L-Gln和L-The濃度都逐漸上升，正逆反應(yīng)速度逐漸達(dá)到平衡，致使反應(yīng)速率進(jìn)一步下降。8-11 h和11-14 h底物濃度下降僅為37.6 mmol/L和22.5 mmo/L。反應(yīng)至14 h最終L-Gln的總濃度為1 000 mmol/L，L-The的濃度達(dá)到562 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為56.2%。

圖3 每2 h補(bǔ)料200 mmol的恒速補(bǔ)料過(guò)程曲線

以每2 h添加150 mmol L-Gln固體粉末，每4 h補(bǔ)加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體的補(bǔ)料方式，研究對(duì)L-The生產(chǎn)的影響。結(jié)果（圖4）顯示，L-Gln在反應(yīng)前6 h消耗較快，每2 h消耗量為120 mmol/L左右，6 h后L-Gln消耗速率降低，6-8 h底物消耗量為97.6 mmol/L，8-10 h底物消耗量為56.4 mmol/L，10 h后反應(yīng)速率大幅下降，反應(yīng)在14 h左右時(shí)達(dá)到平衡。最終L-Gln的總濃度為950 mmol/L，L-The的濃度達(dá)到573 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為63.7%。

圖4 每2 h補(bǔ)料150 mmol的恒速補(bǔ)料過(guò)程曲線

研究以每2 h添加100 mmol L-Gln固體粉末，每4 h補(bǔ)加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體的補(bǔ)料方式對(duì)酶轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果（圖5）顯示，L-Gln在反應(yīng)前8 h消耗很快，每2 h消耗量為120 mmol/L左右，8 h后L-Gln消耗略有降低，8-10 h L-Gln消耗量為80.3 mmol/L，10-12 h為54.8 mmol/L，12 h后反應(yīng)速率下降，L-Gln幾乎不消耗。而L-The在前12 h的合成速率都較大，12 h后速率下降，約在16 h達(dá)到平衡。最終L-Gln的總濃度為900 mmol/L，L-The的濃度達(dá)到610.1 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為67.8%。

2.3 酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-The變速補(bǔ)料策略研究

根據(jù)上述的結(jié)果，在恒速補(bǔ)料的情況下，反應(yīng)初期底物濃度較低，所以反應(yīng)速率較快，而反應(yīng)后期由于底物的累積導(dǎo)致反應(yīng)變慢，逐漸達(dá)到平衡。因此嘗試采用變速補(bǔ)料的工藝，以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺鹽酸鹽為初始底物，加酶量為6 U/mL，在pH10.0和37℃條件下，每2 h測(cè)定L-Gln的含量，從而確定補(bǔ)加L-Gln的量，保證補(bǔ)料后L-Gln濃度為200 mmol/L，同時(shí)每4 h添加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體，研究變速補(bǔ)料對(duì)L-The合成的影響。結(jié)果（圖6）顯示，每2 h所需補(bǔ)加的L-Gln量在反應(yīng)前期較多，隨著反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)速率降低，補(bǔ)加的底物逐漸減少，反應(yīng)進(jìn)行到18 h后，反應(yīng)液中底物濃度幾乎不變，可以認(rèn)為反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，所以不再進(jìn)行補(bǔ)料。最終L-Gln總濃度為600 mmol/L，L-The濃度最終達(dá)到445.8 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為74.3%。

圖5 每2 h補(bǔ)料100 mmol的恒速補(bǔ)料過(guò)程曲線

圖6 變速補(bǔ)料過(guò)程L-Gln和L-The濃度曲線

2.4 不同補(bǔ)料工藝的研究

通過(guò)對(duì)恒速補(bǔ)料和變速補(bǔ)料工藝的比較發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)化工藝所需的反應(yīng)周期不同，產(chǎn)生的L-The的濃度也不同。表1顯示，從轉(zhuǎn)化率角度，變速補(bǔ)料工藝的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)74.3%，但所達(dá)到的底物濃度僅為600 mmol/L，導(dǎo)致生產(chǎn)強(qiáng)度較低，為29.7 mmol/（h·L），遠(yuǎn)低于恒速補(bǔ)料的生產(chǎn)強(qiáng)度。而比較不同的恒速補(bǔ)料策略，生產(chǎn)強(qiáng)度差異較小，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物終濃度都以100 mmol/2 h恒速補(bǔ)料工藝最高，達(dá)67.8%和610.1 mmol/L，基本滿足了L-The在高底物濃度條件下能達(dá)到高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)物濃度的要求。因此，以100 mmol/2 h恒速補(bǔ)料進(jìn)行茶氨酸的生產(chǎn)最能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求。

3 討論

L-The作為一種具有重要價(jià)值的非蛋白氨基酸，已經(jīng)成為研究茶葉中功能活性成分的熱點(diǎn)。目前L-The的合成主要以化學(xué)合成法為主，但是化學(xué)合成得到的產(chǎn)物存在一定的安全性問(wèn)題，同時(shí)容易產(chǎn)生DL-型消旋體，因此近年來(lái)以酶法合成L-The逐漸被廣泛研究。

2002年，來(lái)自日本的Suzuki等［15］利用GGT酶，以200 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺為底物合成L-The，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60%，產(chǎn)物濃度為120 mmol/L。Shuai等［16］以20 mmol/L的L-Gln和0.05 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%，產(chǎn)物濃度為18.8 mmol/L。孫帥［17］以200 mmol/L的L-Gln和1.8 mol/L乙胺合成L-The，反應(yīng)36 h轉(zhuǎn)化率達(dá)到86%，產(chǎn)物濃度達(dá)到172 mmol/L。李勤等［18］將來(lái)源于E. coli DH5α的GGT酶基因克隆到高表達(dá)質(zhì)粒pET-32α中，并轉(zhuǎn)化E. coli BL21，構(gòu)建茶氨酸生物合成的工程菌，直接以工程菌為催化劑，以L-Gln和乙胺鹽酸鹽為底物，在一定條件下反應(yīng)6 h，L-The轉(zhuǎn)化率為41.05%。

利用其它酶轉(zhuǎn)化L-The的研究也有報(bào)道。1998年，Tachiki等［19］利用谷氨酰胺酶，以500 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉(zhuǎn)化率為47%，產(chǎn)物濃度為235 mmol/L。2005年，Yamamoto等［20］報(bào)道了以200 mmol/L的L-谷氨酸鈉和1.2 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%，濃度為170 mmol/L的產(chǎn)物。2008年，Tachiki等［21］以300 mmol/L的L-Gln和0.9 mol/L的乙胺為底物，獲得L-The的轉(zhuǎn)化率為55%，濃度為165mmol/L的產(chǎn)物。Yokoyama和Itoh［22，23］分別報(bào)道了一種在介孔硅材料上固定化谷氨酰胺酶，再由其催化合成L-The的方法。2008年，Yamamoto等［24］利用γ-谷氨酰甲胺合成酶，以600 mmol/L的L-谷氨酸鈉和0.6 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到100%，產(chǎn)物濃度達(dá)到600 mmol/L。

表1 不同補(bǔ)料工藝的比較

傳統(tǒng)的酶轉(zhuǎn)化過(guò)程中，在底物濃度較低的情況下，L-Gln消耗速率較快，L-The合成速度快；而在高底物濃度下，L-Gln消耗減慢，產(chǎn)物合成速率較慢。因此本實(shí)驗(yàn)研究了不同的補(bǔ)料方法，并通過(guò)比較得出以200 mmol/L的L-Gln和2 mol/L的乙胺鹽酸鹽為初始底物，加酶量6 U/mL，每2 h補(bǔ)加100 mmol L-Gln，反應(yīng)16 h為最優(yōu)工藝。在最優(yōu)條件下L-The的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到67.8%，產(chǎn)物濃度達(dá)到610.1 mmol/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為38.1 mmol/（h·L）。

4 結(jié)論

通過(guò)采用恒速補(bǔ)料和變速補(bǔ)料的策略，在L-Gln濃度為900 mmol/L和600 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到67.8%和74.3%，生產(chǎn)強(qiáng)度分別為38.1 mmol/（h·L）和29.7 mmol/（h·L）。本研究通過(guò)補(bǔ)料工藝進(jìn)行L-The的合成，即使在高底物濃度下，仍能獲得令人滿意的底物轉(zhuǎn)化率，且步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，具有較好的應(yīng)用前景。

［1］ Sakato Y. The chemical constituents of tea：III. A new amide theanine［J］. Nippon Nogeik Kaishi， 1949， 23：262-267.

［2］ Juneja LR， Chu DC， Okubo T， et al. L-theanine：a unique amino acid of green tea and its relaxation effect in humans［J］. Trends Food Sci Tech， 1999， 10（6-7）：199-204.

［3］ Kakuda T， Nozawa A， Unno T， et al. Inhibiting effects of theanine on caffeine stimulation evaluated by EEG in the rat［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 2000， 64（2）：287-293.

［4］ Yokogoshi H， Mochizuki M， Saitoh K. Theanine-induced reduction of brain serotonin concentration in rats［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 1998， 62（4）：816-817.

［5］ Yokogoshi H， Kato Y， Sagesaka YM， et al. Reduction effect of theanine on blood pressure and brain 5-hydroxyindoles in spontaneously hypertensive rats［J］. Biosci Biotechnol Biochem，1995， 59（4）：615-618.

［6］ Zheng G， Sayama K， Okubo T， et al. Anti-obesity effects of three major components of green tea， catechins， caffeine and theanine in mice［J］. In Vivo， 2004， 18（1）：55-62.

［7］ Kamath AB， Wang LS， Das H， et al. Antigens in tea-beverage prime human Vγ2Vδ2 T cells in vitro and in vivo for memory and nonmemory antibacterial cytokine responses［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100（10）：6009-6014.

［8］ Bukowski JF， Percival SS. L-theanine intervention enhances human γδ T lymphocyte function［J］. Nutr Rev， 2008， 66（2）：96-102.

［9］ Zhang G， Miura Y， Yagasaki K. Effects of dietary powdered green tea and theanine on tumor growth and endogenous hyperlipidemia in hepatomabearing rats［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 2002， 66（4）：711-716.

［10］ Sadzuka Y， Sugiyama T， Suzuki T， et al. Enhancement of the activity of doxorubicin by inhibition of glutamate transporter［J］. Toxicol Lett， 2001， 123（2-3）：159-167.

［11］ Sugiyama T， Sadzuka Y. Theanine and glutamate transporter inhibitors enhance the antitumor efficacy of chemotherapeutic agents［J］. Biochim Biophys Acta， 2003， 1653（2）：47-59.

［12］ Chen X， Su L， Wu D， Wu J. Application of recombinant Bacillus subtilis γ-glutamyltranspeptidase to the production of L-theanine［J］. Process Biochemistry， 2014， 49：1429-1439.

［13］ Orlowski M， Meister A. Gamma-glutamyl-p-Nitroanilide：a new convenient substrate for determination and study of L- and D-γglutamyltranspeptidase activities［J］. Biochem Biophy Acta，1963， 73（4）：679.

［14］ 陳星奕. Bacillus subtilis γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的表達(dá)及其在茶氨酸制備中的應(yīng)用［D］. 無(wú)錫：江南大學(xué)， 2014.

［15］ Suzuki H， Izuka S， Miyakawa N， Kumagai H. Enzymatic production of theanine， an “umami” component of tea， from glutamine and ethylamine with bacterial gamma-glutamyltranspeptidase［J］. Enzyme Microb Technol， 2002， 31（6）：884-889.

［16］ Shuai Y， Zhang T， Jiang B， Mu W. Development of efficient enzymatic production of theanine by gamma-glutamyltranspeptidase from a newly isolated strain of Bacillus subtilis SK11. 004［J］. J Sci Food Agric， 2010， 90（15）：2563-2567.

［17］ 孫帥. 谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶法合成L-茶氨酸的研究［D］. 南京：南京大學(xué)， 2013.

［18］ 李勤， 黃建安， 李娟， 等. 茶氨酸生物合成基因工程菌的構(gòu)建及重組酶的表達(dá)［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011， 37（3）：267-270.

［19］ Tachiki T， Yamada T， Mizuno K， et al. γ-Glutamyl transfer reactions by glutaminase from Pseudomonas nitroreducens IFO 12694 and their application for the syntheses of theanine and γ-glutamylmethylamide［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 1998，62（7）：1279-1283.

［20］ Yamamoto S， Wakayama M， Tachiki T. Theanine production by coupled fermentation with energy transfer employing Pseudomonas taetrolens Y-30 glutamine synthetase and Baker's yeast cells［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 2005， 69（4）：784-789.

［21］ Tachiki T， Okada Y， Ozeki M， et al. Process for producing theanine［P］. US Patent， US 7335497， 2008-02-26.

［22］ Yokoyama T， Ishii R， Itoh T， et al. Synthesis of l-theanine using euzyme/mesoporous silica conjugates under high pH conditions［J］. Materials Letters， 2011， 65（1）：67-69.

［23］ Itoh T， Hoshikawa Y， Matsuura S， et al. Production of L-theanine using glutaminase encapsulated in carbon-coated mesoporous silica with high pH stability［J］. Biochemical Engineering Journal，2012， 68：207-214.

［24］ Yamamoto S， Morihara Y， Wakayama M， Tachiki T. Theanine production by coupled fermentation with energy transfer using γ-glutamylmethylamide synthetase of Methylovorus mays No. 9［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 2008， 72（5）：1206-1211.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Research of L-theanine Synthesis with Two Feeding Methods of L-glutamine Using γ-glutamyltranspeptidase

FU Jia-yi1CHEN Sheng2WU Jing1
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

The optimization of L-theanine production by γ-GGT（gamma-glutamyltranspeptidase）was investigated. The constant speed feeding strategy was performed using 200 mmol/L L-glutamine and 2 mol/L ethylamine hydrochloride as the initial substrates，under the condition of 37℃，pH10.0，100 mmol/L L-glutamine was added every 2 hours and the reaction sustained for 14 hours. Eventually the total concentration of L-glutamine and L-theanine were 900 mmol/L and 573.2 mmol/L respectively. The conversion rate of L-theanine reached 63.7%，and the production intensity was 40.9 mmol/（h·L）. The variable speed feeding process conducted for 15 hours with the same initial conditions，and the adding L-glutamine to the initial concentration of 200 mmol/L in every 2 hours. After 15 hours，600 mmol/L of L-glutamine was converted to L-theanine with a final concentration of 445.8 mmol/L and the conversion rate and production intensity reached 74.3% and 29.7 mmol/（h·L）.

γ-glutamyltranspeptidase；L-theanine；constant speed feeding；constant speed feeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.022

2015-03-12

傅嘉懿，女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)酶技術(shù)；E-mail：rorjil@hotmail.com

吳敬，女，博士，教授，研究方向：基因工程和分子酶學(xué)工程；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn